CAP.I LA CELLULA E LA MEMBRANA CELLULARE IN ECOTOSSICOLOGIA E TOSSICOLOGIA UMANA

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1 CAP.I LA CELLULA E LA MEMBRANA CELLULARE IN ECOTOSSICOLOGIA E TOSSICOLOGIA UMANA 1

2 Disclaimer: nello sviluppo del presente capitolo ci si è avvalsi, in parte, dei principi ottimamente sviluppati dalle Prof.sse Giuliana Fassina e Paola Dorigo nel loro testo di Farmacologia Generale adattati e modificati nel contesto del presente Corso di Ambiente e Salute per gli studenti della Laurea in Scienze Ambientali. 2

3 Premesse Un tossico xenobiotico, perché esplichi la sua azione sulla cellula, deve, prima di tutto passare una barriera fondamentale che é rappresentata dalla membrana cellulare. Non é, quindi inopportuna una revisione dei concetti relativi alla struttura della cellula e della membrana citoplasmatica, in particolare. Vi sono, indubbiamente anche azioni esterne alla membrana (azioni caustiche ecc.) ma, come concetto generale diremo che un tossico é tale quando riesce a passare la membrana cellulare ed agire, successivamente sul materiale endocellulare con inibizione di enzimi, alterazione di equilibri e/o, più drammaticamente, incidere sul bagaglio genetico a livello del DNA. Ne abbiamo già parlato in merito soprattutto al flusso di composti chimici attraverso la membrana e alle leggi che governano tale flusso. É quindi importante esaminare un pò più il dettaglio il ruolo e la struttura della membrana che riteniamo il punto cardine della tossicodinamica di tutti i composti che agiscono sul citoplasma cellulare. Il passaggio degli xenobiotici attraverso le membrane biologiche è funzione delle loro caratteristiche chimico-fisiche, (dimensioni molecolari del xenobiotico, dalla sua solubilità in acqua e nei lipidi, dal grado di ionizzazione e dalla relativa solubilità nei lipidi sia della forma ionizzata che della forma non ionizzata) della dose di xenobiotico somministrato iin larga misura,poi, dipende dal grado e dalla velocità con cui lo xenobiotico viene assorbito e poi distribuito ai tessuti, dal grado di legame con le proteine ematiche e tessutali, dalla localizzazione dello xenobiotico a livello tessutale, dal grado e dalla velocità con cui lo xenobiotico viene metabolizzato ed escreto. Ora, assorbimento, distribuzione, biotrasformazione ed eliminazione degli xenobiotici implicano il loro passaggio attraverso le membrane cellulari poiché gli xenobiotici generalmente superano le diverse barriere organiche passando attraverso le cellule e non tra le cellule. Così, in definitiva, la membrana cellulare resta l'ostacolo comune a tutti i compartimenti che lo xenobiotico attraversa nella sua distribuzione all'interno dell'organismo. Più facile il superamento della membrana cellulare, più completo l'assorbimento e ampia la distribuzione nell'organismo e viceversa. Certamente non tutti gli xenobiotici superano le membrane cellulari con la stessa velocità o con le stesse modalità. Ecco quindi l'importanza di conoscere il meccanismo con cui lo xenobiotico le attraversa, poiché questo meccanismo condiziona la quantità di xenobiotico che viene assorbita e distribuita. 3

4 Fig. 1.1 Cellula animale e cellula vegetale La membrana cellulare Le membrane biologiche delineano una frontiera, un confine tra organuli intracellulari e citoplasma, tra cellula e cellula, tra cellula ed l ambiente esterno. Assicurano inoltre il mantenimento del contenuto intracellulare compatibile con le esigenze di lavoro e di vita della cellula stessa o dei suoi costituenti grazie a precise e spesso specifiche proprietà di permeabilità e capacità di trasporto di ioni e sostanze nutritive. Queste ultime proprietà influenzano anche la distribuzione dei composti chimici fra lo spazio extra ed intracellulare e tra citoplasma e strutture intracellulari. Le membrane biologiche, quindi, non assolvono alla sola funzione meccanica di protezione della cellula o di imitazione degli organuli subcellulari, ma sono implicate in molteplici attività fondamentali per la cellula stessa come, ad esempio, il riconoscimento di materiale estraneo che è un fenomeno dei processi immunitari. La struttura delle membrane rappresenta il marchio d identificazione della cellula, la sua carta di identità. Membrane di cellule diverse posseggono strutture che le caratterizzano. Grazie alla presenza di queste strutture specifiche, disposte alla superficie delle membrane, ogni cellula viene riconosciuta dall'organismo o come propria, ed allora accettata, o come estranea, ed allora essa determina la messa in opera di quei meccanismi di difesa di cui l'organismo dispone. Trattasi di meccanismi immunitari che, grazie a quella che viene chiamata risposta immunitaria, assolvono il compito di neutralizzare ed eliminare tutto ciò che è estraneo all'organismo ed, in quanto tale, possibilmente pericoloso, dannoso. 4

5 La formazione e la conseguente specializzazione della membrana plasmatica sono stati eventi determinanti per l evoluzione della vita sulla Terra; infatti grazie alla sua comparsa è cominciata la vera e propria costituzione di entità separate (cellule primordiali senza alcuna organizzazione interna), capaci di operare una selezione altamente specifica grazie alla funzione filtrante della membrana stessa. Tutte le membrane hanno la stessa costituzione di base: un doppio strato lipidico (bilayer) in cui sono immerse molecole proteiche, quasi sempre glicosilate, più o meno complesse e voluminose che danno le caratteristiche di specificità funzionale alla membrana stessa e alla quale sono legate tramite legami non covalenti. Una struttura siffatta risulta intuitivamente ben definita dalla classica definizione di mosaico fluido che ben rende conto delle fondamentali caratteristiche di dinamicità e asimmetria di qualsiasi membrana. Vediamo quindi di analizzare in dettaglio, seppur brevemente, le varie componenti e di descrivere poi a sommi capi i meccanismi di trasporto attraverso la membrana per molecole di piccole e grandi dimensioni Struttura delle membrane biologiche. Le membrane biologiche hanno di solito uno spessore variabile tra i 4.0 ed i 10.0 nm. Sono composte essenzialmente da lipidi e proteine disposti in un modello estremamente semplificato a formare una struttura trilaminare: una fascia esterna di natura proteica, una fascia intermedia formata da uno strato lipidico bimolecolare ed una terza fascia, orientata verso l'interno dell'ambiente cellulare, costituita ancora da materiale proteico. Su questa distribuzione dei componenti sono stati elaborati diversi modelli di struttura delle membrane cellulari di cui il più attuale è quello «a mosaico fluido». In questo modello la continuità della membrana è data da uno strato bimolecolare di fosfolipidi disposti in modo da orientare la parte apolare, (le catene idrocarboniose degli acidi grassi che li costituiscono), verso la zona più interna della membrana (strato idrofobico) e la parte polare, (le teste dei fosfolipidi costituite da glicerolo e basi organiche), verso l'ambiente acquoso rispettivamente all'esterno e all'interno della membrana stessa. 5

