BENZODIAZEPINE 2 SIERICHE e/o PLASMATICHE in UV Codice Z35010 (Nordiazepam, Clobazam, Diazepam, Midazolam e Nitrazepam)

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1 BENZODIAZEPINE 2 SIERICHE e/o PLASMATICHE in UV Codice Z3 (Nordiazepam, Clobazam, Diazepam, Midazolam e Nitrazepam) INTRODUZIONE Le Benzodiazepine sono i farmaci elettivi nella terapia delle sindromi ansiose. Ogni Benzodiazepina ha in proporzioni diverse azione ansiolitica, ipnotica, sedativa, miorilassante e anticonvulsivante. Tutte le Benzodiazepine sono efficaci nell ansia e nell insonnia e la rapidità d azione dipende dalla velocità con cui si raggiungono le concentrazioni efficaci nel S.N.C. Il recettore delle Benzodiazepine è un particolare sito del recettore per il GABA-α, il Flumazenil è affine al recettore delle Benzodiazepine e quindi annulla l attività anti-convulsivante delle Benzodiazepine. Il trattamento protratto delle Benzodiazepine induce tolleranza e dipendenza. Nel prevedere l intensità e la durata dell azione clinica nonché nell effettuare il dosaggio del farmaco su liquidi biologici bisogna tener conto del fatto che le Benzodiazepine danno origine a metaboliti farmacologicamente attivi. Le Benzodiazepine sono molecole cicliche costituite da un anello benzenico condensato con un anello eterociclico eptatomico azotato in,4 oppure in, ( diazepina ). L anello eptatomico lega in posizione un fenile. Nelle triazol-benzodiazepine c è anche l anello del triazolo. Le differenze fra le varie Benzodiazepine dipendono dai sostituenti sugli anelli. Hanno una struttura molecolare idrofobica e quindi sono ben assorbite per via orale. Si distribuiscono in tutti i tessuti e superano facilmente la barriera ematocerebrale. Le Benzodiazepine così come tali e i loro metaboliti si legano alle proteine plasmatiche e sono metabolizzate a livello epatico. I loro metaboliti si formano per dealchilazione dell atomo di azoto in posizione e idrossilazione dell atomo di carbonio in posizione 3, trasformandosi in composti meno idrofobici. Molti di questi metaboliti sono successivamente coniugati con le proteine ed eliminati con le urine come glucoronati o sulforati. EUREKA srl LAB DIVISION VAT N info@eurekaone.com Head Quarter: Via Enrico Fermi Chiaravalle (AN) ITALY Tel Fax Release N Benzodiazepine 2 sieriche e/o plasmatiche in UV Marzo 2

2 CARATTERISTICHE DEL METODO Principio del Metodo: Le Benzodiazepine vengono isolate purificando il siero/plasma con una colonna clean-up. Dopo l aggiunta di uno stabilizzante l'estratto viene direttamente iniettato in HPLC. Recupero del Metodo: % Sensibilità del metodo: Range dinamico del metodo: Range terapeutico nel siero: Contenuto della confezione : Reagente A Soluzione di Condizionamento, x ml Nordiazepam : Clobazam : Diazepam : Midazolam : Nitrazepam : Nordiazepam : Clobazam : Diazepam : Midazolam : < 2 µg/l < 2 µg/l < 2 µg/l < 2 µg/l < 2 µg/l > 2 µg/l > 2 µg/l > 2 µg/l 2 µg/l Nitrazepam : 2 µg/l Nordiazepam : 2 µg/l Clobazam : 2 µg/l Diazepam : µg/l Midazolam : µg/l Nitrazepam : 2 2 µg/l Tutti i reagenti sono pronti all'uso e stabili 3 anni a Temperatura ambiente. Reagente B Soluzione di Condizionamento 2, x ml Reagente C Soluzione Diluente, x ml Reagente D Soluzione di Lavaggio, x ml Reagente E Soluzione Eluente, x 3 ml Reagente F Soluzione Stabilizzante, x 2 ml Reagente G Soluzione Standard interno, x ml Reagente H Standard chimico, x ml Vedi Avvertenze Colonne clean-up, Pz Reagente M Fase Mobile, 2 x ml Dotazione strumentale minima richiesta : Strumento HPLC isocratico con loop da µl. Detector spettrofotometrico UV/VIS λ=242 nm Registratore di cromatogrammi Dotazione opzionale : Autocampionatore. Computer gestionale Modalità per il prelievo ematico : Prelevare 3 ml di sangue venoso in una provetta senza gel o con EDTA come anticoagulante. Centrifugare a 4 rpm per minuti. Separare il siero e stoccarlo a 2 C. Stabile 4 settimane. 2

