ANALISI DI CONFERMA TECNICHE CROMATOGRAFICHE

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1 ANALISI DI CONFERMA TECNICHE CROMATOGRAFICHE Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

2 METODICHE PER I TEST DI CONFERMA GAS CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTE PRESTAZIONI (HPLC) CROMATOGRAFO + SPETTROMETRO DI MASSA (GC/MS) Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

3 CONFERMA CROMATOGRAFICA QUANTITATIVA HPLC (dedicato o no) Test di elezione da parte delle Autorità Regolatorie Americane GC/MS LC/MS Grado di specializzazione del personale

4 CUT-OFF E un valore di riferimento espresso in concentrazione, al di sopra del quale il risultato di un test analitico è giudicato positivo e al di sotto del quale il test è giudicato negativo Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

5 CRITERI DI SCELTA DEL CUT-OFF CRITERIO ANALITICO - CUT-OFF = primo calibratore positivo. CRITERIO AMMINISTRATIVO - CUT-OFF > primo calibratore positivo. Il valore scelto deve permettere la conferma cromatografica del risultato. - CUT-OFF uguale stessa regione, paese, UE. Per evitare disparità di trattamento all utente dovuta alle diverse specifiche della metodica.

6 Concentrazione soglia (CUT-OFF) nei test di conferma per la quantizzazione delle singole sostanze nelle urine Classe di sostanza ISS (1996) Documento* Europeo (1997) USA (1998) OPPIACEI: Concentrazione ng/ml MORFINA (libera+coniugata) MORFINA 3-GLUCURONIDE (1) 10 MAM MORFINA 6-GLUCURONIDE (1) 6-MONOACETILMORFINA (2) CODEINA COCAINA E METABOLITI: BENZOILECGONINA ECGONINAMETILESTERE (2) CANNABINOIDI: DELTA 9 TETRAIDROCANNABINOLO- ACIDO CARBOSSILICO 30 (15*) GLUCURONIDE DEL DELTA 9 TETRAIDRO- CANNABINOLO-ACIDO CARBOSSILICO (2) AMFETAMINE ED ANALOGHI: AMFETAMINA METAMFETAMINA ,4 METILENDIOSSIMETAMFETAMINA (MDMA) METILENDIOSSIAMFETAMINA (MDA) (1) Metabolita presente nell urina che può essere dosato tal quale oppure insieme alla morfina in seguito ad un processo di idrolisi (acida o enzimatica) per rompere il legame con il glucuronide; (2) Altro metabolita presente nell urina * Biochimica Clinica (1997): 21 (9),

7 CLASSIFICAZIONE DEI LABORATORI Laboratorio di base nell ambito della Biochimica Tossicologica LABORATORIO DI 1 LIVELLO CHE ESEGUE SOLO TEST INIZIALI (o di screenning) MATRICE MATRICE BIOLOGICA BIOLOGICA METODICHE METODICHE TIPO TIPO DI DI ANALISI ANALISI CUT CUT OFF OFF STRUMENTAZIONI STRUMENTAZIONI PROCEDURE PROCEDURE CONTROLLO CONTROLLO DI DI QUALITA QUALITA CATENA CATENA DI DI CUSTODIA CUSTODIA URINA URINA IMMUNOCHIMICHE IMMUNOCHIMICHE QUALITATIVA/QUANTITATIVA QUALITATIVA/QUANTITATIVA QUELLO QUELLO STABILITO STABILITO IN IN AMBITO AMBITO REGIONALE REGIONALE ANALIZZATORI ANALIZZATORI AUTOMATICI AUTOMATICI DI DI CHIMICA CHIMICA CLINICA CLINICA QUELLE QUELLE STABILITE STABILITE NEI NEI MANUALI MANUALI DELLA DELLA QUALITA QUALITA E E NELLE NELLE LINEE LINEE GUIDA GUIDA SI, SI, PARTECIPAZIONE PARTECIPAZIONE AD AD UN UN PROGRAMMA PROGRAMMA VEQ VEQ CON CON L OPZIONE L OPZIONE PER PER L ANALISI L ANALISI QUALITATIVA QUALITATIVA SI/NO SI/NO