6 L'intelaiatura delle membrane cellulari è costituita da un doppio strato di lipidi le cui teste idrofile formano le superfici interna ed esterna e le code idrofobe si uniscono al centro della membrana; il doppio strato ha uno spessore di circa 4,5 nanometri. Le proteine, che costituiscono gli altri componenti della membrana, possono essere di due tipi. Alcune dette periferiche (a) sono disposte su entrambe le facce della membrana. Le altre, dette integrali, penetrano nella membrana per un breve tratto (b) o, l'attraversano completamente da sole o a coppie (e) Il doppio strato lipidico Come si ricava dal nome, è una doppia sequenza in parallelo di molecole lipidiche direzionate in modo preciso. Esso è la matrice di base della membrana oltre che la struttura portante delle molecole proteiche, il cui buon funzionamento dipende in grandissima parte dal mantenimento nel tempo e nello spazio delle caratteristiche proprie dei lipidi componenti. Fig. 1.2 Il doppio strato lipidico della membrana cellulare. La particolarità del doppio strato lipidico che subito risalta è il carattere anfipatico: i lipidi sono costretti quindi a disporsi sempre e soltanto secondo una certa direzione, l uno rispetto all altro sia nello stesso monostrato, sia nel bilayer, il che ha una ragione d essere in quanto rende conto di una struttura avente il minor contenuto in energia libera tra le possibili. Ne deriva che la membrana grazie ai propri lipidi possiede le fondamentali proprietà di autoaggregazione e autosigillazione. I lipidi che si rintracciano normalmente in una membrana cellulare sono riconducibili a tre tipi: i fosfolipidi, il colesterolo ed i glicolipidi. 6

7 Fig Rappresentazione schematica della struttura di una membrana biologica. Nella fig.1.3 sono indicate con GP le glicoproteine nella superficie esterna della membrana; catene disaccaridiche e oligosaccaridi che con residui terminali di acido sialico si proiettano nello spazio intercellulare. G: gangliosidi sulla superficie esterna che proiettano nello strato lipidico della membrana una catena a due atomi di carbonio e nello spazio intercellulare danno origine a una porzione idrofilica contenente residui di acido sialico. MP" monostrato proteico nella superficie esterna ed interna della membrana. Le catene polipeptidiche si arrotolano in una caratteristica formazione ad elica. Gli aminoacidi polari si trovano in superficie mentre gli aminoacidi idrofobici penetrano la regione non-polare dello strato lipidico. Si possono vedere proteine che penetrano parzialmente nella compagine lipidica e in un punto (al centro) vi è una proteina che attraversa in linea retta l'intera zona lipidica. T: teste polari dei fosfolipidi. GL: glicerolo.ci: code idrocarburiche dei fosfolipidi. Le code idrocarburiche possono essere costituite da acidi grassi saturi o insaturi; queste ultime, più mobili, possono perdere il loro allineamento ordinato in seno alla compagine lipidica. LL: strato lipidico bimolecolare costituito da fosfolipidi e colesterolo (il nucleo steroidico è raffigurato in seno alla matrice lipidica). Il monostrato proteico (MP) e il doppio strato lipidico (LL) costituiscono l'unità strutturale della membrana. 7

8 I fosfolipidi sono molecole lipidiche caratterizzate dalla presenza di un gruppo fosfato variamente sostituito (residui tipici sono: la colina e la serina- presenti rispettivamente sempre e solo sulla faccia esterna ed interna della membrana -, l etanolammina, l inosotolo). Tale fosfato è esterificato ad una molecola di glicerolo, a sua volta portante, sempre in legame estereo, due molecole di acido grasso, in catena carboniosa da 14 a 24 atomi, di cui uno saturo ed uno insaturo (in conformazione cis), che porta alla formazione di una tipica piega nella struttura complessiva, avente funzione di ostacolarne l impacchettamento. I doppi legami sono importanti perché esaltano la fluidità del doppio strato lipidico, oltre al fatto di contribuire ad abbassare la temperatura di congelamento della struttura. Il residuo, il fosfato ed il glicerolo formano la cosiddetta testa idrofila (polare) del fosfolipide, posizionata sempre verso l esterno del bilayer, cioè esposta verso la faccia esterna o interna della membrana, ma mai nell interno del doppio strato lipidico. I due acidi grassi formano invece la coda idrofoba (apolare) del fosfolipide, racchiusa sempre nella parte interna della membrana. Stando ferme queste condizioni, i fosfolipidi sono comunque in grado di subire dei cambiamenti di posizione (movimenti accessibili), quali la diffusione laterale su di uno stesso monostrato (circa 10 volte al secondo), la rotazione rispetto al gruppo fosfato, la flessione delle code idrocarburiche e più raramente (all incirca 1 volta ogni due settimane) il cosiddetto flip-flop, cioè il passaggio da un monostrato all altro. É importante valutare appieno questi eventi per capire pienamente la definizione che si dà alla membrana di mosaico fluido. Il colesterolo, molecola caratterizzata dalla struttura ciclica centrale dello steroide, piana e rigida, nella quale si individuano da un alto un gruppo di testa polare (residuo idrossilico) e dall altro un gruppo di coda idrocarburico apolare si inserisce tra i fosfolipidi (in genere secondo un rapporto di circa 1 a 1) in modo direzionato ed esalta la stabilità meccanica della membrana, regolandone al tempo stesso la fluidità. I glicolipidi sono molecole composte da due acidi grassi esterificati ad una catena variamente diramantesi (in toto da 1 a 15 zuccheri) di gruppi glucidici di diverso tipo. Sono presenti soltanto sulla faccia esterna (circa il 5% dei lipidi totali) della membrana e quindi contribuiscono in modo precipuo alla sua asimmetria. Si distinguono in neutri e aventi carica: i primi, detti anche glicosfingolipidi, codificano le differenze fra specie, fra individui della stessa specie e tra cellule dello stesso organismo, fungendo quindi da marcatori cellulari; gli altri, detti gangliosidi, recano residui di acido sialico (che è carico negativamente) e sono presenti in particolare a livello di neuroni (ne costituiscono il 6% in massa). Se genericamente si dice che il doppio strato lipidico è un solvente per le molecole proteiche, risulta anche vero dalla breve descrizione delle caratteristiche proprie dei suoi componenti che esso forma per le stesse l ambiente funzionale più appropriato. 8

