TheraScreen : K-RAS Mutation Kit Per la determinazione di 7 mutazioni nel gene K-RAS

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1 Per la determinazione di 7 mutazioni nel gene K-RAS Destinato all'uso con Roche LightCycler 480 Real-Time PCR (Instrument II) (n. di catalogo: ) e con Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR System (n. parte: ) Include il manuale dell'utente pubblicato da Roche Diagnostics e intitolato LightCycler Adapt Software v1.1 for the TheraScreen : K-RAS Mutation Kit CE-IVD (n. di catalogo: ) Istruzioni per l'uso Codici dei prodotti Formato del kit Codice prodotto DxS Numero ordine Roche Diagnostics 20 reazioni KR reazioni KR Versione delle istruzioni: DU001g Data di revisione: Maggio 2009 Conservare tra -18 C e -25 C Pagina 1 di 40

2 Indice generale 1. Uso previsto / Indicazioni per l'uso Riassunto e spiegazione del test Principi della procedura Reagenti AVVERTENZE E PRECAUZIONI Conservazione, stabilità e condizioni di spedizione Strumento Campioni Protocollo per la determinazione delle mutazioni K-RAS Limiti del test Prestazioni dei saggi Assistenza tecnica Informazioni su produttori e distributori Data di pubblicazione dell'ultima revisione Riferimenti bibliografici Note per l'acquirente: Pagina 2 di 40

3 IMPORTANTE: prima dell'uso, leggere attentamente queste istruzioni e studiare le caratteristiche dei componenti del kit K-RAS. 1. Uso previsto / Indicazioni per l'uso Uso previsto DxS (in breve, il kit K-RAS) è un test diagnostico in vitro che consente di identificare sette mutazioni somatiche nell'oncogene K-RAS e di eseguire una valutazione qualitativa dello stato mutazionale. Il kit K-RAS è destinato esclusivamente a professionisti qualificati e deve essere utilizzato in ambiente di laboratorio su campioni di DNA estratti da tessuto colorettale fissato in formalina e incluso in paraffina. Indicazioni per l'uso I risultati del kit K-RAS possono aiutare il medico a identificare i pazienti con carcinoma colorettale che potrebbero non trarre beneficio da una terapia anti-egfr, ovvero con inibitori del recettore del fattore di crescita epidermico quali panitumumab o cetuximab. Il kit K-RAS non è destinato all'uso per la diagnosi del carcinoma colorettale. Insieme ad altri importanti fattori prognostici, consente di selezionare i pazienti idonei al trattamento con terapie anti-egfr in base al loro specifico stato mutazionale. Per scegliere la terapia più idonea, il medico dovrà tenere conto sia dello stato mutazionale del paziente, sia di tutti gli altri fattori patologici. Nessuna decisione sulla terapia dei pazienti oncologici dovrebbe basarsi unicamente sullo stato mutazionale del gene K-RAS. 2. Riassunto e spiegazione del test Il kit K-RAS è un dispositivo diagnostico con marchio CE, conforme alla Direttiva Europea sui dispositivi medico-diagnostici in vitro (IVDD 98/79/EC). Spesso nei carcinomi umani vengono riscontrate mutazioni dell'oncogene K-RAS (1-4). La presenza di tali mutazioni è correlata all'assenza di una risposta a determinate terapie antitumorali basate sugli inibitori del recettore del fattore di crescita epidermico (terapie anti-egfr) nei pazienti con carcinoma colorettale metastatico (5-10)(14-21). È possibile identificare sette mutazioni nel gene K-RAS su uno sfondo di DNA genomico wild-type utilizzando un saggio PCR real-time basato sulla tecnologia DxS Scorpions. Si tratta di un metodo estremamente selettivo. Se il numero di copie di DNA è sufficiente, è possibile determinare circa l'1% dei mutanti su uno sfondo di DNA genomico wild-type. Il kit K-RAS è in grado di identificare sette mutazioni K-RAS nei codoni 12 e 13 dell'oncogene K-RAS, come riportato nella Tabella 1. Pagina 3 di 40

4 Tabella 1. Mutazioni K-RAS rilevate dal kit DxS La fonte degli ID COSMIC è il Catalogue of Somatic Mutations in Cancer: Mutazione Cambiamento delle basi ID Cosmic Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) Principi della procedura Per identificare le mutazioni, il kit K-RAS utilizza i saggi PCR real-time associando due diverse tecnologie: ARMS e Scorpions. (11, 12, 13) ARMS La tecnologia ARMS supporta l'amplificazione di specifici alleli o mutazioni. La Taq DNA polimerasi è estremamente efficace per distinguere tra un appaiamento corretto e un appaiamento errato all'estremità in 3 di un primer per PCR. È possibile eseguire un'amplificazione selettiva di specifiche sequenze mutate anche in campioni in cui le sequenze non mutate sono la maggioranza, in quanto: Quando il primer è perfettamente appaiato, l'amplificazione procede con la massima efficienza. Quando la base in 3 presenta un appaiamento errato, si osserva soltanto un'amplificazione di basso livello sullo sfondo. Scorpions La tecnologia Scorpions consente di identificare il risultato dell'amplificazione. Il termine Scorpions è utilizzato per descrivere molecole a doppia funzione che contengono un primer per PCR legato covalentemente a una sonda. Il fluoroforo in questa sonda interagisce con un colorante quencher, anch'esso incorporato nella sonda, che sopprime la fluorescenza. Quando si verifica una reazione PCR e la sonda si lega all'amplicon, il fluoroforo e il quencher si separano, determinando un aumento della fluorescenza proveniente dalla provetta della reazione. Analisi dei dati: metodo Ct Nei saggi real-time Scorpions, il numero di cicli di PCR necessari per rilevare un segnale fluorescente al di sopra del segnale dello sfondo è il parametro con cui vengono misurate le molecole bersaglio presenti all'inizio della reazione. Il punto nel quale il segnale è al di sopra della fluorescenza dello sfondo è denominato "ciclo soglia" (cycle threshold, Ct). Pagina 4 di 40

