Espressione della variante III dell EGFR nel Glioblastoma multiforme: significato prognostico ed influenza sulla risposta alla temozolomide.

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1 UNIVERSITÀ CATTOLICA DEL SACRO CUORE FACOLTÀ DI MEDICINA E CHIRURGIA A. GEMELLI ISTITUTO DI NEUROCHIRURGIA Relazione finale del progetto di ricerca dal titolo: Espressione della variante III dell EGFR nel Glioblastoma multiforme: significato prognostico ed influenza sulla risposta alla temozolomide. Proponente del progetto: Dr. Quintino Giorgio D Alessandris Dottorando di Ricerca Istituto di Neurochirurgia Università Cattolica del Sacro Cuore Largo A. Gemelli Roma Telefono: Cellulare: Fax: giorgiodal@hotmail.it - 1 -

2 Centri e Ricercatori coinvolti Università Cattolica del Sacro Cuore, Facoltà di Medicina e Chirurgia A. Gemelli, Roma Istituto di Neurochirurgia - Prof. Giulio Maira - Prof. Roberto Pallini (coordinatore del gruppo di ricerca) - Dott. Nicola Montano - Dott. Quintino Giorgio D Alessandris Istituto di Anatomia Patologica - Prof. Luigi Maria Larocca - Dott. Maurizio Martini - Dott.ssa Tonia Cenci Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento di Ematologia, Oncologia e Medicina Molecolare, Roma - Prof. Ruggero De Maria - Dott.ssa Lucia Ricci-Vitiani - Dott.ssa Federica Pelacchi - 2 -

3 Introduzione Il recettore del fattore di crescita epiteliale (EGFR) è un recettore tirosin-kinasico di 170 kda il cui gene è localizzato sul cromosoma 7p11.2. Si tratta di un recettore transmembrana con un dominio extracellulare, i cui ligandi sono il fattore di crescita epiteliale (EGF) ed il transforming growth factor alfa (TGF- ), ed un dominio intracellulare con attività protein-kinasica. Il legame dell EGF al suo recettore ne causa la dimerizzazione, che a sua volta attiva la via di segnalazione che coinvolge la fosfatidilinositolo-3 kinasi (PI3K), il fosfatidilinositolo trifosfato (PIP 3 ) ed infine attiva Akt, una tirosinkinasi fondamentale nella sopravvivenza cellulare e nella resistenza all apoptosi (van den Bent et al, 2007). L amplificazione del gene per l EGFR è l alterazione genetica più comune nel glioblastoma multiforme (GBM) primario, con una frequenza di circa il 40% (Gan et al, 2008). Una percentuale variabile di GBM che overesprimono EGFR (63-75%) presenta inoltre delle mutazioni del gene stesso, fra le quali la più frequente è la cosiddetta variante III (EGFRvIII), nella quale vengono deleti gli esoni dal 2 al 7, causando la perdita di 267 aminoacidi nel dominio extracellulare. Questo recettore mutato, incapace di legarsi al fattore di crescita, risulta però costitutivamente attivato, più resistente ai processi di degradazione intracellulari e probabilmente capace di attivare una maggior numero di vie di segnalazione intracellulari, per l abilità di formare omodimeri o eterodimeri non solo con l EGFR wild-tipe ma anche con altri membri della superfamiglia ErbB (Gan et al, 2008). Infatti, diversi studi sia in vitro che in vivo hanno evidenziato una maggiore capacità di invasione, proliferazione e tumorigenesi nelle cellule EGFRvIII positive (Nikishawa, 1994; Huang, 1997). Ciò premesso, dagli studi clinici su pazienti affetti da GBM non emerge un dato univoco sul significato prognostico dell espressione dell EGFRvIII nel tumore (Tab. 1). In alcuni lavori i pazienti affetti da GBM EGFRvIII positivi sembrano avere una prognosi peggiore (Pelloski et al, 2007); in altri il dato è statisticamente non significativo (Brown et al, 2009); in altri ancora l espressione di EGFRvIII, in associazione con PTEN, una fosfatasi - 3 -