9 Il bilayer lipidico che compone la membrana è per sua natura idrofobo: le sue caratteristiche chimico-fisiche quindi, da sole, contribuiscono ad una selezione di base nei confronti di tutte le molecole polari, anche se piccole. Certo il fatto di avere piccole dimensioni favorisce il passaggio attraverso il doppio strato, ma sono le caratteristiche di idrofobicità(filia) che fanno la differenza Le proteine La qualità e la quantità di molecole proteiche presenti in un doppio strato lipidico determinano in modo univoco la funzionalità della membrana stessa. Esse genericamente si suddividono in proteine periferiche, quando sono posizionate in uno dei monostrati, e transmembrana, quando invece estrudono da una parte all altra del bilayer lipidico. Interessanti sono soprattutto queste ultime. Nelle proteine transmembrana si individuano (prendendo come riferimento il bilayer) una parte idrofila rivolta verso l esterno ed una parte idrofoba verso l interno, in modo da assicurare la massima interazione con la componente lipidica della membrana stessa e quindi la massima stabilità alla molecola, il che risulta naturalmente in una migliore funzionalità (si ricordi infatti che una membrana il cui assetto lipidico sia alterato, funzionerà pure in modo anomalo o parziale!). Per lo stesso motivo, poi, si tratta in genere di strutture peptidiche ad α-elica o a β- foglietto, proprio perchè queste sono le strutture secondarie che assicurano il maggior numero di legami idrogeno tra peptidi. Una ulteriore suddivisione che si tende a fare tra le transmembrana è quella basata sulla forma, per cui si riconoscono proteine bastoncellari, che sono in genere recettori e marcatori cellulari, e proteine globulari, che fungono in genere da canali proteici. L aver posto l attenzione sulla necessità di mantenere una buona stabilità del materiale proteico all interno del bilayer lipidico, non deve creare confusione rispetto ad un altro concetto fondamentale: la capacità cioè delle molecole proteiche di muoversi nello stesso. Si pensi ad esempio per assurdo che cosa potrebbe significare per un sistema enzimatico funzionante a cascata la non-fluidità della membrana. Lipidi e proteine hanno una notevole libertà di movimento per quanto riguarda la diffusione laterale in seno al doppio strato fosfolipidico. Un preciso grado di fluidità è molto importante per il corretto funzionamento della membrana e per la sopravvivenza della cellula. Infatti, è stato dimostrato che una membrana non assolve più alle sue funzioni biologiche quando i lipidi sono presenti in forma rigida e compatta, come succede per l'esposizione delle membrane alle basse temperature. D'altro canto un'eccessiva fluidità, quale quella che si può avere alle alte temperature, comporta drammatici cambiamenti nella permeabilità della membrana, che perde così ogni sua selettività, comportandosi come un sistema instabile in 9

10 cui la funzionalità di gran parte delle proteine viene certamente compromessa. Un opportuno grado di fluidità è pertanto indispensabile affinchè, a livello delle membrane biologiche, si possano attuare importantissimi processi biochimici essenziali per la vita, quali reazioni enzimatiche, processi di trasporto e la respirazione cellulare. Le proteine inglobate meno profondamente nel doppio foglietto lipidico possono servire alle interazioni delle membrane con l'esterno: con gli ormoni, con i neurotrasmettitori, con gli autacoidi o con altre sostanze presenti in circolo (ad es. gli xenobiotici) che, combinandosi con queste proteine più superficiali, meno profondamente inglobate nella struttura membranosa, danno origine al trasferimento d informazioni all'interno dell'ambiente cellulare. Fig.1.4 Dislocazione delle proteine sulla membrana L'interazione dell'agente esterno con il proprio recettore conduce ad alterazioni della componente proteica o lipidica della membrana (o di entrambe) che possono ripercuotersi in variazioni di attività di enzimi o di trasportatori o di altro. Tutti questi fenomeni sono resi possibili dalla fluidità della componente lipidica della membrana. Le proteine che invece attraversano l'intera compagine della membrana servono a fare da ponte attraverso lo strato lipidico e possono permettere il passaggio di molecole che altrimenti non varcherebbero la barriera idrofobica della membrana stessa. Alcune proteine delimitano delle zone idrofile, dei canali attraverso cui fluiscono acqua, ioni e molecole idrofile di piccole dimensioni come l'urea e l'alcool. La rigidità e la pervietà del canale dipendono dalla fluidità della componente lipidica della membrana. Altre proteine esplicano la funzione di trasportatori. I trasportatori possono oscillare dall'esterno all'interno. 10