5 Per conoscere i valori Ct dei campioni si calcola la differenza tra il valore Ct del saggio di mutazione e il valore Ct del saggio di controllo per lo stesso campione. I campioni vengono classificati come positivi alla mutazione se restituiscono un valore Ct inferiore al valore Ct 1% per il saggio. Al di sopra di questo valore, significa che il campione potrebbe contenere meno dell'1% di mutanti (non rientra nel limite di sensibilità dei saggi) oppure non contenere nessun mutante. L'uso dei primer ARMS non esclude che possa verificarsi un innesco inefficiente e che, di conseguenza, il valore Ct dello sfondo nel DNA privo di mutanti possa arrivare con un ritardo significativo. Tutti i valori Ct calcolati dall'amplificazione dello sfondo saranno maggiori dei valori Ct 1% e il campione verrà classificato come negativo alle mutazioni. Il kit K-RAS ha ottenuto il marchio CE per l'uso diagnostico in vitro con Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR (Instrument II) a 96 pozzetti (n. di catalogo Roche: ) e Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR (n. di parte: ) (per brevità strumento LightCycler 480 e strumento ABI7500). Nel caso dello strumento LightCycler 480, il kit K-RAS deve essere utilizzato con l'applicazione LightCycler Adapt Software v1.1 for the TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD (software LightCycler Adapt). Questo software è stato sviluppato per automatizzare la classificazione dei diagrammi di amplificazione in positivi o negativi e per calcolare una soglia adeguata dalla quale sia possibile ottenere i valori Ct. Tali valori vengono utilizzati per calcolare i valori Ct dei campioni, che a loro volta vengono confrontati con i valori di cut-off dell'1%. Il software genera un risultato di positività o di negatività alle mutazioni, rendendo totalmente oggettiva l'analisi e l'interpretazione dei dati ottenuti con il kit K-RAS. Formato del kit K-RAS Il kit K-RAS contiene otto saggi. Un saggio di controllo. Sette saggi di mutazione. Tutte le miscele di reazione contengono un saggio di controllo esogeno, o controllo interno, marcato con HEX (rilevato dal colorante JOE nel sistema ABI7500). In questo modo viene monitorata la presenza di eventuali inibitori, che potrebbero indurre risultati falsi negativi. Saggio di controllo Il saggio di controllo, marcato con FAM, serve per ottenere una valutazione del DNA totale in un campione. Il saggio di controllo amplifica una regione dell'esone 4 del gene K-RAS. I primer e la sonda sono stati formulati in modo da evitare qualsiasi polimorfismo noto del gene K-RAS. Pagina 5 di 40

6 Saggi di mutazione Ogni saggio di mutazione, marcato con FAM, contiene una molecola Scorpion e un primer ARMS che consentono di distinguere il DNA wild-type dall'eventuale DNA mutante rilevato con il saggio PCR real-time. 4. Reagenti Il kit K-RAS contiene un numero di reagenti sufficiente per eseguire la valutazione qualitativa dei campioni ed eseguire i saggi K-RAS per un massimo di 20 o 80 reazioni, a seconda del formato del kit. Formato del kit Codice prodotto DxS Numero ordine Roche Diagnostics 20 reazioni KR reazioni KR Il numero di campioni che è possibile analizzare varia in base alle dimensioni del lotto. Tabella 2. Contenuto del kit K-RAS Reagenti forniti 20 reazioni 80 reazioni Volume Volume Provetta Miscela reazione di controllo 1300 µl 5200 µl 1 Miscela di reazione 12ALA 650 µl 2600 µl 2 Miscela di reazione 12ASP 650 µl 2600 µl 3 Miscela di reazione 12ARG 650 µl 2600 µl 4 Miscela di reazione 12CYS 650 µl 2600 µl 5 Miscela di reazione 12SER 650 µl 2600 µl 6 Miscela di reazione 12VAL 650 µl 2600 µl 7 Miscela di reazione 13ASP 650 µl 2600 µl 8 Miscela standard 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA polimerasi 60 µl 240 µl 10 Strumenti e reagenti non forniti con il kit K-RAS I seguenti strumenti e materiali di consumo devono essere reperiti personalmente dall'utente: Strumento LightCycler 480 o sistema ABI7500 Real-time PCR, in grado di eseguire le procedure descritte nel paragrafo 9; protocollo per la determinazione delle mutazioni K-RAS. LightCycler Adapt Software v1.1 di Roche Diagnostics (n. di catalogo ). Piastre per PCR prive di DNAsi da 0,2 ml: piastra a 96 pozzetti per lo strumento LightCycler 480 (n. di cat ) o piastra di reazione a 96 pozzetti ABI MicroAmp Optical (n. parte ) con pellicola adesiva MicroAmp Optical (n. parte ). Provette sterili per la preparazione delle soluzioni Master Mix. Pipette dedicate per la preparazione della miscela per PCR. Pipette dedicate per la distribuzione del DNA templato. H20 sterile, priva di nucleasi. Pagina 6 di 40