4 importante nell antagonizzare PI3K, appare un fattore predittivo positivo per la risposta ad Erlotinib, un farmaco inibitore tirosin-kinasico (Mellinghoff et al, 2005). Inoltre, dopo lo studio di Stupp et al del 2005, la terapia adiuvante con temozolomide (TMZ, un farmaco alchilante) è diventata uno standard di cura nel GBM, ma non è tuttora chiaro se l espressione di EGFRvIII sia un fattore predittivo di risposta al farmaco. Obiettivi e disegno dello Studio Obiettivo complessivo del progetto è stato analizzare il significato prognostico e predittivo di risposta alla chemioterapia con TMZ dell espressione di EGFRvIII nel GBM. In dettaglio, è stata valutata l espressione di EGFRvIII in 73 pazienti affetti da GBM primario, trattati mediante asportazione chirurgica, radioterapia e chemioterapia concomitante ed adiuvante con TMZ (Stupp et al, 2005) presso l Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore in Roma. Dei 73 pazienti, 14 sono stati rioperati per recidiva tumorale; in questi casi è stato quantificato il livello di EGFRvIII nel tumore primario e nella recidiva. Il dato dell espressione di EGFRvIII è stato correlato con le altre variabili cliniche e biomolecolari e con la sopravvivenza del paziente. Inoltre, è stata correlata l espressione di EGFRvIII con la sensibilità alla chemioterapia con TMZ, mediante analisi in vitro della sensibilità al farmaco di linee cellulari staminali di glioblastoma (GBM CSCs) con differente espressione di EGFRvIII. Materiali e metodi Arruolamento dei pazienti: Sono stati arruolati 73 pazienti affetti da GBM primario di nuova diagnosi, operati presso l Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore - Policlinico Universitario A. Gemelli in Roma. Tutti i pazienti hanno firmato un consenso informato approvato dal Comitato Etico dell Università Cattolica del Sacro Cuore prima dell arruolamento. L età media dei pazienti alla - 4 -

5 diagnosi era 59,9 anni (range: 20-80, deviazione standard 11,4); 45 erano di sesso maschile e 28 femminile. L entità dell asportazione chirurgica è stata valutata sia intraoperatoriamente dal chirurgo sia mediante il controllo RMN encefalo con Gadolinio e.v. ad 1 mese dall intervento. Tutti i pazienti sono stati trattati dopo l intervento con radioterapia sul cavo chirurgico (2 Gy per frazione, una volta al dì, 5 giorni a settimana, dose totale 60 Gy) e TMZ concomitante ed adiuvante (Stupp et al, 2005). Quattordici pazienti (9 di sesso maschile e 5 femminile) sono stati rioperati per recidiva tumorale dopo un intervallo di tempo di 7-58 mesi dalla diagnosi. Di ogni singolo paziente sono stati registrati i seguenti dati: età, sesso, sede e dimensioni del tumore, Karnofsky performance status, classe RPA-RTOG, entità dell asportazione chirurgica (totale o parziale), tempo di recidiva, durata del follow-up. La sopravvivenza globale (overall survival, OS) è stata calcolata come l intervallo di tempo trascorso dal primo intervento chirurgico alla morte o alla fine del follow-up. Analisi dell espressione dell EGFRvIII sul tumore primario (Figura 1): Dopo essere state deparaffinizzate, le sezioni di 10 m di spessore sono state digerite mediante esposizione per tutta la notte a 55 C in 200 µl di TENS 1x (10 mmtris ph 7.4, 10 mm EDTA, 100 mm NaCl, 1% SDS) con 100 mg/ml di proteinasi K; l RNA è stato quindi estrato con RNeasy mini kit (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. Dopo l estrazione dell RNA, il cdna è stato sintetizzato come precedentemente descritto (Martini et al., 2008). I primer e le condizioni di PCR sono analoghe a quelle utilizzate da Yoshimoto et al. (2008). L amplificazione di -actina è stata usata come controllo interno. Analisi quantitativa dell espressione dell EGFRvIII sul tumore primario e sulla recidiva: Nei pazienti rioperati per recidiva, è stata eseguita un analisi quantitativa dell espressione dell EGFRvIII mediante real-time RT-PCR, su campioni di tumore primario e di recidiva microdissezionati con laser, con la tecnica SYBR green chemistry. I reagenti sono stati descritti in un precedente lavoro (Martini et al, 2008)

