Laboratorio di Analisi Cliniche, Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano

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1 ilnn. 1x1. Super. Sanità Vol. 21, V. 1 (1985),pp, VALUTAZIONE DI METODI PER LA DETERMINAZIONE DEL PIOMBO E DEL CADMIO NEL SANGUE M. Buratti Laboratorio di Analisi Cliniche, Istituti Clinici di Perfezionamento, Milano Riassunto. - Vengono considerati i criteri di scelta dei metodi analitici per la determinazione del piombo e del cadmio nel sangue. Vengono analizzati in dettaglio le tecniche analitiche più idonee all'applicazione nel laboratorio di routine. Summary (Method evaluation for blood lead and cadmium determination). - The criteria for choosing methods for blood lead and cadmium analysis are consider- ed. Analytical procedures suitable for routine use are proposed. L'analisi del piombo e del cadmio alle basse concentrazioni attese nei liquidi biologici 6 effettuata di routine per il monitoraggio biologico dei lavoratori professionalmente esposti a questi metalli. honostante ciò, appare evidente dai dati discordanti riportati in lettera- tura e dai numerosi confronti interlaboratoriali effettuati, una notevole man- canza di accuratezza (1). La scelta di un metodo analitico dovrebbe essere fatta dopo una attenta analisi del rapporto costi/benefici per lo scopo che ci si propone, tenendo conto di alcuni criteri guida: - sensibilità - accuratezza - precisione - possibil ita di analisi multielementare - tempo di analisi - investimento e costi di mantenimento Tralasciando alcune tecniche analitiche molto accurate ma con costi stru- mentali estrmamente elevati come l'analisi per attivazione neutronica (NAA), la fluorimetria a raggi X (XRF), la spettometria di massa e diluizione isotopica

2 (IDMS) in tutto il mondo per l'analisi routinaria di Pb e Cd nei liquidi biologici un posto preminente è occupato dai metodi in assorbimento atomico. Anche i metodi elettroanalitici, in particolare lo strippaggio anodico, dotati di ottima sensibilità, accuratezza e precisione, hanno una discreta diffusione. Recenti progressi nelle tecniche di spettrometria a plasma (ICP) con notevoli miglioramenti nei limiti di rilevabilità e precisione per una quarantina di elementi, fanno ipotizzare che grazie alla potenzialità di analisi multielementare, questi metodi potranno affiancare e anche sostituire la spettrofotometria ad assorbimento atomico (AAS). Al momento pera i costi sono ancora elevati e la sensibilità 6 confrontabile con AAS a fiamma, in generale 2-3 ordini di grandezza inferiore a quella raggiungibile con AAS e atomizzazione elettrotermica (ETA/AAS). Va comunque precisato che quasi tutti i procedimenti analitici godono di buona precisione a patto che l'analista li conosca bene. Analizziamo ora più nel dettaglio le possibilità analitiche più facilmente applicabili nel laboratorio di routine. Piombo La determinazione del piombo nel tecniche analitiche elencate di seguit :o. sangue pub essere effettuata con diverse Assorbimento Atomico: atomizzazione elettrotermica - diluizione con acqua, Triton X-100, acido nitrico, ammonio fosfato - deproteinizzazione con acido nitrico 1N - modificazione di matrice con aggiunta in fornetto di HN03, H2OZ, amonio fosfato, ammonio molibdato - passivazione del tubo di grafite con molibdeno o zirconio - flusso di ossigeno durante 1-'incenerimento - predigestione acida a caldo - estrazione con ammoniopirrol idinditiocarbammato (APDC)/metil isobutilchetone (MIBK) dal sangue tal quale - precipitazione proteica ed estrazione - piattaforma di L'vov Assorbimento atomico: Delves cups - essicazione del campione in crogiolo di nickel con, o senza, ossidazione della matrice Assorbimento Atomico: atomizzazione a fiamma - estrazione con APDC/MIBK dal sangue intero