7 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI Per uso diagnostico in vitro. Il kit K-RAS non è destinato all'uso per le finalità di screening o diagnosi di nessun tipo di carcinoma, neppure del carcinoma colorettale. Può essere utilizzato contestualmente ad altri importanti fattori prognostici per selezionare i pazienti che potrebbero non trarre beneficio da una terapia oncologica anti-egfr. La scelta della terapia per i pazienti oncologici non deve essere basata esclusivamente sullo stato mutazionale del gene K-RAS. Il medico dovrà tenere conto dello stato mutazionale del paziente e di altri fattori patologici. È possibile congelare/scongelare il contenuto del kit K-RAS fino a 8 volte senza compromettere le prestazioni dei saggi. NON congelare/ scongelare i reagenti del kit K-RAS più di 8 volte. Tenere presente che i campioni tumorali sono disomogenei, pertanto è possibile che i dati ottenuti da un campione siano discordanti dai dati ottenuti per altre sezioni dello stesso tumore. Inoltre i campioni tumorali possono contenere tessuto non tumorale. Si presuppone che il DNA del tessuto non tumorale non contenga le mutazioni K-RAS che vengono rilevate dal kit K-RAS. Tutti i saggi inclusi nel kit K-RAS generano prodotti della PCR corti, tuttavia il kit K-RAS non funzionerà se il DNA è fortemente frammentato. La valutazione del DNA dovrebbe basarsi sulla reazione PCR e potrebbe differire dalla quantificazione, che si basa piuttosto sulle letture della densità ottica. La miscela di reazione in eccedenza viene fornita per la valutazione qualitativa e quantitativa del DNA nei campioni, da eseguire prima dell'analisi con il kit K-RAS. I reagenti del kit K-RAS sono stati diluiti con rapporto ottimale. L'ulteriore diluizione dei reagenti è sconsigliata, in quanto potrebbe provocare un deterioramento delle prestazioni. L'uso di volumi inferiori a 25 µl per le reazioni è sconsigliato, in quanto si potrebbe assistere ad un aumento dei falsi negativi. Tutti i reagenti del kit K-RAS sono formulati in modo specifico per l'uso con i test indicati. Evitare di sostituire i reagenti del kit K-RAS, in caso contrario non saranno più garantite prestazioni ottimali. Per garantire attività e prestazioni ottimali, evitare l'esposizione diretta alla luce dei primer Scorpions per prevenire il loro fotodecadimento. Questa regola vale in generale per tutte le molecole marcate con fluorescenza. Pagina 7 di 40

8 Adoperare la massima cautela per evitare la contaminazione delle reazioni PCR con il materiale di controllo sintetico. Si raccomanda di utilizzare pipette differenti e dedicate durante la preparazione delle miscele di reazione e l'aggiunta del DNA templato. Dedicare un'area del laboratorio alla preparazione e alla distribuzione delle miscele di reazione nelle provette e un'area separata all'aggiunta del templato. Non aprire mai le provette dopo una reazione PCR. Ognuno dei saggi inclusi nel kit K-RAS possiede caratteristiche proprie. Quando si calcola il risultato, è necessario fare riferimento ai parametri corretti del saggio specifico (vedere il paragrafo relativo ai report e all'interpretazione dei dati). Valori Ct di mutazione maggiori di o uguali a 38 dovranno essere considerati negativi o al di sotto dei limiti di sensibilità del kit. I saggi contengono una reazione di controllo esogena, definita controllo interno, oltre alla reazione di interesse specifico (vedere il paragrafo relativo ai principi della procedura). Se entrambi i saggi falliscono, i dati devono essere scartati per la possibile presenza di inibitori in grado di indurre risultati falsi negativi. È possibile ridurre l'effetto degli inibitori diluendo il campione, tuttavia in questo modo anche il DNA verrebbe diluito. È necessario adottare tutte le normali precauzioni del laboratorio, tra le quali: a) Non pipettare per bocca. b) Non fumare, mangiare o bere nelle aree in cui vengono manipolati i campioni o i reagenti del kit. c) Lavarsi le mani dopo avere eseguito il test. Utilizzare esclusivamente la Taq polimerasi (per brevità, Taq) inclusa nel kit, evitando di sostituirla con Taq di altri kit, anche dello stesso tipo, o con Taq di altri produttori. Scongelare soltanto i reagenti che saranno utilizzati nella seduta imminente, evitando di scongelare l'intero kit tutte le volte per limitare al minimo i cicli di congelamento/scongelamento. Informazioni per la sicurezza Attenzione: tutto il materiale chimico e biologico deve essere considerato potenzialmente pericoloso. I campioni sono potenzialmente infettivi e come tali devono essere trattati. L'uso del kit K-RAS è riservato in modo esclusivo a personale qualificato e opportunamente addestrato nelle tecniche di laboratorio. Per adoperare i componenti di questo kit K-RAS è necessario indossare un camice da laboratorio idoneo, guanti monouso e occhiali protettivi. Dopo l'uso, trattare i componenti del kit K-RAS adottando tutte le procedure previste per lo smaltimento dei rifiuti clinici. Pagina 8 di 40