6 Le condizioni di reazione sono state 95 C per 5 minuti, seguite da 40 cicli a 95 C per 10 secondi e 60 C per 30 secondi, e da 80 cicli a C per ciclo per l analisi della curva di miscelamento in un icycler-iq multicolor Real-Time PCR detection system (Bio-Rad, Milan, Italy). Ogni saggio è stato eseguito tre volte e i dati sono stati processati mediante icycler-iq optical system software (Bio-Rad). -actina è stata utilizzata come riferimento per la normalizzazione dei cambiamenti relativi dell espressione di mrna. La sensibilità della metodica testata nel nostro laboratorio è risultata minore di Analisi della metilazione di MGMT: è stata eseguita sul DNA estratto da sezioni deparaffinizzate di 10 m di spessore, mediante PCR metilazione-specifica per MGMT, come descritto in un precedente lavoro (Pallini et al, 2008). In breve, le sezioni paraffinizzate sono state trattate due volte con xilene, quindi lavate con etanolo. L estrazione del DNA è stata effettuata mediante QIAamp tissue kit (Qiagen, Hilden, Germany) secondo le indicazioni del produttore. Per l estrazione del DNA sono state scelte aree contenenti almeno il 70% di cellule patologiche, per minimizzare la contaminazione da parte delle cellule normali. Il DNA modificato con bisolfito ( ng) è stato amplificato in una miscela contenente 1X PCR buffer [20 mm TRIS (ph 8.3), 50 mmkcl, 1.5 mm MgCl 2 ], dntps (200 mm ognuno), primer (20 pm ognuno), e 0.5 U Taq polimerasi platinum (Invitrogen, Milan, Italy) in un volume finale di of 25 µl. Le condizioni di PCR erano: una denaturazione iniziale a 95 C per 8 min, seguita da 35 cicli a 95 C per 60s, a 60 C per 60s e a 72 C per 60s. I prodotti per la PCR sono stati sottoposti ad elettroforesi in gel di agarosio al 2.5%, colorati con brumuro di etidio e visualizzati mediante illuminazione UV. L analisi MS-PCR è stata ripetuta due volte per tutti i campioni. DNA normale di linfociti ipermetilato con SssI metiltransferasi (New England Biolabs, Beverly, MA) e trattato con bisolfito è stato utilizzato come controllo non metilato e metilato, acqua come controllo negativo e DNA non trattato come controllo interno di PCR. Come gruppo - 6 -

7 di controllo è stata condotta una PCR metilazione-specifica su DNA granulocitario di 10 volontari sani. Analisi dell espressione di Ki67 and PTEN: L analisi immunoistochimica di PTEN è stata effettuata su sezioni tissutali di 3 µm di spessore utilizzando l anticorpo monoclonale murino anti-umano PTEN (clone 28H6, Novo Castra, Newcastle, UK) dopo una fase di smascheramento antigenico in forno a microonde per 10 minuti in tampone citrato (0.01 M; ph 6) a 750 W. Le sezioni sono state quindi incubate in una soluzione di anticorpo primario alla diluizione di 1:50 per 30 minuti. Il perossido d idrogeno, le immunoglobuline sieriche biotinilate e i complessi avidina-biotina sono stati utilizzati in accordo alle istruzioni del produttore (Dako LSAB; Dakopatts, Golstrup, Denmark). Come cromogeno si è usata DAB preparata al momento; come colorante di contrasto è stata impiegata ematossilina. Sono state utilizzate sezioni di milza come controllo positivo, mentre per il controllo negativo non è stato utilizzato l anticorpo primario. È stata effettuata una valutazione semiquantitativa dell espressione di PTEN sulla base dell intensità della colorazione. L espressione immunoistochimica di PTEN è stata considerata positiva quando le cellule tumorali hanno motrato una forte positività nucleare, analoga a quella del controllo positivo, e ridotta quando la colorazione nucleare era assente o ridotta rispetto allo stesso controllo. Con analoga metodica, l indice di proliferazione dei tumori primitivi è stato valutato impiegando l anticorpo monoclonale diretto contro l antigene Ki-67 (MIB-1, Dako), che viene espresso esclusivamente nel nucleo delle cellule in fase proliferativa. Tale indice è stato determinato come la percentuale dei nuclei positivi in rapporto al numero totale di nuclei in 10 campi microscopici non sovrapposti ad alto ingrandimento (400x). Analisi della sensibilità in vitro alla temozolomide: questa analisi è stata eseguita utilizzando GBM CSCs ottenute da pazienti operati presso l Istituto di Neurochirurgia dell Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma. Le condizioni di coltura e la - 7 -