3 - estrazione dopo digestione acida a caldo o precipitazione proteica - precipitazione proteica ed analisi del surnatante Strippaggio Anodico - Meta1 Analyzer: analisi diretta dopo diluizione del campione con Metexchange Assorbimento Atomico: atomizzazione elettrotermica Piccoli volumi di campione sono trasferiti dopo diluizione o opportuno pretrattamento in un tubo di grafite riscaldato elettricamente. I1 solvente o la soluzione acquosa sono allontanati per riscaldamento a bassa temperatura, la matrice organica viene distrutta a temperatura opportuna mentre il materiale residuo, contenente l'analita di interesse, viene atomizzato ad alta temperatura. La determinazione del piombo nel sangue intero senza modificazione di matrice presenta serie difficolta, legate principalmente all'elevato assorbimento molecolare e scatter che spesso producono assorbimenti aspecifici superiori a 0,5A, compensabili solo con sistemi di correzione ad effetto Zeeman, e all'accumulo di residui carboniosi dopo pochi campionamenti. La semplice diluizione del sangue con Triton X-100 facilita di molto l'analisi: il tensioattivo produce completa lisi degli elementi cellulari e riduce la tensione di interfaccia tra campione e grafite facilitando le fasi di essicazione ed incenerimento (2). L'introduzione durante l'incenerimento di ossigeno (o aria) permette l 'al lontanamento quasi completo della matrice organica, evitando l'accumulo di residui carboniosi. E' possibile, inoltre, in queste condizioni, incenerire a temperature relativamente elevate il campione (fino a 950 C) senza perdere piombo; in altre condizioni gia a C il Pb volatilizza. I1 segnale di assorbimento non atomico diventa trascurabile, circa 0,05A, facilmente compensabile dal correttore di fondo (3). Anche la deproteinizzazione con acido nitrico (4) da buoni risultati ed ha il vantaggio di permettere l'uso di standard acquosi per la calibrazione; critica però in questo caso la pulizia del materiale in cui vengono preparati i campioni. La modificazione di matrice con ammonio fosfato $.di frequente utilizzata per la determinazione di Pb e Cd nel sangue: in presenza di fosfati si possono, infatti, usare temperature di incenerimento più elevate senza perdite di Pb (5). Si può anche estrarre Pb dal sangue con APDC/MIBK e iniettare poi direttamente nel tubo di grafite aliquote della fase organica (6). In questo caso la taratura si fa estraendo Pb da soluzione acquosa. Non 6 necessario usare il correttore di fondo e non occorre modificare il ph fisiologico.

4 Molta attenzione va posta quando si utilizzano procedimenti di modifica- zione della matrice, per la preparazione della curva di taratura. Molti Autori hanno, infatti, riportato difficolta nell'effettuare la calibrazione (instabilita della linea di base) quando si usino standard di piombo in soluzione acida o acquosa. Tali problemi sono stati attribuiti ai tubi di grafite, le cui caratte- ristiche superficiali differiscono da produttore a produttore, rendendo diffici- le la trasposizione immediata di un procedimento analitico su strumentazioni diverse. Ancora, di recente, l'applicazione del metodo di diluizione con Triton X-100 per l'analisi del Pb nel sangue, da molti anni utilizzato in moltissimi laboratori senza particolari difficolta, sul1'hga 500/mod AAS Perkin Elmer, si è dimostrato difficoltoso, spingendo alcuni Autori a usare curve di taratura in sangue (7). Esperimenti recenti hanno dimostrato che il profilo del picco di assorbanza del piombo in soluzione acquosa differisce sensibilmente da quello del Pb in sangue diluito; tale diversita diventa apparente quando si usano spettrometri a circuiti digitali rapidi come il mod La calibrazione con standard acquosi è adatta a strumenti analogici che, a causa del tempo di risposta più lento, non evidenziano la differenza di comparsa nel tempo del picco del piombo in sangue o in acido, non è invece applicabile con gli spettro- metri a microprocessore. Un notevole progresso è probabilmente rappresentato dall'introduzione delle piattaforme di L'vov: gli assorbimenti aspecifici sono minimizzati e la curva di taratura è indipendente dalla matrice. Anche con questo accessorio è comunque necessario diluire il campione con ammonio fosfato e Triton X-100 (8); inoltre le piattaforme sono utilizzabil i, a causa del le loro specifiche operative, solo con strumenti predisposti. I1 piombo è stato anche estratto dal sangue direttamente con APDC/MIBK e ali- quote della fase organica sono po.i iniettate direttamente nell'atomizzatore. Con questo sistema vengono coestratti parecchi altri meta1 li (zinco, cadmio, nickel, rame, manganese) che possono poi essere determinati indipendentemente. Assorbimento Atomico: Delves cups Il campione viene essicato (e ossidato) in microcrogiolo di nickel su piastra riscaldante e inserito poi nella fiamma aria/acetilene. I1 campione viene vaporizzato e concentrato nel tubo di assorbimento posto sul cammino ottico della lampada. Questo procedimento va bene per elementi relativamente volatili come Pb, Cd, As. Per la determinazione del piombo nel sangue, accanto alla semplice essicazione del campione, sono state proposte varie modificazioni della fase di pre-