9 6. Conservazione, stabilità e condizioni di spedizione Conservazione Subito dopo la consegna, riporre l'intero contenuto del kit K-RAS in un congelatore termoregolato e conservarlo tra -18 C e -25 C al buio. Evitare di congelare/scongelare inutilmente il contenuto del kit K-RAS. Stabilità Non utilizzare il kit K-RAS dopo la data di scadenza indicata. Il contenuto del kit K-RAS resta stabile fino alla data di scadenza, se conservato nelle condizioni indicate e nella sua confezione originale. È possibile congelare/scongelare il contenuto del kit K-RAS fino a 8 volte senza compromettere le prestazioni dei saggi. NON congelare/scongelare i reagenti del kit K-RAS più di 8 volte. Condizioni di spedizione Durante la spedizione il contenuto del kit K-RAS è conservato in ghiaccio secco, pertanto dovrà essere ancora congelato alla consegna. Se il contenuto del kit K-RAS non dovesse essere congelato alla consegna, o se la confezione esterna dovesse essersi aperta durante il tragitto, o se la scatola non dovesse contenere la nota di accompagnamento, le istruzioni per l'uso o i reagenti, contattare immediatamente il centro Roche Diagnostics più vicino (vedere il paragrafo 12 relativo all'assistenza tecnica). 7. Strumento Per istruzioni complete sull'installazione e il funzionamento dello strumento da utilizzare per la PCR real-time, consultare il manuale dell'utente dello strumento in dotazione. 8. Campioni Il materiale campione deve essere costituito da DNA genomico umano estratto da campioni di carcinoma colorettale inclusi in paraffina e fissati in formalina. Prelievo e preparazione dei campioni 1. Trasporto dei campioni: metodologia di patologia standard, per garantire la qualità dei campioni. 2. Processo consigliato per l'estrazione dei campioni: estrazione del DNA con Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (n. di catalogo 56404). È necessario apportare le seguenti modifiche al protocollo Qiagen: Le sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina (campioni FFPE) devono essere raccolte in vetrini di vetro. La paraffina in eccesso attorno alle sezioni tissutali deve essere raschiata via con uno scalpellino sterile nuovo. Pagina 9 di 40

10 Per raschiare il materiale della sezione tissutale nelle microprovette per centrifuga, servirsi di uno scalpellino nuovo per ogni campione da estrarre. La digestione con Proteinasi K deve poter essere portata a termine e potrebbe durare fino a 48 ore. I campioni devono essere eluiti su 200 µl di tampone ATE (incluso nel kit di estrazione Qiagen). Qualsiasi metodo alternativo per la preparazione dei campioni dovrà essere testato e convalidato dall'utente finale. 3. Conservazione del DNA estratto: a -20 C, prima dell'analisi. Protocollo per la valutazione dei campioni La miscela del saggio di controllo in eccedenza, fornita nel kit K-RAS, deve essere obbligatoriamente utilizzata per eseguire la valutazione del DNA totale nei campioni. Il saggio di controllo amplifica una regione dell'esone 4 del gene K-RAS. Preparare i campioni soltanto con il saggio di controllo, utilizzando la miscela standard come controllo positivo e l'acqua come controllo privo di templato. Notare che, per un uso ottimale dei reagenti del kit K-RAS, è opportuno raggruppare i campioni in batch. I controlli devono essere inclusi in tutte le sedute analitiche. Se si analizzano i campioni uno ad uno, il consumo di reagenti aumenta e, di conseguenza, il numero di campioni che è possibile analizzare con il kit K-RAS diminuisce. Protocollo per la valutazione dei campioni: preparazione della piastra 1. Scongelare la miscela di controllo e la miscela standard contenute nel kit K-RAS, equilibrandole a temperatura ambiente. Miscelare ogni soluzione capovolgendo le provette 10 volte ciascuna, dopo lo scongelamento, in modo da prevenire la concentrazione localizzata di sali. Preparare una quantità sufficiente di soluzioni per analizzare i campioni di DNA, una reazione della miscela standard e una reazione del controllo senza templato, quindi aggiungere 2 reazioni extra. 2. Preparare la soluzione Master Mix facendo riferimento ai volumi dei reagenti indicati nella Tabella 3. Tabella 3. Volumi di Master Mix per il saggio di controllo Saggio Saggio di controllo Master Mix Miscela di Taq (µl)x1 reazione (µl)x1 19,8 0,2 3. NON agitare in vortex la Taq, né le altre miscele di reazione che contengono Taq, altrimenti l'enzima potrebbe inattivarsi. Pagina 10 di 40