8 metodica di validazione delle GBM CSCs sono state descritte in un precedente lavoro (Pallini et al, 2008). In breve, il campione tumorale dissezionato è stato coltivato in medium privo di siero con l aggiunta dei fattori di crescita EGF e bfgf, ottenendo così cluster cellulari (neurosfere) in uno stato indifferenziato. Il potenziale tumorigenico di queste cellule è stato confermato mediante iniezione sottocutanea o ortotopica in topi immunodeficienti. Per lo studio, sono state utilizzate linee cellulari ad un passaggio compreso fra il 5 ed il 10. Le colture sono state saggiate per l espressione di EGFRvIII con metodica PCR, analogamente a quanto descritto in un precedente paragrafo. Le GBM CSC, dissociate meccanicamente, sono quindi state trattate con TMZ a dosaggio crescente (125 M, 250 M, e 500 M, Schering- Plough, Kenilworth, NJ) dopo 24 ore di incubazione a 37 in 5% CO 2. La vitalità cellulare è stata valutata dopo 24, 48, 72, e 96 ore di trattamento utilizzando Cell Titer Glo luminescent assay (Promega) L espressione di Bcl-XL in due linee cellulari provenienti dal medesimo paziente è stata valutata semiquantitativamente con metodica PCR, utilizzando -actina per normalizzare i risultati. Analisi statistica: è stata effettuata utilizzando i software STATA 10 (StataCorp LP, College Station, TX, USA) e GraphPad-Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Le curve di sopravvivenza sono state disegnate secondo il metodo di Kaplan-Meier e la differenza di sopravvivenza fra gruppi di pazienti è stata condotta utilizzando il test log-rank. La comparazione statistica di variabili continue è stata effettuata mediante Mann-Whitney U-test; la comparazione di variabili discrete è stata eseguita utilizzando la metodica del chi-square, mediante il Fisher s exact test. È stata infine condotta un analisi multivariata per valutare l effetto dei singoli marker molecolari sulla sopravvivenza globale, utilizzando il Cox proportional hazards model, includendo i principali fattori prognostici clinici fra cui età alla diagnosi ( 60 versus > 60 anni), KPS (< 70 versus 70), classe RPA e radicalità chirurgica (asportazione totale versus parziale), e l indice proliferativo (Ki67 20% versus > 20%). Un valore di p minore di 0,05 è stato considerato statisticamente significativo

9 Risultati Obiettivo 1. Valutazione dell impatto dello status di EGFRvIII sulla prognosi Abbiamo valutato l espressione di EGFRvIII nel GBM utilizzando la metodica della RT- PCR; ciò rappresenta un elemento di grande importanza ed originalità del nostro lavoro, in quanto tale metodica ha una sensibilità e specificità nettamente superiori all immunoistochimica, come chiaramente dimostrato da Yoshimoto et al (2008). L espressione di EGFRvII, nella nostra casistica, emerge come un importante fattore prognostico positivo nel GBM (p=0,0023, Tab. 2 e Fig. 2A). Come si è già notato (Tab. 1) precedenti lavori hanno attribuito ad EGFRvIII o un ruolo prognostico negativo o nessun ruolo; dagli studi preclinici è invece noto che EGFRvIII conferisce in vitro ed in modelli animali un vantaggio proliferativo ed una resistenza alla chemioradioterapia. È interessante notare tuttavia che nessuno degli studi che indicano una prognosi peggiore nei pazienti con GBM positivo per EGFRvIII fornisce contestualmente una spiegazione bio-molecolare del dato. È inoltre interessante notare che nella nostra casistica, a differenza di molte delle precedenti, tutti i pazienti sono stati trattati con TMZ, in accordo al protocollo terapeutico di Stupp et al (2005). In un paragrafo successivo studieremo il significato biologico di questa osservazione. Il significato prognostico positivo di EGFRvIII non è legato ad un differente indice proliferativo nelle due coorti di pazienti EGFRvIII positivi e negativi, in quanto l espressione di Ki67 è sovrapponibile nei due gruppi (26,6% ± 13,6% e 25,6% ± 12,3%, rispettivamente; p= 0,75). Analizzando più in dettaglio il significato prognostico positivo di EGFRvIII, abbiamo evidenziato una migliore prognosi nel sottogruppo EGFRvIII positivo / Ki67 20% (p = 0,0275), nel sottogruppo EGFRvIII positivo / normale status di PTEN (p = 0,0223), e nel sottogruppo EGFRvIII positivo / promoter MGMT metilato (p=0,0108). Non sorprende che il sottogruppo di pazienti con GBM EGFRvIII positivo ed un basso indice proliferativo sia prognosticamente favorito. Anche il dato del significato positivo dell associazione fra espressione di EGFRvIII e normale status di - 9 -

