ZytoDot. 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe

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1 ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe C C (0.4 ml) 10 (0.1 ml) For the detection of the human EGFR gene and alphasatellites of chromosome 7 by chromogenic in situ hybridization (CISH).... In vitro diagnostic medical device according to EU directive 98/79/EC

2 Digoxigenin and DNP labeled polynucleotide probe for the detection of the human EGFR gene and alpha-satellites of chromosome 7 centromeres by CISH, ready to use Product Description Content: ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe EmaNUF in hybridization buffer. The probe contains digoxigenin-labeled polynucleotides, which target sequences of the EGFR gene and DNP-labeled polynucleotides, which target alpha-satellites of the centromere of chromosome 7. Product: C : 0.4 ml (40 reactions of 10 µl each) C : 0.1 ml (10 reactions of 10 µl each) Specifici city: The ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 17 Probe EmaNUF is designed to be used for the detection of the human EGFR gene as well as chromosome 7 alpha-satellites in formalin-fixed, paraffinembedded tissue or cells by chromogenic in situ hybridization (CISH).= Storage/Stability: The ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe EmaNUF must be stored at C (short-time storage at 2 8 C is possible) and is stable through the expiry date printed on the label. Use: Safety Precautions: This product is designed for in vitro diagnostic use (according to EU directive 98/79/EC). Interpretation of results must be made within the context of the patient s clinical history with respect to further clinical and pathologic data of patient by a qualified pathologist! Read the operating instructions prior to use! Do not use the reagents after the expiry date has been reached! - 1 -

3 This product contains substances (in low concentrations and volumes) that are harmful to health. Avoid any direct contact with the reagents. Take appropriate protective measures (use disposable gloves, protective glasses, and lab garments)! If reagents come into contact with skin, rinse skin immediately with copious quantities of water! A material safety data sheet is available on request for the professional user! Principle of the Method The presence of certain nucleic acid sequences in cells or tissue can be detected by in situ hybridization using labeled DNA probes. The hybridization results in duplex formation of sequences present in the test object with the labeled DNA probe. Duplex formation of the labeled probe (with sequences of EGFR and chromosome 7 alpha-satellites in the test material) can be visualized using primary (unmarked) antibodies, which are detected by secondary polymerized enzyme-conjugated antibodies. The enzymatic reactions of chromogenic substrates lead to the formation of colored signals that can be visualized by light microscopy

4 Instructions Pre-treatment (dewaxing, proteolysis, post-fixation) should be carried out according to the needs of the user. Denaturation and hybridization of probe: NK Vortex the ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe EmaNUF and pipette 10 µl each onto individual samples Distribute dropwise on the whole target area to avoid local concentration of probe. Alternatively, add probe to the center of a coverslip and place it upside down on target area. A gentle warming of the probe, as well as using a pipette tip, which has been cut off to increase the size of the opening, can make the pipetting process easier. OK Avoiding trapped bubbles, cover the samples with a coverslip (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32 mm). Seal the coverslip, e.g. with a layer of hot glue from an adhesive pistol or with rubber cement PK= Denature the slides at C for 5 min, e.g. on a hot plate QK= Transfer the slides to a humidity chamber and hybridize overnight at 37 C (e.g. in a hybridization oven) It is essential that the tissue/cell samples do not dry out during the hybridization step. Further processing, such as washing, detection, and counter-staining, can be completed according to the user s needs. For a particularly userfriendly performance, we recommend the use of a ZytoDot 2C CISH system by ZytoVision. These systems were also used for the confirmation of appropriateness of the ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe EmaNUF