11 4. Prima dell'uso, assicurarsi che la Taq abbia raggiunto la temperatura ambiente. Centrifugare la fiala affinché tutta la Taq si raccolga sul fondo, quindi pipettare inserendo il puntale della pipetta appena sotto la superficie della Taq, limitando così il rischio che il puntale si cosparga eccessivamente di Taq. 5. Miscelare la soluzione Master Mix pipettando delicatamente su e giù. 6. Aggiungere immediatamente 20 µl di Master Mix di controllo in ogni pozzetto di reazione. 7. Aggiungere immediatamente 5 µl di campione, miscela standard o acqua (per i controlli senza templato) nei pozzetti di reazione. 8. La piastra deve essere preparata prima, aggiungendo la miscela standard nel pozzetto A1 e il controllo senza templato (acqua) nel pozzetto A2. Tutti gli altri pozzetti utilizzati devono contenere i campioni. 9. Sigillare e centrifugare brevemente la piastra per PCR in modo che i reagenti si raccolgano sul fondo dei pozzetti. 10. Configurare lo strumento facendo riferimento alle istruzioni specifiche della piattaforma in uso. Protocollo per la valutazione dei campioni: impostazione dello strumento LightCycler Inserire immediatamente la piastra nello strumento LightCycler Selezionare l'icona del software LightCycler 480 sul desktop della stazione di lavoro collegata allo strumento. Eseguire la connessione al software e, nella schermata Overview, selezionare New Experiment from Template. Selezionare K-RAS LC480II Run Template nell'elenco dei modelli forniti per la seduta. I parametri del modello in questione sono: 1. Formato di rilevazione: DxS IVD Assays. 2. Volume della reazione: Una fase iniziale di sospensione a 95 C per 4 minuti. 4. Un'amplificazione a 2 fasi per 45 cicli, con una denaturazione a 95 C di 30 secondi e un appaiamento a 60 C di 1 minuto. Una sola acquisizione della fluorescenza nella fase a 60 C. 3. Selezionare la scheda Sample Editor e per Step 1: Select Workflow attivare la casella Abs Quant. Per Select Filter Combinations verificare che entrambi i filtri siano selezionati ( nm e nm). Definire i nomi dei campioni in Step 2 e in Step 3. Impostare Quantification Sample Type su unknown. La colonna dei replicati deve rimanere vuota. Pagina 11 di 40

12 4. Selezionare il pulsante Experiment, quindi fare clic su Start Run per salvare l'esperimento e avviare i cicli. 5. Al termine della seduta selezionare la scheda Analysis e scegliere Abs Quant/2nd Derivative Max nella schermata Create New Analysis. Accettare i valori predefiniti della schermata Create New Analysis. Assicurarsi che il pulsante Filter Comb sia e selezionare il pulsante Calculate. I valori Ct vengono visualizzati nella tabella Samples. 6. Selezionare il pulsante Filter Comb e cambiare i filtri impostando nm. Selezionare il pulsante Calculate e ottenere i valori Ct del controllo esogeno dalla tabella Samples. Protocollo per la valutazione dei campioni: impostazione dello strumento ABI Inserire immediatamente la piastra nello strumento ABI Selezionare l'icona del software del sistema 7500 sul desktop della stazione di lavoro collegata allo strumento. Aprire un nuovo file della seduta nel menu File del software 7500 Sequence Detection, versione Per Assay selezionare Standard Curve (Absolute Quantification). Per Run Mode selezionare Standard Selezionare il pulsante Next per visualizzare una schermata in cui è possibile impostare i rilevatori. Aggiungere all'elenco un rilevatore FAM e un rilevatore JOE, senza impostare i soppressori (Quenchers = none ). Se i rilevatori non esistono già, selezionare il pulsante New Detectors per impostare un rilevatore FAM e un rilevatore JOE con il soppressore impostato su none. 5. Impostare Passive Reference su None e selezionare il pulsante Next. 6. Selezionare l'intera piastra e attivare le caselle relative ai rilevatori FAM e JOE, in modo da garantire che siano monitorati entrambi i coloranti in ogni pozzetto. Selezionare il pulsante Finish. 7. Impostare i cicli nella scheda Instrument (vedere la Tabella 4). Tabella 4. Condizioni per i cicli sullo strumento ABI7500 Temperatura Durata Cicli Raccolta dati Fase 1 95 o C 4 min 1 Fase 2 95 o C 30 sec 60 o C 1 min 40 FAM, JOE Pagina 12 di 40

13 8. Selezionare il pulsante Start per salvare l'esperimento e avviare i cicli. 9. Al termine della seduta assicurarsi che il riferimento passivo sia impostato su none nella schermata di ispezione dei pozzetti. Nella scheda Amplification Plot selezionare tutti i pozzetti in uso e quindi selezionare il colorante JOE nell'elenco dei rilevatori. 10. Controllare il segnale JOE proveniente da ogni campione e confrontarlo con il segnale JOE nel pozzetto del controllo senza templato (NTC). Prendere nota di eventuali campioni la cui curva di amplificazione sia in ritardo o la cui amplificazione sia fallita per il controllo esogeno rispetto al controllo NTC. 11. Nella scheda Amplification Plot selezionare tutti i pozzetti in uso e quindi selezionare il colorante FAM nell'elenco dei rilevatori. 12. Utilizzare l'impostazione automatica della linea di base e il valore Ct manuale, quindi impostare la soglia manualmente al centro della fase esponenziale utilizzando la scala logaritmica per l'asse Y, come descritto nella guida dell'utente dello strumento ABI Selezionare il pulsante Analyse per ottenere i valori Ct. Interpretazione della valutazione dei campioni Valutare i valori Ct del controllo NTC per verificare che non vi siano contaminazioni in grado di indurre un'amplificazione positiva nel canale FAM (Ct < 40) o una reazione fallita del controllo esogeno nel canale HEX (nessun valore Ct), che indicherebbero un problema di impostazione. La miscela standard dovrebbe generare un Ct del saggio di controllo (canale FAM) compreso tra 26 e 29 sullo strumento ABI7500 e 29 sullo strumento LightCycler 480. Scartare i dati se uno di questi 2 controlli della seduta fallisce. Ct del saggio di controllo tra 29 e 35: interpretare i dati con cautela, poiché le mutazioni di livello molto basso potrebbero non essere rilevate. Ct del saggio di controllo tra 35 e 38: nei campioni sono presenti poche copie di DNA amplificabile, mentre le mutazioni possono essere osservate più facilmente quando la maggior parte delle copie è mutata. Ct del saggio di controllo 38: respingere il campione, poiché il DNA è insufficiente e il kit K-RAS non sarà in grado di rilevare le mutazioni. Tenere presente che, se un campione restituisce un Ct del saggio di controllo in ritardo, è necessario confrontare il Ct del saggio di controllo esogeno con il controllo esogeno del controllo NTC. Se, dal confronto con il controllo NTC, il controllo esogeno del campione dovesse risultare in ritardo o negativo, è possibile che sia presente un inibitore. L'effetto di un inibitore può essere ridotto diluendo il campione, tuttavia in questo modo verrebbe diluito anche il DNA. Pagina 13 di 40