5 trattamento qual i l 'ossidazione parziale del la matrice con acqua ossigenata o con acido nitrico. La matrice ematica aumenta il segnale di Pb rispetto alla soluzione acquosa, 6 quindi indispensabile effettuare la calibrazione mediante addizioni standard a sangue a basso contenuto di piombo (9). Assorbimento Atomico: atomizzazione a fiamma Il campione dopo opportuno trattamento viene aspirato in una fiamma arialacetilene dove ha luogo l 'atomizzazione del l 'anal ita. La determinazione del piombo ematico, data la bassa sensibilita della fiamna, richiede un trattamento di concentrazione del Pb prima del1 'analisi. In genere si ricorre all'estrazione con APDC/MIBK. I1 solvente organico viene poi aspirato nella fiamna. E' necessario un volume di campione relativamente grande (2 ml), data la sensibilita non elevata della fiamma e il volume aspirato dal nebulizzatore (6). Strippaggio Anodico In questa tecnica l'analita viene preconcentrato su elettrodo nella forma di un deposito solido o amalgama. Quando si è raggiunta una concentrazione sufficiente, la corrente viene invertita e la quantith delle specie depositate è determinata mediante tecniche voltametriche appropriate. I1 metodo ha sensibil ita elevata e buona precisione anche a concentrazioni molto basse. E' pera necessaria molta cura per mantenere condizioni riproducibili (agitazione, tempo di elettrolisi, posizione del l 'agitatore, volume del la soluzione costante) e il tempo richiesto per ogni analisi P lungo. Con il Trace Analyzer ESA è possibile l'analisi diretta del piombo nel sangue senza pretrattamento del campione; si usa un diluente che provoca una rapida decomplessazione del Pb (9). Cadmi o La determinazione del cadmio nel sangue pub essere effettuata con diverse tecniche analitiche di seguito elencate. Assorbimento Atomico: atomizzazione elettrotermica - diluizione con acqua, Triton X-100, acido nitrico - modificazione di matrice mediante diluizione con ammonio fosfato e Triton X deproteinizzazione con HN03 1N - estrazione con APDC/MIBK - decomposizione con ossigeno a bassa temperatura

6 - ossidazione con acidi a caldo - introduzione di ossigeno durante l'incenerimento con modificazione di matrice mediante diluizione con ammonio fosfato Assorbimento Atomico: Delves cups - ossidazione a 425'C su piastra riscaldante - ossidazione con CF4/ossigeno - modificazione di matrice con amnonio fosfato - pretrattamento in muffola a 420 C Assorbimento Atomico: atmizzazione a fiamna - estrazione con APDC e ditizone in MIBK da sangue calcinato Strippagqio Anodico - la sensibilita (2,5 pg/l) non rende tale metodo applicabile al monitoraogio di soggetti con sola esposizione ambientale a cadmio Assorbimento Atomico: atomizzazione elettrotermica I1 problema più grosso che influenza accuratezza e precisione nel la determinazione del cadmio ematico sono le interferenze da assorbimenti molecolari e l'accumulo di residui carboniosi duratite la serie analitica. L'eliminazione di queste interferenze di solito richiede pretrattamenti chimici e termici. La volatilizzazione di 1-2 p1 di sangue in atomizzatore di grafite produce segnali di assorbimento molecolare e scatter dell'ordine di 1,5A. La correzione di assorbimenti aspecifici così elevati è possibile solo con sistemi di correzione basati sull'effetto Zeeman. Con i sistemi convenzionali P necessario ricorrere a qualche tipo di modificazione di matrice per ridurre i segnali molecolari a 0,2-0,3A. Le condizioni di incenerimento devono essere accuratamente controllate per evitare perdite di Cd che possono avvenire gih a C (10). L'aggiunta di ammonio fosfato permette temperature di incenerimento di o1 tre 500 C e atomizzazione a 2200DC (5). Anche la deproteinizzazione con acido nitrico è un eccellente pretrattamento per ETA/AAS (4). Un altro semplice trattamento ossidativo consiste nell'introduzione di un piccolo flusso di ossigeno o aria nell'atomizzatore durante la fase di incenerimento. Questo trattamento combinato con la modificazione di matrice con ammonio fosfato consente di incenerire il campione a 600 C senza perdite di cadmio ed evita ogni accumulo di carbone durante il lavoro di routine. I1 cadmio è stato anche estratto direttamente dal sangue con APDC/MIBK e aliquote della fase organica erano poi iniettate direttamente nell'atomizzatore (11).