8 Laboratorio SPECIALIZZATO nell ambito della Biochimica Tossicologica LABORATORIODI II LIVELLO CHE ESEGUE SIA LE ANALISI INIZIALI CHE DI CONFERMA MATRICE BIOLOGICA METODICHE TIPO DI ANALISI CUT OFF STRUMENTAZIONI PROCEDURE CONTROLLO DI QUALITA CATENA DI CUSTODIA TUTTE IMMUNOCHIMICHE E CROMATOGRAFICHE QUALITATIVA/QUANTITATIVA QUELLI STABILITI IN AMBITO REGIONALE ANALIZZATORI AUTOMATICI DI CHIMICA CLINICA GAS CROMATOGRAFIA ACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA QUELLE STABILITE NEI MANUALI DELLA QUALITA E NELLE LINEE GUIDA SI, PARTECIPAZIONE AD UN PROGRAMMA VEQ CON L OPZIONE PER L ANALISI QUANTITATIVA SI

9 Matrici biologiche U R I N A: - MATRICE BIOLOGICA DI PRIMA SCELTA NELL ANALISI DELLE SOSTANZE D ABUSO VANTAGGI: - PRELIEVO NON INVASIVO DEL CAMPIONE - POSSIBILITA DI CAMPIONARE GRANDI VOLUMI - POSSIBILITA DI ANALIZZARE SIA LE SOSTANZE CHE I LORO METABOLITI DOPO DIVERSI GIORNI. SVANTAGGI: - SCARSA RILEVANZA CLINICA DELL ANALISI QUANTITATIVA POICHE LE CONCENTRAZIONI DEGLI ANALITI VARIANO CON: - DOSE - VIA DI SOMMINISTRAZIONE - TEMPO DI LATENZA TRA L ASSUNZIONE E L ANALISI - STATO FISIOLOGICO DELL INDIVIDUO - AGGIUNTA DI SOSTANZE ADULTERANTI Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

10 TEMPO DI RILEVAMENTO DEI METABOLITI DELLA MARIJUANA NELLE URINE CON 6 DIVERSE METODICHE IMMUNOCHIMICHE (N=6) Dose 1,75% THC Cut-off Ore 100ng/ml 6,5 ± 1,8 50ng/ml 18,7 ± 2,7 20ng/ml 51,0 ± 16,2 Dose 3,55% THC Cut-off Ore 100 ng/ml 21,1 ± 4,8 50 ng/ml 45,7 ± 3,6 20 ng/ml 92,6 ± 14,5 J Anal Toxicol 19: (1995) Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

11 MATRICI NON CONVENZIONALI PER L ANALISI DELLE SOSTANZE D ABUSO SALIVA SUDORE CAPELLI PELI PUBICI PELI ASCELLARI UNGHIE

12 PERCHE UTILIZZARE MATRICI NON CONVENZIONALI NELLE ANALISI FARMACO-TOSSICOLOGICHE? PER INCREMENTARE IL TEMPO DIDETERMINAZIONE PER INCREMENTARE IL TEMPO DIDETERMINAZIONE Dopo somministrazione ed ed in in funzione delle caratteristiche farmacocinetiche una droga e/o e/o i i suoi metaboliti possono essere rilevati: Sangue h Saliva h Urina giorni Capelli mesi

13 INCORPORAZIONE DI DROGHE NEI CAPELLI DURANTE LA CRESCITA

14 Matrici biologiche Capelli VANTAGGI: PRELIEVO NON INVASIVO POSSIBILITA DI RILEVARE L ASSUNZIONE DELLE SOSTANZE DOPO SETTIMANE O MESI SVANTAGGI: DIFFICILE INTERPRETAZIONE DEL DATO ANALITICO INTERFERENZE: * USO DI PARTICOLARI DETERGENTI * TINTURE PER CAPELLI NON ESISTONO PROCEDURE STANDARDIZZATE PER: * PRELIEVO DELLA MATRICE * ESTRAZIONE DELLA MATRICE Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

15 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA Proposta di linee guida per l analisi di farmaci e sostanze d abuso nei capelli Simona Pichini, Alessandro Palmeri, Manuela Pellegrini, Piergiorgio Zuccaro e Roberta Pacifici Laboratorio di Biochimica Clinica ISSN Rapporti ISTISAN 99/24