3 PROCEDURA PREANALITICA In una provetta pipettare: 3 µl di H 2 O di grado HPLC µl di Reagente H - Standard chimico µl di Reagente G - Soluzione Standard interno NOTA : Prima di iniziare la seduta analitica è consigliabile iniettare µl di questa soluzione in HPLC per identificare il tempo di ritenzione delle singole Benzodiazepine che deve essere simile a quello riportato in fig.. Se il Test ha dato esito positivo si può procedere alla seduta analitica. Se così non fosse verificare la funzionalità del sistema analitico. Importante : Questa soluzione così ottenuta non deve essere usata come calibratore PROCEDURA ANALITICA FASE : Preparare un numero di colonne Clean-up pari al numero dei campioni da analizzare più lo Standard di Calibrazione e gli eventuali Controlli. Condizionare le colonne Clean-up facendo passare µl di Reagente A Sol. di condizionamento non portare a secco Condizionare le colonne Clean-up facendo passare µl di Reagente B Sol. di condizionamento 2 non portare a secco FASE 2 : Preparazione dello Standard di Calibrazione In una provetta pipettare : 9 µl di H 2 O di grado HPLC µl di Reagente H - Standard chimico Si otterrà una soluzione standard di calibrazione contenente: Nordiazepam Clobazam Diazepam Midazolam Nitrazepam 2 µg/l µg/l 2 µg/l µg/l 26 µg/l FASE 3 : Preparare in provette di plastica: Campione Standard di calibrazione Campione µl Standard di Calibrazione µl Reagente C Sol. Diluente µl µl Reagente G Standard interno µl µl Agitare al vortex per secondi FASE 4 : Caricare il Campione e lo Standard di Calibrazione precedentemente preparati nelle colonne Clean up. Non portare a secco! Release N Benzodiazepine 2 sieriche e/o plasmatiche in UV Marzo 2 3

4 FASE : Lavare le colonne Clean-up con ml di Reagente D Sol. di Lavaggio FASE 6 : Eluire con 3 µl di Reagente E Sol. Eluente FASE 7 : Aggiungere all eluato 2 µl di Reagente F Sol. Stabilizzante Agitare al vortex per secondi N.B.: il campione così preparato è stabile 7 giorni a 2-8 C INIEZIONE : Iniettare µl della soluzione così ottenuta nel cromatografo HPLC e attendere la stampa del cromatogramma. Release N Benzodiazepine 2 sieriche e/o plasmatiche in UV Marzo 2 4