14 Diluizione dei campioni: un valore Ct di controllo < 24 provocherà un sovraccarico nei saggi di mutazione. I campioni con Ct di controllo < 24 devono essere diluiti. Tenere presente che, nel caso dello strumento LightCycler 480, i valori Ct ottenuti con il metodo della derivata 2 a potrebbero differire leggermente dai valori ottenuti con il software LightCycler Adapt. È consigliabile diluire i campioni concentrati per riportarli nell'intervallo >24 e < 29 (valori Ct basati sul software 7500 Sequence Detection o sul software LightCycler 480 Instrument), tenendo conto che a una diluizione di ½ punto corrisponderà un aumento del valore Ct di 1 punto. 9. Protocollo per la determinazione delle mutazioni K-RAS Prima dell'uso, leggere attentamente queste istruzioni e studiare le caratteristiche dei componenti del kit K-RAS. Per un uso efficiente del kit K-RAS, è opportuno raggruppare i campioni in batch di 10 unità (in modo da riempire una piastra da 96 pozzetti). Se si utilizzano batch più piccoli, il numero di campioni che sarà possibile analizzare con il kit K-RAS diminuirà. Impostazione degli esperimenti sullo strumento LightCycler 480 Per ogni campione di DNA è necessario analizzare i saggi di controllo e i saggi di mutazione nella stessa seduta PCR, al fine di evitare eventuali variazioni tra le sedute. 1. Scongelare le miscele di reazione e standard contenute nel kit K-RAS, equilibrandole a temperatura ambiente. Miscelare ogni soluzione capovolgendo le provette 10 volte ciascuna, dopo lo scongelamento, in modo da prevenire la concentrazione localizzata di sali. Preparare soluzioni sufficienti per i campioni di DNA, la miscela standard e i controlli NTC, oltre a 2 reazioni extra per ogni miscela (vedere la Tabella 5). Tabella 5. Volumi di Master Mix K-RAS Saggio Saggio di controllo Saggi di mutazione Miscela di reazione (µl)x1 Master Mix Miscela di Taq (µl)x1 reazione (µl) per piastra (x14) Taq (µl) per piastra (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NON agitare in vortex la Taq, né le altre miscele di reazione che contengono Taq, altrimenti l'enzima potrebbe inattivarsi. Pagina 14 di 40

15 3. Prima dell'uso, assicurarsi che la Taq abbia raggiunto la temperatura ambiente. Centrifugare la fiala affinché tutta la Taq si raccolga sul fondo, quindi pipettare inserendo il puntale della pipetta appena sotto la superficie della Taq per limitare il rischio che il puntale si cosparga eccessivamente di Taq. 4. Miscelare le soluzioni Master Mix pipettando delicatamente su e giù. 5. Aggiungere immediatamente 20 µl di Master Mix nei pozzetti di reazione. 6. Aggiungere immediatamente 5 µl di campione, miscela standard o acqua (per i controlli senza templato) nei pozzetti di reazione. È necessario analizzare ogni campione di DNA sia con i saggi di controllo che con tutti i saggi di mutazione. La configurazione della piastra è illustrata nella Tabella 6. Tabella 6. Configurazione della piastra per il kit K-RAS Configurazione a 96 pozzetti Saggio A Miscela NTC standard Controllo B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Miscela standard Miscela standard Miscela standard Miscela standard Miscela standard Miscela standard Miscela standard NTC 1 NTC 1 NTC 1 NTC 1 NTC 1 NTC 1 NTC Sigillare e centrifugare brevemente la piastra per PCR in modo che i reagenti si raccolgano sul fondo dei pozzetti. 8. Inserire immediatamente la piastra nello strumento LightCycler 480. Impostazione dello strumento LightCycler Selezionare l'icona del software LightCycler 480 sul desktop della stazione di lavoro collegata allo strumento. Eseguire la connessione al software e, nella schermata introduttiva, selezionare New Experiment from Template. Pagina 15 di 40