11 I carboidrati I glucidi presenti si trovano soltanto sul monostrato lipidico esterno della membrana contribuendo alle caratteristiche di asimmetria. Si individuano come catene laterali attaccate ai protidi o ai lipidi e si differenziano perciò in: - glicoproteine (che sono la quasi totale maggioranza delle proteine totali di membrana), caratterizzate dalla presenza di più catene glucidiche variamente differenziate per qualità e quantità, - glicolipidi (che sono circa 1 su 10 dei lipidi totali esterni), caratterizzati dalla presenza di una sola catena glucidica. Nel loro complesso i carboidrati formano uno strato esterno alla membrana (ed alla cellula in toto) che viene chiamato in vario modo (rivestimento, mantello cellulare, glicocalice; ben evidenziabile con una colorazione al rosso rutenio). Le funzioni di tali catene glucidiche sono molteplici: ancorare le proteine e orientarle nella membrana; stabilizzarle, soprattutto se di tipo periferico; svolgere funzione di riconoscimento inter/intracellulare, funzionando da veri e propri marker. Per il riconoscimento e, quindi, l autorizzazione all entrata dello xenobiotico, alla superficie della membrana sono dislocati dei recettori specifici atti a riconoscere e ad interagire con determinati ormoni o neurotrasmettitori presenti nei liquidi biologici e che rappresentano per la cellula dei messaggeri dell'ambiente esterno. Fig.1.5 A sx: una proteina parzialmente immersa nel doppio strato lipidico recepisce i messaggi dall esterno, portati da ormoni e li trasmette a proteine messaggeri all interno. A dx; un dimero glicoproteico si proietta all esterno della membrana; nello stesso tempo una proteina cilindrica penetra all interno della membrana e si espande nello spazio intracellulare. La proteina esterna riconosce il messaggero ed attiva la funzione catalitica dell enzima di riferimento per lo xenobiotico della parte interna. A seconda del tessuto considerato, il messaggio ormonale o neuroumorale trasmesso in sede intracellulare con la formazione di AMP ciclico si concreterà poi nella 11

12 risposta biologica finale che sarà di natura fisiologica o metabolica in funzione delle proteine. Grazie ai movimenti d oscillazione o di rotazione della proteina, resi possibile dalla fluidità della membrana, la sostanza da trasportare, captata da uno specifico sito di legame, viene trasferita dalla parte opposta della membrana e qui rilasciata. Tali trasportatori sono deputati a trasferire molecole che da sole non potrebbero attraversare la membrana stessa. Ne è esempio il glucosio, molecola estremamente idrofila che difficilmente potrebbe allontanarsi dal solvente acquoso dell'ambiente extracellulare per entrare in una fase lipidica. Le membrane biologiche costituiscono una barriera che non è superabile da tutti gli xenobiotici. Essa ha una parte proteica ed una parte lipidica, in cui prevale la presenza di fosfolipidi. Ai fini del trasferimento di materiale dall'esterno all'interno e viceversa si comporta essenzialmente come una barriera lipidica. Uno xenobiotico liposolubile supererà la barriera in grado proporzionale alla sua affinità per i lipidi. Uno xenobiotico idrosolubile verrà respinto, a meno che non abbia un diametro molecolare così ridotto (non superiore ai 4 A) da riuscire a passare sfruttando zone idrofile della membrana. In ogni caso la struttura della membrana è tale che la sua permeabilità differisce nei confronti di diversi ioni e molecole. Per ogni data membrana ci sono sostanze che non passano affatto, altre che passano con un preciso meccanismo ed in genere tanto più rapidamente quanto più sono liposolubili Il passaggio degli xenobiotici attraverso le membrane biologiche. Il motivo fondamentale per la necessità di studiare accuratamente la membrana cellulare in ecotossicologia e tossicologia umana è che la membrana è il porto d ingresso nel sistema biologico animale ed umano per cui, se non si verifica il passaggio di membrana, non ha senso parlare di tossicità. Conoscendo il comportamento della membrana nei confronti di vari composti chimici, è possibile prevedere il destino di uno stressore chimico che arrivi a contatto con essa. Come prima indicazione orientativa si può dire che i requisiti fondamentali affinché un xenobiotico venga ripartito a livello della membrana sono la sua idrosolubilità che consente ch'esso sia in soluzione nei liquidi biologici, le sue dimensioni molecolari che ne condizionano il passaggio mediante particolari meccanismi di trasporto presenti nelle membrane, ed infine la sua liposolubilità, che ne consente l'assorbimento per diffusione. Gli xenobiotici non ionizzati sono liposolubili e diffusibili. Gli xenobiotici ionizzati sono insolubili nei lipidi e non diffusibili meno che non possano usufruire di particolari meccanismi di trasporto. Il grado di ionizzazione dipende dal ph, perciò, modificando il ph possiamo influenzare l'assorbimento o l'eliminazione di un dato xenobiotico. 12

13 Analizziamo, ora, con maggior dettaglio i principali processi mediante i quali i composti xenobiotici passano la membrana cellulare. É chiaro che i processi si riferiscono a qualunque composto chimico che si presenti con un certo gradiente di concentrazione a livello della membrana cellulare e che venga riconosciuto, in ogni caso, come composto ricco di legami energetici riutilizzabili e di atomi adatti ad un uso plastico (costruzione delle unità cellulari). Nel nostro caso, trattando d ambiente e salute, la considerazione sarà fatta per gli xenobiotici ma la trattazione è, chiaramente, identica nel caso di un farmaco, di un nutriente o, infine, di qualsiasi composto chimico Fenomeni di trasporto Il trasporto di uno xenobiotico atrraverso la membrana cellulare deve essere sempre riferito all energia. Questo vuol dire che anche il passaggio di materia transmembrana si realizzerà solo se il livello energetico per il composto che trasmigra sarà, all esterno della membrana, superiore a quello che lo stesso composto ha nel citosol ossia all interno della cellula. La fugacità del composto o dei composti nel liquido che permea la membrana all esterno sarà superiore a quella interna (sommata alle resistenze di membrana). Per raggiungere le condizioni di minima energia del sistema il composto passerà all interno fino a che le energie si bilanceranno (energia esterna = energia interna+ resistenze). Ci si trova, quindi, anche nel caso del sistema fluido esterno-membrana strato lipidico esterno- membrana strato lipidico interno-fluido interno di fronte ad un processi di ripartizione tra due fasi: fluido esterno (comparto A) e fluido interno (comparto B), separati da una interfaccia (attiva), la membrana cellulare. Se lo xenobiotico arriva alla membrana (interfaccia), con una certa concentrazione (fugacità), al tempo zero è la massima possibile poiché nell interno della cellula lo xenobiotico non é presente (f=0). La condizione, ora, è energeticamente inaccettabile poiché corrisponde a quella di uno squilibrio assai elevato. Per tentare di raggiungere l equilibrio, il sistema, deve assestarsi, spostando, in funzione delle due diverse fugacità, moli di xenobiotico dal comparto A al comparto B. In questa fase la massa del composto fluisce secondo un processo continuo. Poiché, infatti, natura non facit saltus, il flusso di materia seguirà criteri quantitativi continui definiti dalla differenza di fugacità e, in termini fenomenologici, dalla differenza in concentrazione tra i due comparti. Questo processo viene espresso dalla 1 a legge di Fick. Per chiarire le idee, supponiamo di introdurre una goccia di arancio di metile all inizio di un tubo pieno di acqua. L osservazione dice che il colorante diffonde progressivamente fino a che tutta l acqua é colorata. Peraltro, al tempo t = 0, la concentrazione del colorante nello strato infinitesimo iniziale del tubo d acqua é uguale alla concentrazione totale del colorante stesso ossia C = C 0 ; man 13