10 PTEN appare in linea con le conoscenze di biologia molecolare. PTEN infatti è un inibitore fisiologico del pathway EGFR-PI3K per la sua capacità di defosforilare PIP 3 ; agisce pertanto come un gene oncosoppressore, modulando gli effetti dell attivazione costitutiva di EGFRvIII. Infine, la metilazione del promoter di MGMT è un noto fattore prognostico e predittivo positivo nel GBM. Obiettivo 2. Valutazione degli eventuali fattori clinici che influenzano la prognosi Un età minore o uguale a 60 anni, un KPS maggiore o uguale a 70 ed una classe RPA III o IV emergono nel nostro studio come fattori prognostici positivi statisticamente significativi (p=0,0069, p=0.0035, p=0,0007, rispettivamente; Tab. 2 e Fig. 3) in accordo con le casistiche storiche. L asportazione totale, al contrario, non è associata ad un aumento statisticamente significativo della sopravvivenza, sebbene esista un trend in tal senso (Tab. 2). Tale dato va interpretato nell ambito di un vasto dibattito esistente in letteratura; infatti, sebbene nella maggior parte delle casistiche si dimostri un ruolo prognostico positivo dell asportazione totale, non esistono dati di classe I sull argomento (Kuhnt et al, 2011). Obiettivo 3. Valutazione degli eventuali fattori biomolecolari che influenzano la prognosi Del ruolo prognostico positivo dell espressione di EGFRvIII si è parlato in un precedente paragrafo. L ipermetilazione del promoter di MGMT (p=0,0437) ed un indice proliferativo Ki67 < 20% (p=0,0286) hanno mostrato una ruolo prognostico positivo (Tab. 2 e Fig. 2B-C). Il primo dato è in accordo con lo studio di Stupp et al (2005). Il secondo riveste una notevole importanza, in quanto la letteratura internazionale non è concorde su tale punto (Olson et al., 2009). Lo status di PTEN, da solo, non ha invece un ruolo prognostico nel GBM (Tab. 2)

11 Per confermare i risultati dei primi 3 obiettivi, è stata eseguita un analisi multivariata per la OS, includendo età, KPS, entità dell asportazione chirurgica, Ki67, espressione di EGFRvIII, metilazione del promoter di MGMT e status di PTEN. L età > 60 anni (p=0,0182), un KPS > 70 (p=0,0055), un Ki67<20% (p= 0,0032), e l espressione di EGFRvIII (p=0,0128) si sono confermati fattori prognostici indipendenti per l OS nel GBM. Obiettivo 4. Valutazione della diversa espressione di EGFRvIII nel tumore primario e nella recidiva Quattordici pazienti sono stati sottoposti a reintervento per recidiva di GBM. Il tempo di recidiva variava fra 7 e 58 mesi (mediana: 15 mesi). In questi pazienti è stata condotta un analisi quantitativa dell espressione di EGFRvIII sia nel GBM primario che nella recidiva, con metodica real-time RT-PCR. Come si può evincere dalla Figura 4A, vi è una deplezione media di EGFRvIII nel tumore recidivo rispetto al primario di circa il 50% (range = 40,4%-77,6%, p=0,01). Inoltre, la sopravvivenza dopo la recidiva è in correlazione lineare diretta sia con il valore assoluto di EGFRvIII alla recidiva (p=0,034, Fig. 4B) che con il rapporto fra il valore di EGFRvIII alla recidiva e nel tumore primario (p=0,029). Complessivamente, questi dati indicano che il significato prognostico positivo dell espressione di EGFRvIII si mantiene anche nelle recidive di GBM; peraltro le stesse recidive, avendo sviluppato dei meccanismi di resistenza alle terapie adiuvanti ed avendo per se una prognosi peggiore rispetto al GBM in prima diagnosi, esprimono livelli di EGFRvIII ridotti rispetto al GBM primario. Obiettivo 5. Valutazione dell influenza della terapia con temozolomide sulla prognosi dei pazienti in dipendenza dallo status dell EGFRvIII Come notato in precedenza, tutti i pazienti della nostra casistica, differentemente dalle casistiche storiche, sono stati sottoposti a chemioterapia adiuvante con TMZ. Pertanto, abbiamo ipotizzato che il valore prognostico positivo dell espressione di EGFRvIII fosse