5 REAGENTE H : STANDARD CHIMICO BENZODIAZEPINE 2 - Avvertenze BENZODIAZEPINE Nordiazepam Clobazam Diazepam Midazolam Nitrazepam 2. µg/l. µg/l 2. µg/l. µg/l 2.6 µg/l PARAMETRI DEL DETECTOR SPETTROFOTOMETRICO λ GAIN TEMPO DI INTEGRAZIONE 242 nm, AUFS secondi PROTEZIONE DELLA COLONNA ANALITICA Per salvaguardare la colonna analitica Reverse Phase GENESIS 4,6 x mm, 4 µ, è tassativo l uso del Metaguard - Guard Column ( x 3 pz), cod. ZA6MG e del Metasaver Precolumn Filter. um ( x pz.) cod. ZA6. CONDIZIONAMENTO DELLA COLONNA Installare la colonna analitica nuova Reverse Phase GENESIS 4,6 x mm, 4 µ. Disconnettere il detector e far passare 3 ml di una soluzione di H 2 O : Metanolo ( 2 : 8 v/v ) e successivamente 3 ml di H 2 O per HPLC, al flusso di,2 ml/minuto. Non riciclare i liquidi di lavaggio. Filtrare la fase mobile con pompa da vuoto e filtro idoneo da,22 µ o,4 µ. Condizionare la colonna con la fase mobile al flusso di,2 ml/minuto e scaricare i primi 3 ml. Condizionare ulteriormente per 3 minuti anche a ricircolo di fase. Al termine, iniettare il test chimico e verificare la congruità della separazione. E possibile effettuare analisi a ricircolo di fase, purchè si abbia l accortezza di filtrare la stessa Fase Mobile con filtro da,22 µ prima di ogni seduta analitica. Se la T Amb del Laboratorio è > 2 C si consiglia di conservare a 2-8 C la Fase Mobile fra una seduta analitica e l altra. PULIZIA DELLA COLONNA PARAMETRI HPLC Disconnettere il detector. Flussare 3 ml di H 2 O e scaricare. Flussare una soluzione di H 2 O : Metanolo o Acetonitrile ( 2 : 8 v/v ) per 3 minuti scaricandola. Quando la colonna verrà usata di nuovo far passare 3 ml di H 2 O prima di condizionarla con la Fase Mobile. LOOP µl Flusso di lavoro consigliato,2 ml/minuto Pressione corrispondente Circa 92 bar PARAMETRI INTEGRATORE HP 3394 / 339 / 3396 ATTENUAZIONE 8 PARAMETRI COMPUTER GESTIONALE SECONDO LE SPECIFICHE DEL SOFTWARE GESTIONALE ACCESSORI E CONSUMABILI CODICE DESCRIZIONE CONFEZIONE Z32 Standard chimico per Benzodiazepine 2 2 x ml Z Controllo per Benzodiazepine Livello e 2 2 x x ml ZFM96E Colonna Analitica Genesis C 8 ( x 4,6mm -4 um) PZ ZA6MG Metaguard Guard Column x 3 PZ ZA6 Metasaver Precolumn Filter. um x PZ S Vial standard di vetro da 2 ml con tappo a vite x 44 PZ

6 BENZODIAZEPINE 2 SIERICHE e/o PLASMATICHE ( Cromatogrammi di Riferimento ) 3 mv 29 stdchimicodireto.data mv 4 cal a2.data MIDAZOLAM NITRAZEPAM CLOBAZAM NORDIAZEPAM IS DIAZEPAM MIDAZOLAM NITRAZEPAM CLOBAZAM NORDIAZEPAM IS DIAZEPAM RT[min] - RT[min] Fig. : Soluzione Test Fig. 2: Standard di calibrazione in soluzione acquosa R.T. 4. Midazolam R.T. 3.9 Midazolam µg/l R.T. 7.9 Nitrazepam R.T. 7.9 Nitrazepam 8 µg/l R.T..2 Clobazam R.T..2 Clobazam µg/l R.T..8 Nordiazepam R.T..8 Nordiazepam µg/l R.T. 4. Standard Interno R.T. 4. Standard Interno R.T. 6. Diazepam R.T. 6. Diazepam µg/l 6

7 BENZODIAZEPINE 2 SIERICHE e/o PLASMATICHE ( Cromatogrammi di Riferimento ) mv 4 cnt a4.data mv 4 plasmaa.data NORDIAZEPAM IS MIDAZOLAM CLOBAZAM IS DIAZEPAM MIDAZOLAM NITRAZEPAM CLOBAZAM NORDIAZEPAM DIAZEPAM NITRAZEPAM - RT[min] - RT[min] Fig. 3: Controllo basso Fig. 4: Controllo alto R.T. 4. Midazolam 2 µg/l R.T. 4. Midazolam µg/l R.T. 7.8 Nitrazepam 9 µg/l R.T. 7.7 Nitrazepam 26 µg/l R.T. 9.8 Clobazam 2 µg/l R.T. 9.9 Clobazam µg/l R.T.. Nordiazepam µg/l R.T..7 Nordiazepam 2 µg/l R.T. 3.7 Standard Interno R.T. 3.8 Standard Interno R.T. 6. Diazepam µg/l R.T. 6.2 Diazepam 2 µg/l 7