14 mano che passa il tempo, la colorazione del resto del tubo d acqua assume progressivamente colore sempre più intenso fino a che non si distingue differenza di colore tra le singole sezioni. In questo momento non vi é, quindi, più passaggio di colorante o flusso di colorante attraverso le sezioni del tubo d acqua: abbiamo raggiunto una condizione d equilibrio. L interpretazione termodinamica dice che al tempo zero la fugacità del colorante nella goccia era elevatissima e zero nell acqua circostante. Per arrivare all equilibrio (Minima energia del sistema e fugacità eguale per ogni goccia di colorante), ogni molecola di colorante doveva diffondere fino a distanza infinita dalle proprie consorelle. La stessa cosa succede a livello dell interfaccia di una membrana biologica. Se misuriamo, durante la fase dinamica, il flusso dello xenobiotico secondo l asse x (in unità di massa per unità d area e per unità di tempo), possiamo esprimere la relazione tra il flusso e la concentrazione esterna in: Fx = D dc dx a con dc/dx = al gradiente di concentrazione (fugacità) del composto in esame, D = coefficiente di diffusione molecolare e a la sezione attraverso cui si valuta il flusso. Di solito a è considerata unitaria e quindi non compare nella relazione usuale di Fick. D é tipico per lo xenobiotico considerato e per il comparto in cui il composto diffonde. D é espresso in m 2 s -1 ; poiché la concentrazione C é espressa in moli m -3, il flusso F é espresso in moli m -2 s -1. La relazione che esprime il flusso F é nota come la 1 a legge di Fick ed é una espressione di leggi simili (conducibilità del calore, conducibilità elettrica ecc.) ove un gradiente (dc/dx) é il motore che determina un flusso (F) di materia od energia attraverso una interfaccia che provoca una resistenza (in realtà la somma di più resistenze date dalle interazioni molecolari tra i vari composti in gioco) espressa globalmente dal coefficiente D. D, coefficiente di diffusione, é misurato come rapporto tra superficie e tempo (m 2 s - 1 ) ed è un parametro che varia in dipendenza del tipo specifico di matrice (non è quindi un parametro esportabile!), con la temperatura del mezzo e ovviamente con le caratteristiche chimico-fisiche e la concentrazione della sostanza di cui si sta valutando la mobilità; esso esprime in un certo senso la resistenza offerta dal mezzo o dalla matrice al passaggio e quindi al trasporto di quel determinato composto; C è la concentrazione della specie diffondente, generalmente misurata in moli m -3 ; x rappresenta la distanza dalla sorgente o dal punto di massima concentrazione, normalmente misurata in metri lineari; 14

15 dc/dx, quindi, quantifica il gradiente di concentrazione, ovvero la variazione della concentrazione C della specie diffondente nel mezzo lungo una prefissata direzione e secondo un determinato verso al variare della distanza x; viene posto per convenzione il segno meno per indicare che la diffusione netta avviene verso regioni del sistema a concentrazioni sempre minori (ricordare il principio della fugacità) F, con tali unità di misura, viene espresso in moli m -2 s -1. É chiaro, a questo punto, che la membrana plasmatica funge da barriera di delimitazione tra una qualsiasi cellula e tutto ciò che sta al di fuori di essa. La sua specializzazione però non finisce qui; essa funge anche da filtro selettivo, nel senso che non si limita ad essere un ostacolo passivo, ma possiede per sue intrinseche caratteristiche la capacità di "lasciare passare" e/o trasportare le molecole necessarie alla cellula o, in direzione opposta, quelle di cui la cellula non necessita più, o ne fa richiesta all'esterno. Genericamente, si possono riconoscere due diversi tipi di fenomeni di trasporto, quelli concernenti le molecole di piccole dimensioni e quelli che riguardano molecole di grossa mole o insiemi di piccole molecole che vengono rilasciate in grande quantità. Infine, considereremo un caso particolare, quello dei metalli pesanti, per l importanza sempre crescente del loro ruolo ecotossicologico ed ecologico nei fenomeni di tossicità ambientale ed umana. Potremo dividere i processi di trasporto in due blocchi: processi entropici e processi sintropici. I primi sono dovuti a differenze di fugacità ai due fronti della membrana ed i processi di trasporto si verificano senza apporto di energia dal sistema; nel secondo caso necessita energia prodotta attraverso il metabolismo cellulare Trasporto di grandi molecole Processi entropici: i processo passivi Il fenomeno del trasporto passivo viene, a sua volta, genericamente suddiviso in: - diffusione semplice (a cui si è accennato sopra), che può essere normale, cioè nient altro che una diffusione, oppure con proteina canale, nel caso in cui serva comunque creare un ambiente adatto per caratteristiche di polarità a che la molecola passi nello spessore della membrana; - diffusione facilitata, quando il passaggio è favorito da proteine vettrici, che utilizzano a tale scopo il gradiente chimico, cioè la differenza di concentrazione tra una faccia e l'altra della membrana della molecola da trasportare, e/o il gradiente elettrico, cioè la differenza di carica elettrica esistente tra l'interno (negativo) e l'esterno (positivo) della membrana [si tenga comunque presente che anche questa situazione non è casuale, ma deriva a sua volta, principalmente, dall'azione di due proteine di trasporto che continuamente 15

