METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE

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1 METODICHE DEL DNA RICOMBINANTE

2 ISOLAMENTO DEGLI RNA

3 PRINCIPALI FASI DI UN PROTOCOLLO PER L ISOLAMENTO DEGLI ACIDI RIBONUCLEICI: PRECIPITAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI CON CON SALI ED ETANOLO OMOGENEIZZAZIONE ESTENSIVA DELL ORGANO IN UNA SOLUZIONE CONCENTRATA DI CLORIDRATO DI GUANIDINIO CONTENENTE 2- MERCAPTOETANOLO CENTRIFUGAZIONE ESTRAZIONE DEI LIPIDI E DELLE PROTEINE CON FENOLO

4 OMOGENEIZZATORE POLYTRON

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6 RISOLUBILIZZAZIONE DEL SEDIMENTO DI ACIDI NUCLEICI E ULTRACENTRIFUGAZIONE SU UN CUSCINETTO DI 5,7 M CLORURO DI CESIO RISOLUBILIZZAZIONE DEL SEDIMENTO DI RNA ANALISI SU GEL DI AGAROSIO IN FORMALDEIDE

7 mrna rrna 28S (4718 NT) rrna 18S (1874 NT) rrna 5,8S e 5S, trna ( NT)

8 SELEZIONE DEL POLI(A)+ RNA

9 FIGURA 7.2 DNA RICOMBINANTE

10 mrna

11 IL POLI(A)+ RNA PUO ESSERE POI UTILIZZATO PER ESPERIMENTI DI: NORTHERN BLOT COSTRUZIONE DI UN cdna

12 NORTHERN BLOT

13 LA METODICA DEL NORTHERN BLOT CONSENTE DI EVIDENZIARE UNO SPECIFICO RNA MESSAGGERO, DI QUANTIZZARLO E DI DEFINIRNE LA TAGLIA MOLECOLARE. QUESTO PUO AD ESEMPIO SERVIRE A VERIFICARE SE UN GENE E ESPRESSO O MENO IN UN DETERMINATO ORGANO.

14 A QUESTO SCOPO E UTILIZZATA UNA SONDA IN GRADO DI RICONOSCERE SPECIFICAMENTE L RNA DI INTERESSE. LA SONDA E SPESSO RAPPRESENTATA DAL RELATIVO GENE CODIFICANTE, IL CUI FILAMENTO STAMPO PUO LEGARSI IN MODO SPECIFICO ALL RNA DI INTERESSE.

15 FIGURA 8.15 MANGIAROTTI, MODIFICATA FIL. STAMPO (-) 95 C 68 C FIL. CODIF. (+) RNA (+)

16 FIGURA 7.23A DNA RICOMBINANTE

17 RNA FIGURA 7.23B DNA RICOMBINANTE

18 LA DEFINIZIONE DEL PROFILO DI ESPRESSIONE DI UN GENE MEDIANTE NORTHERN BLOT PUO DARE IMPORTANTI INDICAZIONI SULLA SUA FUNZIONE.

19 MARCATURA DI SONDE LA MARCATURA DI SONDE DI DNA PUO ESSERE EFFETTUATA CON VARIE METODICHE. MOLTE DI QUESTE PREVEDONO L USO DI UNA DNA POLIMERASI PER RICOPIARE IL DNA IN PRESENZA DI UN NUCLEOTIDE MARCATO CON 32 P. OVVIAMENTE IL NUCLEOTIDE DOVRA ESSERE UN ALFA 32 P dntp. I DUE METODI DI MARCATURA PIU UTILIZZATI SONO LA NICK TRANSLATION E IL RANDOM PRIMING.

20 NICK TRANSLATION FIGURA 2.16 MANGIAROTTI

21 FIGURA 4.4A GENOMI II

22 FIGURA 1.11 GENOMI II, MODIFICATA LEGAME IDROLIZZATO DALLA DNASI I

23 RANDOM PRIMING DENATURAZIONE IBRIDAZIONE DEI PRIMER FRAM. KLENOW, dntps

24 CLONAGGIO DEL DNA CLONARE SIGNIFICA PRODURRE UNA SERIE DI CLONI, CIOE COPIE IDENTICHE DI UNA MOLECOLA O DI UN ORGANISMO. CLONARE UNA MOLECOLA DI DNA SIGNIFICA QUINDI PRODURRE UN ELEVATO NUMERO DI COPIE DELLA MOLECOLA DI DNA IN ESAME.