8 LE BENZODIAZEPINE N Nome del Principio Attivo Nome della specialità Commerciale Clordemetildiazepan EN 2 Clordiazepossido Endequil 8 Psicoterina 2 Equibral 9 Reliberan 3 Labican Seren-vita 4 Librium Smail Lixin 2 Ansiacal 6 Philcorium 3 Benzodiapin 7 Psicofar 3 Diazepan Aliseum 6 Apozepam 2 Ansioli 7 AspaserineB 6 Tranq 3 Avex 8 Atensine 4 Eridan 9 Benzopin Noan 2 Betapam 6 Qetinil 2 Calmaven 7 Quievita 22 Calmigen 8 Tranquirit 23 Complutine 9 Valitran 24 Diaceplex Valium 2 Dialar Vatran 26 Diaquel 2 Alupran 27 Diazemuls 3 Aneurol 28 Ansium 4 Antenex 29 Anxicalm Vivol 4 Flunitrazepam Rohypnol 6 Roipnol 2 Rohipnol 7 Darkene 3 Hypnodorm 8 Hypnor 4 Narcozep 9 Noriel Valsera Lorazepam Temesta 3 Lorans 2 Tran-Qil 4 Tranqipam 3 Somagerol Novolorazem 4 Pro-Dorm 6 Duralozam Orfidal 7 Idalprem 6 Donix 8 Tolid 7 Securit 9 Sedizepam 8 Tavor 2 Almazine 9 Somnium 2 Ativan Tèmesta 22 Quait Punktyl 23 Lorax 2 Control 24 Laubeel 6 N-Demetildiazepam Madar 7 Clobazam Clarmyl Sederlona 2 Clopax 6 Urbadan 3 Frisium 7 Urbanol 4 Noiafren 8 Urbanyl 8

9 Nome del Principio Attivo Nome della specialità Commerciale 8 Nitrazepam Somnite Ipersed 2 Pelson 6 Mitidin 3 Remnos 7 Mogadon 4 Paxadorm 8 Surem Eatan-N 9 Mitidin 6 Imeson 2 Dormo-Purem 7 Insoma 2 Serenade 8 Dormigen 22 Somnipar 9 Nitrados 23 Ormodon Mogadan 24 Alodorm Somnibel-N 2 Apodorm 2 Unisomnia 26 Arem 3 Pelsonfilina 27 Persopir 4 Novanox 28 Tri 9 Flurazepam Staurodorm New Flurazepam Dihydrochloride Dalmadorm Midorm 2 Dalmane 6 Novoflupam 3 Dormodor 7 Remdue 4 Irdal Flurazepam Monohydrochloride Dalmadorm Paxane 2 Dalmane 6 Somnol 3 Felison 7 Valdorm 4 Flunox 2 Clonazepam Iktorivil 3 Rivotril 2 Klonopin 3 Delorazepam Briantum 2 EN 4 Bromazepam Bromazanil 8 Lexil 2 Brozam 9 Lexomil 3 Compendium Lexotan 4 Durazanil Lexotanil Gityl 2 Neo-OPT 6 Lectopam 3 Normoc 7 Lexatin Lormetazepam Ergocalm 4 Loretam 2 Lembrol Minias 3 Loramet 6 Noctamid 6 Brotizolam Lendormin 2 Lendormine 7 Midazolam Dormicum 2 Hypnovel 8 Midazolam Hydrochloride Dormicum 3 Versed 2 Hypnovel 9

10 Nome del Principio Attivo Nome della specialità Commerciale 9 Midazolam Maleate Dormicum 2 Aprazolam Tafil 4 Xanax 2 Trankimazin Xanor 3 Valeans 2 Oxazepam Adumbram 6 Sedotin 2 Isodin 7 Serpax 3 Limbial 8 Serax 4 Quen 9 Serenid Quilibrex 22 Prazepam Prazene Mono-demetrin 2 Centrax 6 Reapam 3 Demetrin 7 Trepaidam 4 Lysanxia 23 Triazolam Halcion 4 Novodorm 2 Apo-Diazo Songar 3 Dumozolam 24 Temazepam Restoril 3 Levanxol 2 Euhypnos