16 "lavorano" affinché il gradiente elettrochimico non decada, in quanto verrebbe meno il cosiddetto potenziale di membrana assolutamente necessario alla vita della cellula]. Fig.1.6 Attivazione di un canale proteico da parte di uno xenobiotico che facilita, così, il passaggio di ioni dall esterno all interno della cellula. Non a caso, quindi, la diffusione semplice attraverso la membrana, il più immediato di tutti i tipi di scambio fra l'esterno e l'interno della cellula, chiama in causa soltanto molecole come l'ossigeno (O 2 ), molecola piccola, simmetrica e idrofoba; l'anidride carbonica (CO 2 ) che è polare ma neutra; l'acqua (H 2 O) che con le sue caratteristiche di dipolo riesce ad "incunearsi" tra i lipidi sfruttando di volta in volta le regioni con minore o maggiore polarità. All'opposto, in tutti gli altri casi, si ha a che fare con una diffusione mediata, in cui lo scambio è reso possibile solo grazie alla presenza di particolari componenti di membrana che fungono o da canale o da veri e propri vettori. 16

17 Fig. 1.7 Schema di struttura di membrana e ipotetico meccanismo di trasporto. Si ritiene che esistano sulla membrana dei «pori» o degli equivalenti funzionali degli stessi. Il poro è rappresentato da una cavità interna ad una proteina la quale si estende da parte a parte della membrana. Questo canale, di natura idrofilica, offrirebbe a molecole idrosolubili un ponte di passaggio attraverso lo strato fosfolipidico. É forse quest'ultimo il caso più interessante, in quanto chiama in causa le proteine vettrici che sono per la maggior parte degli enzimi associati alla membrana. Una molecola che deve essere introdotta nella cellula (o essere espulsa dalla stessa) può compiere il passaggio come singola entità (uniporto) o insieme ad altre molecole (cotrasporto), che possono a loro volta procedere nella stessa direzione (simporto) o lungo la direttrice opposta (antiporto). Un esempio di cotrasporto come simporto è quello che avviene nelle cellule batteriche, che introducono contemporaneamente una molecola di glucosio con uno ione idrogeno (H + ); il cotrasporto come antiporto invece si osserva in tutte le cellule eucariotiche a livello della pompa Na + -K + ATPasi, in cui per ogni tre ioni Na + che escono, due di K + entrano. La differenza sostanziale tra i vari sistemi di scambio consiste però nella necessità o meno che avvenga uno dispendio energetico perchè lo scambio stesso abbia luogo. Si parla allora di trasporto passivo, quando non entrano in gioco meccanismi energetici; di trasporto attivo, nel caso contrario. 17

18 Dobbiamo qui distinguere la diffusione per convezione (filtrazione), dalla diffusione semplice attraverso i lipidi (diffusione passiva) Processi entropici: diffusione per convezione Avviene attraverso zone idrofile della membrana chiamate canali e viene chiamata anche filtrazione poiché implica il passaggio di un notevole volume di acqua, come conseguenza di differenze di pressione idrostatica od osmotica attraverso la membrana. Il volume di acqua che fluisce attraverso il canale trascina con sé qualunque molecola idrosolubile di dimensioni molecolari sufficientemente piccole da passare attraverso il canale stesso. La filtrazione è regolata allora da differenze di pressione idrostatica od osmotica ed avviene secondo gradiente osmotico. La filtrazione è il meccanismo che più comunemente trasferisce molte sostanze idrosolubili polari e non polari, purché di piccole dimensioni. La grandezza dei canali differisce nelle varie parti dell'organismo. Le cellule endoteliali dei capillari hanno canali larghi (40 A) attraverso i quali possono passare molecole così voluminose come l'albumina (PM = ). Queste molecole possono cioè trasferirsi, se pur in grado limitato, dal plasma ai fluidi extracellulari. Di contro, i canali delle membrane dei globuli rossi, dell'epitelio intestinale, e di molte altre membrane, non sono superiori ai 4 A di diametro e perciò permettono il passaggio solo di acqua, di urea, alcool ed altre piccole molecole idrosolubili. Tali sostanze generalmente non attraversano i canali delle membrane cellulari se il loro peso molecolare è superiore a La membrana glomerulare è un tipico esempio di membrana filtrante. Molti ioni inorganici sono sufficientemente piccoli da passare attraverso i canali delle membrane biologiche, ma il loro gradiente di concentrazione è generalmente determinato dal potenziale di transmembrana (ad esempio per il Cl - ) o dal trasporto attivo (ad esempio nel caso del Na + e del K + ). Benché non sia nota la natura dei componenti della membrana implicati in questo trasferimento, la pervietà del canale e la velocità del passaggio dipende dalla quantità di acidi grassi insaturi e di colesterolo presenti entro la struttura della membrana Processi entropici: diffusione attraverso i lipidi. Il processo avviene attraverso la fase lipidica della membrana ove transitano solo sostanze liposolubili. Questo trasferimento è direttamente proporzionale alla grandezza del gradiente di concentrazione attraverso la membrana e al coefficiente di ripartizione lipidiacqua del xenobiotico. 18