5 Results In an interphase nucleus of normal cells or cells without aberrations of chromosome 7, two EGFR and two centromere 7 specific punctual signals appear which can be clearly distinguished from the background (color and appearance of the signals depend on the detection system that is used). In cells with a gene amplification an increased number of gene specific signals or signal clusters are visible. Due to mitosis, additional signals may be visible even in a small percentage of non-neoplastic cells. Occasionally, nuclei with missing signals may be observed in paraffin-embedded tissue sections. The polynucleotides contained in the ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe EmaNUF which recognize the alpha-satellite-sequences of the centromere of chromosome 7 function in themselves as an internal control that a successful hybridization has occurred, as well as proving the integrity of the cellular DNA. In order to judge the specificity of the signals, every hybridization should be accompanied by controls. We recommend using at least one control sample in which the chromosome 7 and EGFR gene copy number is known. Our experts are available to answer your questions

6 Literature Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Kondo I, Shimizu N (1983) Cytogenet Cell Genet 35: Marquez A, et al. (2004) Diagn Mol Pathol 13: 1-8. Mayr D, et al. (2009) Histopathology 55: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN As of: January 1, 2010 (4.5) Trademarks: ZytoVision and ZytoDot are trademarks of ZytoVision GmbH

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8 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 Probe IVD Dispositivo medico-diagnostico in vitro Produttore: ZytoVision GmbH Codice: C (0.1ml) C (0.4ml) Per l identificazione della regione cromosomica del gene umano EGFR e degli alfa-satelliti del cromosoma 7 mediante Ibridazione in Situ cromogenica (CISH)..... Dispositivo medico-diagnostico in vitro Secondo la direttiva europea 98/79/EC Revisione del 07/07/15 Pagina 1 di 6

9 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Sonda polinucleotidica marcata con Digossigenina per la rilevazione del gene umano EGFR e gli alfa-satelliti del centromero del cromosoma 7, pronta all'uso. Descrizione del Prodotto Contenuto: Sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 in tampone di ibridazione. La sonda contiene polinucleotidi marcati con digossigenina, che identificano sequenze adiacenti al gene EGFR, e polinucleotidi marcati con DNP, che identificano sequenze alfa-satellite del centromero del cromosoma 7. Prodotto: C : 0.1 ml (10 reazioni da 10μl ciascuna) C : 0.4 ml (40 reazioni da 10µl ciascuna) Specificità: Conservazione: La Sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 è adibita all evidenziazione della regione cromosomica del gene umano EGFR così come l alfa satellite del cromosoma 7 su tessuti o cellule fissati in formalina ed inclusi in paraffina, mediante ibridazione in situ cromogenica (CISH). La Sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 deve essere conservata a 2 C 8 C. La sonda è stabile durante il periodo indicato dalla data di scadenza. Utilizzo: Il prodotto è designato per la diagnosi in vitro (in accordo con la direttiva EU 98/79/EC). L interpretazione dei risultati deve essere fatta in un contesto clinico e patologico del paziente da un patologo esperto. Revisione del 07/07/15 Pagina 2 di 6

10 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Precauzioni per l uso: Leggere le istruzioni prima dell utilizzo del prodotto. Non usare il prodotto dopo la data di scadenza. Il prodotto contiene sostanze (a basse concentrazioni) dannose per la salute, evitare il contatto diretto con il prodotto. Usare dispositivi di sicurezza (guanti, occhiali di protezione, camice). Se il prodotto viene a contatto con la pelle, lavare abbondantemente con acqua. Su richiesta dell utilizzatore è disponibile una scheda di sicurezza. Principio del Metodo La presenza di determinate sequenze di acido nucleico nelle cellule o nei tessuti può essere rilevata attraverso ibridazione in situ con l'utilizzo di sonde a DNA marcate. L'ibridazione induce la formazione di una struttura a doppio filamento (ibrido duplex) tra le sequenze presenti nel campione in analisi e la sonda. La formazione del duplex della sonda marcata (con le sequenze della regione cromosomica del gene EGFR e degli alfa-satelliti del cromosoma 7) può essere visualizzata tramite un anticorpo primario (non marcato) che è a sua volta rivelato tramite un anticorpo coniugato con un enzima polimerizzato secondario. La reazione enzimatica del substrato cromogenico forma un precipitato colorato che può essere osservato con un microscopio ottico. Istruzioni Il pretrattamento (deparaffinazione, proteolisi, post-fissazione) deve essere effettuato indipendentemente dalle esigenze dell'utilizzatore. Denaturazione e ibridazione della sonda: 1. Vortexare la sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7 e dispensare 10μl per ogni campione. Distribuire a piccole gocce sull'intera superficie evitando di concentrare in un unico punto. Alternativamente, aggiungere la sonda al centro di un coprioggetto e Revisione del 07/07/15 Pagina 3 di 6