12 dovuto ad una maggiore sensibilità alla chemioterapia con TMZ determinata da questo marcatore biomolecolare. Vi sono dei dati preclinici a sostegno di questa ipotesi, fra cui uno studio che dimostra che cellule di GBM positive per EGFRvIII sono sensibili alla TMZ associata o meno ad un inibitore tirosinkinasico (Johns et al, 2003); inoltre, è noto che le cellule che hanno una cascata oncogenica costitutivamente attiva, come accade in caso di espressione di EGFRvIII, diventano dipendenti da questa cronica stimolazione e possono essere più sensibili ai chemioterapici, con un meccanismo noto come pathway addiction (Weinstein 2002). Per valutare questa ipotesi abbiamo utilizzato coppie appaiate di linee di GBM CSCs, ottenute dalla coltura di differenti aree di un medesimo campione di tumore primario, con l obiettivo di rispecchiare l eterogeneità fenotipica intrinseca nel GBM eliminando il bias legato alle variabilità fra paziente e paziente. Come dimostrato da numerosi gruppi di ricerca, fra cui il nostro, le GBM CSCs rappresentano il migliore modello preclinico per lo studio del tumore, in quanto ne ricapitolano fedelmente le caratteristiche (Pallini et al, 2008). Abbiamo selezionato tre coppie appaiate di linee cellulari provenienti da tre pazienti, con differente espressione di EGFRvIII, MGMT e PTEN. Le prime due coppie erano formate ciascuna da una linea positiva ed una negativa per EGFRvIII, mentre la coppia ottenuta dal terzo paziente era formata da linee entrambe negative per EGFRvIII. I cloni in esame sono stati esposti in vitro a concentrazioni crescenti di TMZ. Inoltre, nelle stesse cellule, è stata valutata l espressione di Bcl-xL, un importante fattore antiapoptotico, prima e dopo l esposizione al chemioterapico. Come si può evincere dalla Figura 5, una concentrazione di TMZ 125 M non è in grado di interferire significativamente con la crescita cellulare; tuttavia, con dosi di TMZ più elevate (fino a 500 M), si osservano un inibizione della crescita ed un tasso di morte cellulare sensibilmente superiori nelle linee positive per EGFRvIII rispetto a quelle negative per lo stesso marcatore. Tale risultato, ottenuto utilizzando le GBM CSCs, dimostra chiaramente che l espressione di EGFRvIII è correlata ad una maggiore sensibilità alla chemioterapia con TMZ. Ad ulteriore conferma di questo dato, come si evince dalla Figura 5B, l espressione di Bcl-xL (normalizzata in rapporto con la -actina)

13 è marcamente ridotta nelle linee cellulari EGFRvIII positive, responsive alla TMZ, contrariamente alle linee EGFRvIII negative, non responsive a TMZ. Bcl-xL è uno dei membri anti-apoptotici della famiglia di Bcl-2, un gruppo di proteine implicato nella regolazione del pathway mitocondriale di apoptosi, importante nella morte cellulare indotta da TMZ (Das et al., 2004). Alcuni lavori pre-clinici hanno mostrato una maggior espressione di Bcl-xL in cellule di GBM immortalizzate (della linea U87) esprimenti EGFRvIII rispetto alla controparte EGFRvIII negativa, sia in condizioni di base (Nagane et al., 1996) che dopo esposizione al chemioterapico cisplatino (Nagane et al., 1998); non vi sono tuttavia in letteratura studi circa la risposta di Bcl-xL all esposizione alla TMZ nel GBM in rapporto all espressione di EGFRvIII. In definitiva, i risultati del nostro studio colmano un vuoto di letteratura, indicando un induzione preferenziale dell apoptosi da parte di TMZ nelle cellule staminali di GBM EGFRvIII positive, mediata da una riduzione di Bcl-xL, ed una resistenza all apoptosi TMZ-relata nel cloni EGFRvIII negativi. Conclusioni dello studio e prospettive di ricerca I dati che abbiamo ottenuto indicano che l espressione della variante costitutivamente attiva di EGFR, EGFRvIII, conferisce al GBM una prognosi migliore. Questo dato, all apparenza contraddittorio, può essere in parte collegato alla maggiore sensibilità e specificità della metodica utilizzata nel nostro studio (RT-PCR) rispetto a quella utilizzata nella maggior parte dei precedenti studi (immunoistochimica). Tuttavia, una valida spiegazione biomolecolare della nostra scoperta risiede nella maggiore sensibilità delle cellule EGFRvIII positive all apoptosi indotta dalla TMZ, come chiaramente evidenziato utilizzando il modello delle GBM CSCs, gold standard della ricerca biologica sui tumori in generale e sul GBM in particolare. Il nostro studio, in linea con i principi della medicina traslazionale, conferma che la determinazione del profilo bio-molecolare del GBM debba essere considerata