19 Più elevato il coefficiente di ripartizione, più elevata la concentrazione di xenobiotico nella membrana e più veloce la sua diffusione. Ad equilibrio raggiunto, la concentrazione di xenobiotico libero è la stessa da entrambi i lati della membrana, qualora lo xenobiotico non sia un elettrolita. Per tutti i composti ionici, invece, le concentrazioni all'equilibrio dipenderanno dalla differenza di ph attraverso le membrane, che può influenzare lo stato di ionizzazione della molecola da ciascun lato della stessa, dal gradiente elettrico per lo ione. In definitiva, per quanto concerne la diffusione semplice, la membrana si comporta come una lamina lipidica attorniata all'esterno e i all'interno dall'acqua, cosicché tre sono le barriere da superare: una lipidi-acqua all'esterno, una solo lipidica al centro e un'altra rivolta all'interno della cellula costituita ancora da lipidi-acqua. Sostanze polari, fortemente idrofile formano forti legami idrogeno con l'acqua e di conseguenza restano come imprigionate nella fase acquosa all'esterno della membrana. D'altra parte, sostanze contenenti principalmente gruppi non polari, si accumulano nella componente lipidica delle membrane. Sostanze invece capaci di diffondere rapidamente attraverso la membrana (etanolo) contengono sia raggruppamenti debolmente polari che gruppi non polari e la loro velocità di diffusione dipende soprattutto dal gradiente di concentrazione e dal coefficiente di ripartizione tra lipidi e fase acquosa. Molti xenobiotici sono elettroliti deboli, acidi o basi deboli che sono molto più liposolubili che idrosolubili nella loro forma non ionizzata, ma molto più idrosolubili della forma ionizzata. Di conseguenza, solo le molecole non ionizzate diffondono facilmente attraverso le membrane. La proporzione tra xenobiotico non ionizzato e xenobiotico ionizzato dipende dal pk a (grado di ionizzazione) di ogni dato composto e dal ph del medium ove viene a trovarsi lo xenobiotico. Così l'assorbimento, la distribuzione e l'escrezione di tali xenobiotici è influenzata dal ph dei liquidi organici a differenti livelli. Poiché variando il ph varierà anche la tendenza di un xenobiotico a ionizzarsi, modifiche di ph possono influenzare la possibilità o meno di un xenobiotico a superare le membrane cellulari Processi entropici: trasporto facilitato. Il termine descrive il trasporto tramite intervento di un trasportatore o carrier che opera senza dispendio di energia, cosicchè i movimenti della sostanza trasportata avvengono solo secondo gradiente elettrochimico e non contro di questo. Tale meccanismo, che è saturabile ed altamente selettivo per xenobiotici aventi precise conformazioni strutturali, è indispensabile al trasporto di composti endogeni la cui velocità di movimento attraverso le membrane biologiche per semplice diffusione potrebbe essere nulla o troppo lenta. Il trasportatore incrementa, in questo caso, la velocità di movimento. 19

20 Fig.1.8 Meccanismo di trasporto mediante proteina trasportatrice che, ruotando, si affaccia alternativamente all interno od all esterno della cellula La combinazione tra la molecola trasportatrice e la sostanza che deve penetrare attraverso la membrana è specifica, nel senso che ciascun trasportatore può combinarsi solo con una sostanza o con un numero limitato di sostanze aventi comune struttura chimica. Il processo ping-pong raffigurato nel disegno rappresenta un ipotetico meccanismo di trasporto attraverso le membrane. Il trasportatore è costituito da una proteina immersa nella matrice lipidica della membrana. Esso presenta una specifica affinità per la sostanza da trasportare (l esagono nero). Il processo di.trasporto implica una variazione della configurazione spaziale della struttura proteica del trasportatore, tale da permettere che il sito di legame con la sostanza da trasportare si trovi alternativamente dislocato all'esterno o all'interno della membrana. Così, sulla superficie esterna della membrana si crea il complesso sostanza-proteina); all'interno della cellula, variazioni di affinità tra sito di legame e sostanza trasportata inducono il rilascio della sostanza stessa in sede citoplasmatica. La combinazione ricorda quella tra substrato ed enzima, o tra xenobiotico ed il suo recettore ed implica la formazione di un complesso intermedio, xenobiotico-trasportatore, diffusibile nella componente lipidica della membrana. La quantità di sostanza che si combina con il trasportatore dipende dalla sua concentrazione nella fase acquosa in contatto con la membrana e dal numero di siti di legame disponibili sul trasportatore, i quali saranno necessariamente limitati. Il complesso xenobiotico-trasportatore permette il trasferimento del xenobiotico dalla parte esterna a quella più interna della membrana, ove lo xenobiotico viene rilasciato. 20

21 Fig.1.9 Trasporto ping-pong Poiché la concentrazione del complesso è più alta nella parte della membrana ove avviene la sua formazione, esso chiaramente si muoverà secondo il suo gradiente di concentrazione e cioè verso la parte interna della membrana. Il trasportatore libero, d'altra parte, è più concentrato nella parte della membrana ove avviene la cessione del xenobiotico trasportato, cosicché il trasportatore libero muoverà in senso inverso, nella direzione opposta a quella del complesso xenobiotico-trasportatore. In questo modo il trasportatore fa la spola da una parte e l'altra della membrana per semplice diffusione Processi sintropici: trasporto attivo Si parla di trasporto attivo invece nel caso in cui sia necessaria la scissione di un legame ad alto contenuto energetico affinché il trasporto possa avvenire. Si ha che fare allora con una proteina vettrice di tipo enzimatico, capace di legare con altissima affinità in un sito specifico, nella maggior parte dei casi, una molecola di ATP (adenosintrifosfato), la cui perdita di un fosfato in legame estereo e conseguente trasformazione in ADP (adenosindifosfato) libera sufficiente energia da permettere una modifica conformazionale della proteina stessa che si traduce nel passaggio da una faccia all'altra della membrana della molecola da trasportare Trasporto attivo. Il passaggio per diffusione passiva non spiega il passaggio di tutti gli xenobiotici attraverso le membrane cellulari. Alcune sostanze vengono trasportate attraverso la membrana contro il loro gradiente di concentrazione o contro il gradiente elettrico e, apparentemente, contro il gradiente di fugacità Ciò significa che è necessaria dell energia metabolica per guidare tali movimenti ed il processo è detto di trasporto attivo o processo di trasporto sintropico. 21