16 LA DETERMINAZIONE NEI CAPELLI DEI FARMACI E SOSTANZE STUPEFACENTI PUO ESSERE RICHIESTA IN CASO DI: Morti correlate all uso di farmaci e/o sostanze d abuso; Valutazione di inidoneità alla guida; Responsabilità criminale; Affidamento, custodia minori; Esposizione prenatale a farmaci e sostanze d abuso;

17 PRINCIPALI FATTORI DI VARIABILITA LEGATI ALLA NATURA DELLA MATRICE CHERATINICA I meccanismi di incorporazione della droga dentro i capelli; La natura del legame della droga con la matrice cheratinica; Lo stato solido e la disomogeneità del capello; La velocità di crescita dei capelli; La pigmentazione dei capelli; Il trattamento cosmetico dei capelli; L esposizione in vivo dei capelli a contaminazioni esterne.

18 EFFETTO DELLA PIGMENTAZIONE DEI CAPELLI SULLA INCORPORAZIONE DELLA DROGA CAPELLI BIANCHI CAPELLI PIGMENTATI Conc. Droga nei BIANCHI / Conc. Droga nei PIGMENTATI = M 0,70 CI SONO GRANDI DIFFERENZE TRA SOGGETTI PER LA STESSA SOSTANZA, MENTRE IL RAPPORTO E SIMILE PER DIFFERENTI SOSTANZE NELLO STESSO SOGGETTO Da: M. Rothe et al. Forensic Sci Int 1997

19 EFFETTO DEL TRATTAMENTO COSMETICO DEI CAPELLI SULLE ANALISI DELLE DROGHE DECOLORAZIONE TINTURA PERMANENTE I prodotti usati sono delle basi forti che possono alterare/danneggiare la struttura del capello Il risultato può essere: perdita della droga incorporata nella matrice cheratinica (falso negativo) più facile incorporazione della droga in condizioni di contaminazione ambientale (falso positivo)

20 EFFETTO DEL TRATTAMENTO COSMETICO DEI CAPELLI SULLE ANALISI DELLE DROGHE Il contenuto delle droghe nei capelli che hanno subito un trattamento cosmetico diminuisce rispetto ai capelli non trattati THC 30% Nicotina 30% Cocaina 40-60% Benzoilecgonina 40-60% Codeina 40-60% 6-acetilmorfina 40-60% THC-COOH 40-60% Morfina > 60% Da: C. Jurada et al. Int J Leg Med 1997

21 PROCEDURE ANALITICHE PER LA DETERMINAZIONE DELLE SOSTANZE D ABUSO NEI CAPELLI Prelievo dei capelli Decontaminazione del campione Trattamento meccanico del campione Digestione Estrazione Analisi

22 PRELIEVO DEL CAMPIONE La procedura di raccolta dei capelli devono essere standardizzate il prelievo va eseguito in zona nucale la raccolta deve essere eseguita in maniera tale da identificare la zona prossimale al cuoio capelluto dalla punta dei capelli la raccolta deve essere effettuata in un ambiente non contaminato e da personale istruito il taglio deve essere eseguito con forbici pulite con una piccola quantità di alcol e ben asciutte la conservazione è a temperatura ambiente se l analisi ha valenza medico-legale è necessaria una catena di custodia è necessario raccogliere quantità sufficienti di campione per l analisi ed eventuale rianalisi ( 200 mg) al momento del prelievo è necessario riportare tutti i dati del soggetto inclusi gli eventuali trattamenti cosmetici subiti dai capelli l analisi deve essere eseguita su un segmento di capelli misurato

23 DECONTAMINAZIONE DEL CAMPIONE METODI PIU COMUNEMENTE USATI 1) due lavaggi successivi con diclorometano, ognuno della durata di 5 minuti; 2) tre lavaggi della durata di 5 minuti con acqua distillata, acetone ed etere di petrolio rispettivamente; 3) un lavaggio a 37 C per 15 minuti con alcool etilico o metilico; 4) un lavaggio di 15 minuti con alcool etilico anidro seguito da tre lavaggi di 30 minuti con tampone fosfato (0.01 M, ph 5.5).