7 Asiorbimento Atomico: Delves cups Il problema principale con questa tecnica è la distruzione della matrice organi- cd, per minimizzare gli assorbimenti molecolari senza perdere cadmio. L'incene- riiiiento a 425OC in crogioli di Ni su piastra scaldante richiede un accurato controllo della temperatura e del tempo di incenerimento (12). La modificazione di matrice con aggiunta di ammonio fosfato permette l'analisi diretta con aliquote di ul di sangue. I1 segnale atomico del cadmio dal relativamente poco solubile fosfato è completamente risolto nel tempo rispetto agli assorbiiiienti molecolari e non necessita quindi di correttore di fondo. Tuttavia, il iricitodo non e applicabile di routine, perché il fosfato intacca i crogioli e limita il loro uso a 4-5 determinazioni (13). E' stato proposto anche l'incenerimento a bassa temperatura con CF4 e ossigeno, ma questa miscela corrode i componenti in vetro del digestore (14). Si può usare anche l'incenerimento in muffola a 420 C, ma i tempi di analisi diventano molto lunghi e il pericolo di inquinamento è grave (15). Assorbimento Atomico: atomizzazione a.fiamma ILa concentrazione "fisiologica" del cadmio nel sangue è confrontabile con i limiti di rilevabilita della spettroscopia ad assorbimento atomico a fiamma e quindi l'analisi diretta non è possibile. L'estrazione con ditizone o APDC/MIBK del cadmio da soluzioni di sangue calcinato ha un limite di rilevabilita di 0,6 l anche con 10 m1 di sangue. AAS a fiamma non è dunque applicabile al dosaggio di Cd nel sangue di soggetti con esposizione ambientale o professionale a basse concentrazioni di Cd (16). Strippaggio Anodico Prima dell'analisi è necessario procedere ad ossidazione del campione utilizzando acido nitrico e perclorico o solforico; la sensibilita del metodo e confrontabile con quella dell'aas a fiamma. Criteri di scelta della tecnica strumentale Da quanto fin qui discusso appare evidente che la determipazione di Cd e Pb nel sangue di soggetti con esposizione ambientale e/o professionale a questi metalli, è possibile anche nel laboratorio di routine e non necessita di una strumentazione particolarmente sofisticata. Tra i fattori da valutare nella scelta di un procedimento analitico, accan-

8 to ad accuratezza, precisione e sensibilita, hanno importanza preminente: - il costo e versati1 ità della strumentazione - la complessità della fase preparativa del campione - la possibilità di analisi multielementare - la qualità del l'assistenza tecnica Un breve elenco dei pregi e dei difetti delle tecniche strumentali in precedenza discusse è riportato di seguito. Assorbimento atomico: atomizzazione elettrotermica analisi diretta con modificazione di matrice pregi: volume di campione ridotto (50 ~ 1 ) nessuna difficoltà di preparazione del campione difetti : indispensabile il correttore del fondo si possono analizzare una quindicina di cainpioni/ora con un tubo di grafite si fanno circa 50 determinazioni accumulo di residui carboniosi se non si usa ossigeno durante l'incenerimento è necessario fare la curva di taratura in sangue analisi diretta con piattaforma di L'vov pregi: si pub effettuare la curva di taratura in soluzione acquosa una piattaforma serve per almeno 400 campionamenti difetti: tempo di analisi lungo (circa 3 minuti/campione) utilizzabile solo con strumenti predisposti estrazione con APDC/MIBK pregi: difetti: volume di campione ridotto possibilità di analizzare più elementi nel lo stesso estratto (Cd, Ni, Zn, Cu) tempo di analisi breve (50 campioni/ora) non è necessario che la curva di taratura sia fatta con sangue arric- chito la preparazione del campione richiede all'analista qualche attenzione Assorbimento atomico: Delves cup pregi: Piombo tempo di analisi relativamente breve (30 campioni/ora)

9 liretti: è possibile preparare conteinporanearnente i~iolti ca:npioni volume di cainpione ridotto (10-29 pl) nessun pretrattamento chimico basso costo dei crogioli di Ni ; ogni crogiolo serve per 70 campioni 5 indispensabile il correttore del fondo i! ri::iiii?s td luna cert* dbil i th.~l l 'anìl ista la ::al ibrazime deve cjser.! Fatta con sangue arricchito A,;orbinietit'o.ito:nico: Del ves-q -- Cadmi o pregi: volume di cainpiow ridotto i~oaa sensibilita (0,33 pg/1) i f :?!irsicsari:) ;~r?ossidare la natrice controllando accuratamente le condizioni tempo di preparazione del campione lungo i (crogioli di Ni si corrodono rapidamente issorbimito 3to:iiico: atoinizzazione a fiamma aria/ac.-tilene Piombo pregi: tempo di analisi ridotti, (100 cainpioni/ora) noil occorre il correttore del fondo costo del la ~;trmeritaziorii-e ridotto difetti: volume di sangue relativamente elevato (2 ml) la preparazione del cdiri>ione richiede 3ll 'a131 ista qualche attenzione Strippaggio anodico -- Piombo pregi: volume ridotto di campione estrema semplici th di 3n~l i si tenpo di alial i,ji bwd? completa autoinazione del cizh aoalitic~ difetti : e1 evato LOS to del la singola deteminazi one analitica manutenzione specializzata Sara compito del l'anal ista, valutati tutti fdttori che possono guidarlo nella ;nel ta di iiii wtodi~, decidei-$2 qiiale prucedi;nento sia pi:i adatto alla sua pratica di laboratorio.

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