22 Per trasporto attivo s intende, in pratica, il rapido trasferimento di molti acidi organici e di molte basi attraverso il tubulo renali, i plessi corioidei, la parete intestinale, la placenta e nelle cellule epatiche. Le caratteristiche di tale trasporto attivo sono: selettività, saturabilità, richiesta d energia che proviene dal metabolismo cellulare, inibizione competitiva ad opera di sostanze strutturalmente correlabili a quelle normalmente trasportate e capacità di operare contro un gradiente elettrochimico. Tale meccanismo può giocare un ruolo importante nel meccanismo d'azione gli xenobiotici che sono soggetti al trasporto attivo o che interferiscono con il trasporto attivo di metaboliti naturali o di neurotrasmettitori. Esempi di trasporto attivo sono la secrezione di H + nel succo gastrico e nelle urine, la captazione di iodio da parte delle cellule nella tiroide, il riassorbimento del glucosio e degli aminoacidi dalle urine nel sangue e la pompa del Na + che espelle attivamente gli ioni Na + scambiandoli con il K + nella maggior parte delle cellule eccitabili. La pompa del Na + trasporta Na + e K + attraverso la membrana sia contro gradiente elettrico che chimico. Altri ioni, come il Ca 2+, vengono attivamente espulsi dalle cellule con meccanismi di trasporto attivo. Alcuni xenobiotici attraversano le membrane solo grazie all'esistenza di un trasporto attivo. Esempio ne è la secrezione di penicilline nei tubuli renali e nella bile. Molti xenobiotici lasciano il liquido cerebrospinale per immettersi nel torrente circolatorio grazie all'esistenza di sistemi di trasporto propri a cellule di speciali regioni del cervello. Il grado di specificità dei sistemi di trasporto suggerisce che essi sono molto probabilmente di natura proteica. È stato infatti dimostrato che possono essere inibiti da xenobiotici che inibiscono la sintesi proteica o da composti che reagiscono con le proteine. Poiché i trasportatori possiedono siti specifici con cui si combinano le sostanze che vengono trasportate, composti aventi configurazione chimica o carica ionica simile possono competere tra di loro per uno stesso trasportatore e l'uno può inibire il trasporto dell'altro. Gli xenobiotici, oltre che competere tra di loro per uno stesso trasportatore, possono anche legarsi al trasportatore e bloccarlo, inibendo così il trasferimento di substrati endogeni senza essere trasportati Trasporto di grandi molecole Fagocitosi e Pinocitosi Quando la cellula ha la necessità di estrudere o includere grosse molecole o una quantità consistente di piccole molecole, mette in atto un sistema di trasporto diverso che risponda ai requisiti di facilità di gestione di ingombro nel primo caso e di velocità di passaggio da un compartimento all'altro, nel secondo caso. A seconda che la direzione del passaggio sia verso la cellula o verso l'esterno della stessa si parla rispettivamente di 22

23 endocitosi e di esocitosi, fenomeni che hanno le stesse identiche basi biochimiche: le proprietà autoaggreganti e autosigillanti del bilayer lipidico. L'endocitosi è il processo che porta all'incameramento all'interno della cellula di una o più sostanze. Essa comincia con l'invaginazione della membrana plasmatica in un punto particolare della superficie (spesso a livello delle cosiddette "fossette rivestite") che ha <<sentito>> la presenza della/e sostanza/e grazie ad un sistema di recettori-ligando. L'invaginazione procede fino al contatto fisico dei due poli opposti della membrana da cui il processo si è innescato, con conseguente fusione, chiusura e distacco di una vescicola endocitotica portante all'interno il materiale. Se il processo interessa dei liquidi o dei soluti viene chiamato pinocitosi; se invece vengono incamerati detriti o microorganismi, si parla di fagocitosi. In ogni caso all'interno della cellula avviene la fusione di più vescicole tra loro e la risultante si fonde con i lisosomi primari, con formazione di lisosomi secondari in cui avviene di norma la digestione (in senso lato) del materiale fagocitato, pronto a questo punto ad essere variamente utilizzato. L'esocitosi è invece il processo per cui avviene l'apertura verso l'esterno della cellula di vescicole (vacuoli) con conseguente perdita del contenuto degli stessi. Grazie a questa operazione la cellula inoltre può implementare il corredo lipidico e proteico della membrana, portare all'incorporazione di nuove sostanze nella matrice extracellulare, far diffondere nei fluidi interstiziali e/o nel sangue nutrimento e/o messaggeri cellulari. Deve essere chiaro che i due processi non devono essere interpretati come l'uno opposto all'altro. Nel caso dell'endocitosi la membrana è quella esterna ed in effetti il contenuto della vescicola non entra mai a contatto con il citoplasma, nemmeno quando esso è fisicamente all'interno della cellula. I vacuoli di esocitosi invece provengono dall'apparato di Golgi (per gemmazione controllata) con proteine appositamente sintetizzate e incorporate nel reticolo endoplasmatico, che subiscono modificazioni e smistamento. Ciò permette con tutta probabilità che endocitosi ed esocitosi abbiano una regolazione distinta. 23

24 Fig.1.10 Processo di fagocitosi (inglobamento di solido) e di pinocitosi (inglobamento di liquido e/o sospensioni colloidali) Tra le caratteristiche che permettono di distinguere le membrane biologiche dalle membrane inerti vi è la capacità di fagocitosi e di pinocitosi. Dal greco, fagocitosi indica «ingestione cellulare», mentre pinocitosi indica che «la cellula beve»; in entrambi i casi, cioè, la parola è indicativa del meccanismo cellulare cui si riferisce. Nella fagocitosi, estroflessioni del protoplasma si muovono a incapsulare materiale solido (ad esempio batteri) che si trova all'esterno della cellula. I fagosomi che così si formano affondano nel citoplasma dove si fondono con i lisosomi: le membrane si rompono e gli enzimi lisosomiali digeriscono le particelle inglobate nel fagosoma. Nella pinocitosi la membrana cellulare forma un canale di entrata in cui piccole particelle in soluzione colloidale o fluidi extracellulari fluiscono verso l'interno della cellula. L'invaginazione della membrana si chiude e si formano vescicole isolate che possono fondersi a formare globuli di dimensioni più vaste. Con questi meccanismi, molecole di grosse dimensioni, altrimenti incapaci di attraversare le membrane, possono essere assunte dalle cellule per pinocitosi o per fagocitosi. 24

25 Processi di trasporto di metalli Riportiamo, nella figura che segue, i quattro processi di trasporto prevalenti attraverso la membrana citoplasmatica dei metalli: 1. Processi di trasporto carrier-mediated. Sono quelli in cui alcune proteine (L) formano, con il metallo, un complesso solubile nei lipidi, ML; il complesso diffonde entro la membrana, ed il metallo può essere rilasciato nel citosol (il contenuto acquoso della cellula vivente). La maggior parte dei metalli entra nella cellula attraverso questo percorso. 2. Processi di trasporto attraverso i canali proteici. Ioni del metallo possono essere trasportati fra le proteine che si estende attraverso la membrana e che presentano molti gruppi idrofilici. 3. Processi di trasporto per diffusione passiva. Specie del metallo che sono solubili nei lipidi (non polari) si possono dissolvere nella membrana e rapidamente attraversarla. Questo processo è invocato spesso spiegare l uptake rapido di metalli-alchili da organismi unicellulari. 4. Processi di trasporto per endocitosi. Fig Processi di trasporto dei metalli attraverso la membrana 25