25 CLONAGGIO

26 LE TECNICHE PER IL CLONAGGIO DEL DNA CONSENTONO DI AMPLIFICARE SPECIFICI GENI E DI ANALIZZARE LA LORO SEQUENZA NUCLEOTIDICA.

27 ESISTONO DUE PRINCIPALI STRATEGIE PER CLONARE UN FRAMMENTO DI DNA: CLONAGGIO IN VETTORI, CHE AVVIENE IN VIVO, CIOE CON L AUSILIO DI CELLULE CHE ASSISTONO L AMPLIFICAZIONE DEL DNA CLONAGGIO MEDIANTE PCR (REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI), CHE AVVIENE IN VITRO, CIOE IN SISTEMI ACELLULARI

29 VA EVIDENZIATO CHE SOLO UNA LIMITATA PERCENTUALE DEI BATTERI SOTTOPOSTI ALLA TRASFORMAZIONE ASSUME IL DNA PLASMIDICO. CIO RENDE NECESSARIA UNA FASE DI SELEZIONE.

30 IL CLONAGGIO NEI VETTORI SI BASA SULL USO DI: ENZIMI DI RESTRIZIONE DNA LIGASI

31 ENZIMI DI RESTRIZIONE

32 GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE SONO ENDODEOSSIRIBONUCLEASI DI ORIGINE BATTERICA CARATTERIZZATE DA UN ELEVATA SPECIFICITA DI SEQUENZA. ESSI SONO ANCHE DEFINITI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE O RESTRITTASI.

33 CIASCUN ENZIMA DI RESTRIZIONE RICONOSCE UNA SPECIFICA SEQUENZA NUCLEOTIDICA E TAGLIA IL DOPPIO FILAMENTO IN QUELLA POSIZIONE O IN PROSSIMITA DI ESSA.

34 FIGURA 4.9 GENOMI II

35 LE ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE SERVONO AL BATTERIO A DEGRADARE DNA ESTRANEO, DIFENDENDOSI COSI DALL INFEZIONE DA PARTE DEI FAGI

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37 Un ceppo batterico, per ogni attività di restrizione, possiede una DNA metilasi che riconosce la medesima sequenza, la quale viene modificata aggiungendo gruppi metilici a residui di adenina o citosina. Di regola, la metilazione blocca il legame dell enzima di restrizione, rendendo il DNA resistente alla scissione.

38 SONO STATE ISOLATE CIRCA 2500 ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E CIRCA 300 SONO COMMERCIALMENTE DISPONIBILI.

39 PRINCIPALI CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI DI RESTRIZIONE DI TIPO II: RICONOSCONO SEQUENZE PALINDROMICHE, IN MAGGIORANZA DI 4 O 6 bp TAGLIANO LE DUE CATENE POLINUCLEOTIDICHE NELLA STESSA POSIZIONE DI SEQUENZA. IN DIPENDENZA DEI SITI DI TAGLIO POSSONO GENERARE FRAMMENTI DI DNA CON ESTREMITA SPORGENTI O PIATTE L IDROLISI DEL LEGAME FOSFODIESTERICO

40 AVVIENE SUL VERSANTE 3 DEL FOSFATO: CIO GENERA FRAMMENTI DI DNA LE CUI CATENE POLINUCLEOTIDICHE HANNO UN FOSFATO IN 5. UTILIZZANO MG ++ COME COFATTORE LA LORO ATTIVITA DIPENDE FORTEMENTE DALLE CONDIZIONI DI ph E FORZA IONICA SONO GENERALMENTE MOLTO SENSIBILI AL CALORE

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42 TABELLA 4.3 GENOMI II

43 NUMERO BASI FREQUENZA TEORICA DI TAGLIO

45 DNA LIGASI

47 ENZIMI DI RESTRIZIONE E DNA LIGASI PERMETTONO DI MANIPOLARE IL DNA IN VITRO ED OTTENERE MOLECOLE DI DNA RICOMBINANTE CIOE FORMATE DA SEGMENTI DI DNA DI ORIGINE DIVERSA