24 PREPARAZIONE DEL CAMPIONE I capelli asciutti possono essere: - tagliati finemente con forbici pulite; - polverizzati tramite mulino a palle; Quest ultima procedura è da ritenersi di elezione, in quanto facilita la successiva digestione della matrice cheratinica rendendo massima la superficie di penetrazione del solvente.

25 DIGESTIONE DEL CAMPIONE La digestione serve ad estrarre in maniera selettiva e quantitativa gli analiti di interesse dall interno della matrice cheratinica, senza modificare chimicamente gli analiti stessi.

26 DIGESTIONE DELLA MATRICE CHERATINICA Quattro principali tipi di digestione: 1- Digestione enzimatica 2- Digestione basica 3- Digestione acida 4- Digestione in alcol metilico

27 ESTRAZIONE DEGLI ANALITI A) Estrazione Liquido - Liquido solventi utilizzati: toluene, alcol butilico, cloroformio isopropanolo, cloruro di metilene B) Estrazione in fase solida isopropanolo colonnine riempite con fase stazionaria apolare C18 Bound Elut Certify Isolute HC colonnine riempite con fase adsorbente Extrelut

28 METODI DI SCREENING Non esistono in commercio Test di screening per la matrice cheratinica E possibile utilizzare per analisi qualitative con opportuni accorgimenti test: RIA, EIA, FPIA, HI

29 SCELTA DELLE METODICHE IMMUNOCHIMICHE Scelta del test immunochimico in funzione della specificità per la sostanza presente nella matrice cheratinica.

30 SOSTANZE D ABUSO E METABOLITI PRESENTI IN URINA E CAPELLI SOSTANZA URINE CAPELLI Ecstasy HMMA MDMA MDMA MDMA Cocaina BZE Cocaina Cocaina BZE Eroina M-glucuronide MAM M M H Metadone EDDP Metadone EMDP EDDP Metadone THC TH-COOH THC THC Nicotina Cotinina Nicotina Nicotina Cotinina

31 VALIDAZIONE DELLA METODICA IMMUNOCHIMICA PER L ANALISI IN MATRICE CHERATINICA Verifica della linearità della curva di taratura in matrice cheratinica (effetto matrice); Verifica della sensibilità (percentuale di veri positivi); Verifica della specificità (percentuale di falsi positivi); Costruzione curva ROC (relative operating curve).

32 ANALISI DI CONFERMA GC/MS LC/MS

33 PRESENTAZIONE DEI DATI Il risultato finale delle analisi va espresso in: µg di xenobiotico / mg di capelli Accanto al risultato quantitativo andrà sempre espressa la lunghezza in cm del segmento analizzato e la sua distanza dalla base del cuoio capelluto.

34 INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI Non sono stati stabiliti cut-off ufficiali dei vari xenobiotici nel capello che permettano di chiarire la positività o la negatività rispetto all utilizzo o meno di una certa sostanza.

35 PROPOSTA DI CUT-OFF 6 MAM COCAINA µg /mg µg /mg no consumo < 0,5 < 1 consumo basso < 2 < 4 consumo medio consumo elevato > 10 > 20

36 ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA HAIR VEQ Programma di valutazione esterna di qualità sull analisi delle sostanze d abuso nei capelli La partecipazione al programma è gratuita, volontaria e confidenziale TEL. : FAX: osservatorio.fad@iss.it

37 IL FATTORE TEMPO IN TOSSICOLOGIA CLINICA LE INFORMAZIONI PIU VELOCI SONO LE PIU UTILI IN TOSSICOLOGIA FORENSE E IMPORTANTE ATTENDERE FINO A QUANDO NON SI HA LA CERTEZZA DEL DATO ANALITICO INFORMAZIONI PRECIPITOSE POSSONO ESSERE CONFONDENTI

38 TEST SPEDITIVI SONO QUEI TEST CHE PERMETTONO LA DETERMINAZIONE DI UNA O PIU SOSTANZE D ABUSO E DEI LORO METABOLITI AD UN VALORE SOGLIA STABILITO SENZA APPARECCHIATURE ED IN TEMPI DI ANALISI RIDOTTI. UTILIZZO SE USATI CORRETTAMENTE DALLO STESSO PERSONALE DI LABORATORIO DANNO RISULTATI PARAGONABILI AGLI ALTRI TEST IMMUNOCHIMICI. IL LORO UTILIZZO TIENE CONTO DEL: -NUMERO E FINALITA DELLE ANALISI DA ESEGUIRE -COSTO DEI REATTIVI - PERSONALE A DISPOSIZIONE Istituto Superiore di Sanità Laboratorio di Biochimica Clinica