16 2. Scegliere K-RAS LC480II Run Template nell'elenco Run Templates (per ulteriori dettagli, vedere il paragrafo relativo alla valutazione dei campioni con lo strumento LightCycler 480). 3. Selezionare la scheda Sample Editor e per Step 1: Select Workflow attivare la casella Abs Quant. Per Select Filter Combinations verificare che entrambi i filtri siano selezionati ( nm e nm). Definire i nomi dei campioni in Step 2 e Step 3. Il nome del campione nella colonna 1 deve essere Mixed Standard (miscela standard). Il nome del campione nella colonna 2 deve essere NTC (controllo senza templato). Immettere i nomi dei campioni nelle colonne da 3 a 12. I nomi devono essere identici per tutti i pozzetti in una colonna. L'impostazione di Quantification Sample Type deve essere unknown. La colonna dei replicati deve rimanere vuota, in quanto i replicati non vengono presi in esame dal software LightCycler Adapt. 4. Selezionare il pulsante Experiment, quindi fare clic su Start Run per salvare l'esperimento e avviare i cicli. Analisi dei campioni con lo strumento LightCycler Al termine della seduta con lo strumento LightCycler 480, utilizzare la schermata di navigazione per esportare l'esperimento (file con estensione IXO) in una posizione sicura e accessibile dal software LightCycler Adapt. 2. IMPORTANTE: il software LightCycler Adapt è collaudato per l'uso su un unico sistema di computer, definito come singola unità di controllo (stazione di lavoro) e fornito da Roche Diagnostics per essere utilizzato esclusivamente con LightCycler 480 Instrument II. Per il momento è stato approvato soltanto l'uso del software LightCycler Adapt con un'unità di controllo di tipo standalone (un computer non collegato a una rete). Non è consentito utilizzare altri computer, poiché le prestazioni del software potrebbero diventare imprevedibili. 3. Aprire il software LightCycler Adapt facendo clic sull'icona del software LightCycler Adapt sul desktop della stazione di lavoro, quindi immettere il nome utente nel campo appropriato. Il nome utente specificato in questa schermata verrà utilizzato per identificare l'autore del report. 4. Nella finestra principale utilizzare il pulsante di ricerca per selezionare un file della seduta per lo strumento LightCycler 480 (per annullare una selezione, è necessario chiudere e riavviare il software). 5. Selezionare un tipo di report (formato PDF o CSV). Se si sceglie il formato CSV, viene creata automaticamente anche una versione PDF. 6. Selezionare Analyse per creare il report dei risultati. Il report verrà salvato automaticamente nella cartella contenente il file della seduta e avrà lo stesso nome del file della seduta. 7. Il report verrà visualizzato automaticamente. Pagina 16 di 40

17 8. Il risultato compare nella colonna Mutation Status della tabella Sample Result Table. Interpretazione del report del software LightCycler Adapt 1. Il report del software LightCycler Adapt contiene informazioni generali sulle analisi L'autore del report è la persona che ha avviato il software e creato il report Sono indicate la data e l'ora di esecuzione dell'analisi. 2. Nel report sono presenti informazioni dettagliate sulle analisi, ad esempio il nome file della seduta, il file di definizione dell'algoritmo e la sequenza dell'algoritmo. I dettagli relativi all'algoritmo non possono essere alterati. 3. Nella sezione dei risultati sono indicati il nome completo e il percorso del file della seduta eseguita sullo strumento LightCycler 480, oltre alle seguenti informazioni: 3.1. Il numero di serie dello strumento LightCycler Instrument Name: l'identificativo assegnato allo strumento LightCycler 480 nel software LightCycler Run Date: la data e l'ora di esecuzione della seduta sullo strumento LightCycler Run Operator: il nome della persona connessa al software LightCycler 480 durante l'esecuzione della seduta Experiment Name: il nome file della seduta Software Version: la versione del software installata sullo strumento LightCycler Lot Number: un valore derivato dal campo Lot No. della schermata di impostazione dell'esperimento, nel software dello strumento LightCycler Viene fornita una rappresentazione della piastra con i nomi dei campioni derivati dalla schermata di definizione dei campioni, nel software dello strumento LightCycler Nel campo Run Summary Result viene indicato un risultato riepilogativo della seduta, che può essere Valid o Invalid a seconda dei controlli eseguiti nelle colonne 1 e Controlli della seduta 6.1. Il software LightCycler Adapt calcola automaticamente il valore Ct per la miscela standard in base alla seguente formula: Ct mutazione - Ct controllo = Ct 6.2. Il software LightCycler Adapt confronta questi valori con i valori attesi, indicati nella Tabella 7. Pagina 17 di 40

18 Tabella 7. Valori Ct attesi per il software LightCycler Adapt Saggio Ct miscela standard 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0, Nel report sono indicati i valori Ct e Ct Nel report sono indicati i seguenti Flag/Avvisi relativi ai controlli della seduta nelle colonne 1 e 2: Tabella 8. Flag/Avvisi del software LightCycler Adapt per i controlli della seduta Flag/Avvisi CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Significato Il valore Ct FAM per il saggio di controllo non rientra nell'intervallo Per la miscela standard, il controllo esogeno ha prodotto un Ct < 30 o negativo quando il risultato FAM è negativo I valori Ct delle mutazioni non rientrano nell'intervallo impostato La reazione del controllo esogeno è fallita in un controllo NTC La reazione FAM ha generato un valore Ct positivo in un controllo NTC Il significato di questi Flag/Avvisi è spiegato più dettagliatamente di seguito: CT_OUT_OF_RANGE: il saggio di controllo relativo alla miscela standard deve generare un valore Ct di 26,60 ± 2. Se il saggio non rientra in questo intervallo, viene visualizzato un Flag/Avviso per tutti i pozzetti contenenti la miscela standard, dal momento che i valori Ct non vengono calcolati e la miscela standard non è valida. Significa che il saggio di controllo non funziona correttamente EXO_FAIL: questo Flag/Avviso viene visualizzato se il saggio di controllo esogeno in uno qualsiasi dei pozzetti contenenti la miscela standard è < 30, in quanto potrebbe significare che sono presenti contaminanti della PCR nella miscela. Se il saggio di controllo esogeno fallisce quando una reazione FAM fallisce in uno qualsiasi dei pozzetti contenenti la miscela standard, viene visualizzato il Flag/Avviso EXO_FAIL. Pagina 18 di 40