14 attualmente lo standard neuro-oncologico, come avviene già da alcuni anni presso la nostra Istituzione. La conoscenza del profilo bio-molecolare del GBM del singolo paziente può infatti migliorare il percorso di cura del paziente stesso, non solo fornendo informazioni più attendibili sulla prognosi, ma in prospettiva contribuendo ad impostare un trattamento chemioterapico individualizzato. Pubblicazioni realizzate con il presente studio I risultati del presente lavoro sono in fase di pubblicazione sulla prestigiosa rivista internazionale Neoplasia (2010 Impact Factor: 5,476). La Fondazione G. Alazio è stata ringraziata tra i finanziatori del lavoro

15 Bibliografia 1. Aldape KD, Ballman K, Furth A, Buckner JC, Giannini C, Burger PC, Scheithauer BW, Jenkins RB, James CD. Immunohistochemical detection of EGFRvIII in high malignancy grade astrocytomas and evaluation of prognostic significance. J Neuropathol Exp Neurol 2004 ; 63: Brown PD, Krishnan S, Sarkaria JN, Wu W, Jaeckle KA, Uhm JH, Geoffroy FJ, Arusell R, Kitange G, Jenkins RB, Kugler JW, Morton RF, Rowland KM Jr, Mischel P, Yong WH, Scheithauer BW, Schiff D, Giannini C, Buckner JC; North Central Cancer Treatment Group Study N0177. Phase I/II trial of erlotinib and temozolomide with radiation therapy in the treatment of newly diagnosed glioblastoma multiforme: North Central Cancer Treatment Group Study N0177. J Clin Oncol Dec 1;26(34): Das A, Banik NL, Patel SJ, Ray SK. Dexamethasone protected human glioblastoma U87MG cells from temozolomide induced apoptosis by maintaining Bax:Bcl-2 ratio and preventing proteolytic activities. Mol Cancer 2004 Dec 8; 3(1): Eramo A, Ricci-Vitiani L, Zeuner A, Pallini R, Lotti F, Sette G, Pilozzi E, Larocca LM, Peschle C, De Maria R. Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells. Cell Death Differ Jul;13(7): Eramo A, Pallini R, Lotti F, Sette G, Patti M, Bartucci M, Ricci-Vitiani L, Signore M, Stassi G, Larocca LM, Crinò L, Peschle C, De Maria R. Inhibition of DNA methylation sensitizes glioblastoma for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-mediated destruction. Cancer Res Dec 15; 65(24):

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22 Figure e Tabelle Figura 1. RT-PCR per la valutazione dell espressione di EGFRvIII su tessuto tumorale paraffinizzato fissato in formalina. (A) RT-PCR per EGFRvIII eseguita su otto casi esemplificativi di GBM; EGFRvIII è positiva nei campioni 1, 4 e 5. I controlli negativo (-) e positivo (+) sono costituiti rispettivamente da acqua e plasmide contenente EGFRvIII. MW, molecular weight marker. (B) Tratto della sequenza di cdna di EGFRvIII mostrante la delezione degli esoni 2-7 caratteristica di EGFRvIII

23 Figura 2. Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per l espressione di EGFRvIII (A), per la metilazione del promoter di MGMT (B) e per l espressione di Ki67 (C) nell intera popolazione in studio. Figura 3. Curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per l età (A), il performance status (B) e la classe RPA (C) nell intera popolazione in studio