39 POINT OF CARE TESTING Il termine POCT indica l attività relativa ad indagini di laboratorio effettuate presso il luogo di cura Divisione ospedaliera Pronto soccorso Dipartimento di emergenza Servizi ambulatoriali specialistici

40 ON-SITE DRUG-TESTING EMERGENCY ROOM To immediately identify drugs so that a patient will receive the appropriate treatment DRUG REHABILITATION PROGRAM To immediately verify compliance

41 ON-SITE DRUG-TESTING ON-TRACK (Roche Diagnostic System) RAPID TEST (DADE Behring Syva) TRIAGE (Biosite Diagnostics) ACCUPINCH (Hycor Biomedical) QUICKSCREEN (Pharmatech) Employ immunochromatographic methods and visually read results.

42 On-site testing devices Percentage of FP, FN, and invalid tests Triange Rapid drug screen Rapid test Quick screen False positive False negatives Invalid Results from total number of drugs in donor urines evaluated for each test product. Total number of drugs tested on Triange devices was Syva, QuickScreen and Rapid Drug Screen each determined the presence of 996 drugs. (FP=false positive, FN= false negative). Peace MR. et al. J Anal Toxicol 2000; 24:

43 ADEGUATA CONOSCENZA DELL IMPORTANZA DELLA Concentrazione del cut-off Reazione crociata Interferenze Specificità di classe Vantaggi e limiti dei test in urina Un interpretazione clinica corretta dei risultati delle analisi dipende dalla conoscenza di queste variabili per prevenire errori nel percorso diagnostico-terapeutico.

44 ON-SITE DRUG-TESTING Matrici biologiche non convenzionali SUDORE SALIVA

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46 CORRELATION OF DRUGWIPE RESULTS IN SWEAT WITH CONCENTRATIONS IN BIOLOGICAL FLUIDS (MDMA 100 mg in healthy volunteers) VOL A Sweat Plasma a Urine b VOL B Sweat Plasma Urine Time (hours) Drugwipe MDMA HMMA Time (hours) MDMA HMMA Time (hours) Drugwipe MDMA HMMA Time (hours) MDMA NA c NA N.A. N.A 24 d N.A N.A N.A N.A 36 d N.A N.A a) Plasma concentrations expressed in ng/ml b) Urine concentrations expressed in µg/ml c) NA not available d) Spot urine samples HMMA 48 d

47 On-site testing of MDMA ( Ecstasy ) in saliva with Drugwipe and Drugread : a controlled study in recreational users Mònica Navarro 1, Magí Farré 1, Simona Pichini 1,2, Roberta Pacifici 2, Piergiorgio Zuccaro 2,Jordi Ortuño 1, Pere Nolasc Roset 1, Esther Menoyo 1, Jordi Segura 1, Rafael de la Torre 1 1 Department of Pharmacology, Institut Municipal d'investigació Mèdica, Barcelona, Spain 2 Clinical Biochemistry Department, Istituto Superiore di Sanità, Roma, Italy,

48 MDMA in human healthy volunteers Saliva analysis with DRUGWIPE (n=8) DRUGWIPE ON THE TONGUE Nr of cases negative cases positive cases Time (h) DRUGWIPE WITH 2 µl OF SALIVA SAMPLES Nr of cases negative cases positive cases Time (h)

49 ON-SITE TESTING DELLE DROGHE D ABUSO E prevalentemente di ordine orientativo/diagnostico Finora si è sviluppata liberamente, senza confrontarsi con la disponibilità delle risorse, competendo con l attività dei laboratori centralizzati Gli operatori possono essere anche figure professionali non di laboratorio. Corsi di addestramento raramente vengono eseguiti Il controllo di qualità raramente è eseguito e quasi mai documentato Spesso non esiste alcuna forma di controllo da parte del laboratorio

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