19 Indica un problema riguardante il saggio, che potrebbe indurre risultati falsi negativi. La miscela standard non è comunque più valida perché la reazione FAM è fallita DELTA_CT_OUT_OF_RANGE: se i valori Ct della miscela standard rientrano nei valori indicati nella Tabella 7 ± 2,00, nel report generato dal software verranno classificati come validi. Se il Ct supera l'intervallo atteso, verrà indicato uno stato non valido e verrà visualizzato questo Flag/Avviso. Indica un problema riguardante un saggio, che potrebbe indurre risultati falsi EXO_CONTROL_INVALID: nei pozzetti contenenti i controlli NTC, il saggio di controllo esogeno deve generare un risultato positivo per tutti gli 8 pozzetti (Ct < 41). Se si ottiene un risultato negativo, viene visualizzato questo Flag/Avviso e viene indicato uno stato non valido. Indica un problema riguardante il saggio, che potrebbe indurre risultati falsi TARGET_CHANNEL_INVALID: negli 8 pozzetti contenenti il controllo NTC, il risultato FAM deve essere negativo (Ct > 38). Qualsiasi amplificazione indicherebbe una contaminazione. Un risultato positivo provocherà la visualizzazione di questo Flag/Avviso e il controllo NTC verrà segnalato come non valido Se lo stato di uno dei pozzetti contenenti la miscela standard o di uno dei pozzetti contenenti il controllo NTC è non valido, nel campo Run Summary Result viene visualizzato il risultato riepilogativo Run Invalid. I nomi dei campioni e i valori Ct dei controlli verranno indicati nella tabella Sample Result Table, tuttavia lo stato delle mutazioni sarà invalid. La miscela standard indica che tutti i saggi funzionano correttamente. In caso contrario, i risultati ottenuti per le mutazioni sarebbero falsi positivi o falsi negativi. Il controllo NTC indica l'assenza di contaminanti nelle soluzioni Master Mix e anche che il controllo esogeno funziona nel modo previsto Qualora il software LightCycler Adapt dovesse visualizzare un messaggio di errore, fare riferimento al paragrafo 12 relativo all'assistenza tecnica. 7. Risultati dei campioni 7.1. Nella tabella Sample Result Table sono indicati i nomi dei campioni, provenienti dal software LightCycler 480, e i valori Ct dei saggi di controllo Il software LightCycler 480 Adapt calcola i valori Ct e determina se un campione è positivo o negativo alle mutazioni sulla base dei valori di cut-off 1% riportati nella Tabella 9. Pagina 19 di 40

20 Tabella 9. Valori di cut-off 1% nel software LightCycler Adapt Saggio Delta Ct 1% 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9, Se il valore Ct di una mutazione è al si sotto del valore corrispondente di cut-off Ct 1%, il campione è definito positivo alla mutazione. Nel report del software LightCycler Adapt verrà indicata la mutazione riscontrata, ma soltanto quella. Se i valori Ct positivi sono 2, nel report verrà indicato il valore minore tra i due. Si presuppone infatti che il secondo valore sia causato dalla reattività crociata di un primer di mutazione legatosi e innescatosi da un'altra mutazione. Nei rari casi in cui viene riscontrata una doppia mutazione, la decisione clinica è comunque identica ai casi di mutazione singola Se i valori Ct del campione sono maggiori dei valori Ct 1%, il campione viene definito negativo alla mutazione (potrebbe contenere una mutazione, ma al di sotto dei limiti di sensibilità del kit) Flag/Avvisi Il software LightCycler Adapt genera un report con i Flag/Avvisi relativi ai campioni e li riassume nella tabella Sample Result Table descritta di seguito (vedere la Tabella 10). Tabella 10. Flag/Avvisi relativi ai campioni nel software LightCycler Adapt Flag/Avviso Significato REP_DILUTION Il Ct del controllo è < 24 CONF_LEVEL Il Ct del controllo è > 28,9 e non è stata riscontrata nessuna mutazione LIMITED Il Ct del controllo è > 35 EXO_FAIL Il saggio di controllo esogeno ha fallito quando la reazione FAM ha fallito in una reazione di mutazione, oppure il Ct del controllo esogeno è < 30. FAIL Il software non è in grado di generare una curva positiva o negativa Il significato di questi Flag/Avvisi è spiegato più dettagliatamente di seguito: REP_DILUTION: Ct controllo < 24. I saggi sono stati convalidati per un livello di DNA che genera un Ct maggiore di o uguale a 24. Se un campione genera un Ct del saggio di controllo più basso, è necessario diluirlo affinché possa rientrare nell'intervallo valido. Pagina 20 di 40

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