11 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite applicare il coprioggetto sull'area in esame. Un leggero riscaldamento della sonda e l'utilizzo di un puntale tagliato in punta semplificano l'operazione. 2. Evitare la formazione di bolle, coprire il campione con un vetrino coprioggetto (22 mm x 22 mm; 24 mm x 32mm). Sigillare il vetrino copri oggetto con colla a caldo o mastice. 3. Denaturare a C (± 2 C) per 5 minuti utilizzando una piastra calda. 4. Trasferire i vetrini in una camera umida e ibridare overnight a 37 C in una stufa ventilata. E importante che il campione (cellule o tessuto) non si asciughino durante l ibridazione Eventuali ulteriori processi, quali lavaggio e contro-colorazione, possono essere completati secondo le esigenze dell'utente. Per ottenere prestazioni ottimali, si consiglia l'uso di un sistema di CISH ZytoDot (ZytoVision). Questo sistema viene anche utilizzato per confermare l adeguatezza della Sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7. Risultati: In interfase di cellule normali o cellule senza aberrazioni del cromosoma 7, appaiono due segnali puntiformi specifici della regione del gene EGFR verdi e due segnali puntiformi specifici del centromero del cromosoma 7 rossi, che posso essere chiaramente distinti dallo sfondo, se viene utilizzato un sistema di rivelazione ZytoDot2C CISH di ZytoVision. Segnali sovrapposti occasionalmente possono essere visti come punti scuri di un colore indefinito. In cellule con un amplificazione della regione cromosomica del gene EGFR è visibile un numero aumentato di segnali specifici della regione del gene o cluster. Il colore e l aspetto dei segnali può variare se viene utilizzato un sistema differente di rilevazione. Revisione del 07/07/15 Pagina 4 di 6

12 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite A causa della mitosi, può essere visibile una piccola percentuale di segnali anche in cellule non neoplastiche. Occasionalmente, nei campioni inclusi in paraffina, è possibile avere cellule con assenza di segnale. I polinucleotidi contenuti nella Sonda ZytoDot 2C SPEC EGFR/CEN 7, che riconoscono le sequenze alfa-satellite del centromero del cromosoma 7, funzionano sia come un controllo interno che indica l avvenuta ibridazione della sonda e sia come verifica dell integrità del DNA cellulare. Al fine di valutare la specificità dei segnali, ogni ibridazione deve essere verificata mediante controlli (positivo e negativo). Si consiglia di utilizzare almeno un campione di controllo in cui sia inequivocabilmente noto il numero di copie del cromosoma 7 e del gene EGFR. Revisione del 07/07/15 Pagina 5 di 6

13 Bio Optica Milano S.p.A. via San Faustino 58 I Milano Tel Fax Acquisti/Export Fax Assistenza/Contabilità Fax Vendite Bibliografia: Isola J, Tanner M (2004) Methods Mol Med 97: Kondo I, Shimizu N (1983) Cytogenet Cell Genet 35: Marquez A, et al. (2004) Diagn Mol Pathol 13: 1-8. Mayr D, et al. (2009) Histopathology 55: Tsukamoto T, et al. (1991) Int J Dev Biol 35: Wilkinson DG: In Situ Hybridization, A Practical Approach, Oxford University Press (1992) ISBN Marchi: ZytoVision e ZytoDot sono marchi di ZytoVision GmbH. Traduzione della scheda tecnica originale a cura di Bio-Optica S.p.A. distributore ufficiale italiano. Revisione del 07/07/15 Pagina 6 di 6

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