49 I VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDICI TIPICAMENTE CONTENGONO: UN ORIGINE DI REPLICAZIONE UN MARCATORE DI SELEZIONE UN POLYLINKER POLYLINKER ORI AMP

51 L INSERIMENTO DI UN FRAMMENTO DI DNA IN UN PLASMIDE PUO ESSERE OSTACOLATO DA UNA RILIGAZIONE DEL PLASMIDE. IN QUESTI CASI I BATTERI OTTENUTI DALLA TRASFORMAZIONE CON LA MISCELA LIGASICA SARANNO IN PARTE PARENTALI ED IN PARTE RICOMBINANTI.

52 FIGURA 4.16 GENOMI II, MODIFICATA + PLASMIDE RICOMBINANTE PLASMIDE PARENTALE

53 LA SELEZIONE DEI RICOMBINANTI PUO ESSERE EFFETTUATA ESTRAENDO I PLASMIDI DA VARI CLONI BATTERICI ED EFFETTUANDO UNA DIGESTIONE CON L ENZIMA DI RESTRIZIONE PER VERIFICARE IL RILASCIO DELL INSERTO.

54 IN ALTERNATIVA LA SELEZIONE DEI RICOMBINANTI PUO ESSERE NOTEVOLMENTE FACILITATA DALL UTILIZZO DI VETTORI DI CLONAGGIO SPECIFICI QUALI I VETTORI puc

55 FIGURA 4.19 GENOMI II puc18 puc18

56 Galattosio + 5-Bromo-4-cloro-3-indolil- B-D-galattoside (X-Gal) INCOLORE 5-Bromo-4-cloro-3- indolo BLU

57 FIG FONDAMENTI DI BIOL. MOL.

58 IL CLONAGGIO DI UN GENE IN PLASMIDI APPROPRIATI, DENOMINATI VETTORI DI ESPRESSIONE, CONSENTE LA PRODUZIONE IN BATTERI DI PROTEINE DI INTERESSE FARMACEUTICO, QUALI L INSULINA, L ERITROPOIETINA E L ORMONE DELLA CRESCITA.

59 UN VETTORE DI ESPRESSIONE E UN VETTORE DI CLONAGGIO MODIFICATO CONTENENTE ELEMENTI DI CONTROLLO DELL ESPRESSIONE GENICA IN GRADO DI ASSICURARE LA TRASCRIZIONE DEL DNA CLONATO E LA TRADUZIONE DEL RELATIVO TRASCRITTO.

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61 STRUTTURA TIPICA DI UN VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO ORI AMP

62 ATG TAA, TAG O TGA SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO REGIONE 35 REGIONE 10 TERMINATORE DELLA TRASCRIZIONE POLYLINKER

63 CLONAGGIO DEL DNA NEL FAGO LAMBDA

64 I VETTORI DI CLONAGGIO PLASMIDICI POSSONO ACCOGLIERE FRAMMENTI DI DNA LUNGHI POCHE MIGLIAIA DI COPPIE DI BASI. FRAMMENTI DI DNA PIU LUNGHI POSSONO ESSERE CLONATI NEL CROMOSOMA DEL FAGO LAMBDA. IN QUESTO CASO L AMPLIFICAZIONE DEL DNA VIENE OTTENUTA INFETTANDO E.COLI CON IL FAGO RICOMBINANTE.

65 IL CROMOSOMA DEL FAGO LAMBDA E COSTITUITO DA UNA MOLECOLA DI DNA LINEARE DI CIRCA 50 KB PROVVISTA DI ESTREMITA COESIVE.

70 ISOLAMENTO DEL DNA GENOMICO

71 PRINCIPALI FASI DI UN PROTOCOLLO PER L ISOLAMENTO DI DNA GENOMICO 1. SCELTA DELL ORGANO 2. OMOGENIZZAZIONE IN PBS/EDTA 3. LISI DELLE CELLULE E DEI NUCLEI CON SDS 4. DIGESTIONE DELLE PROTEINE CROMATINICHE CON PROTEINASI K 5. ESTRAZIONE DEI FRAMMENTI PEPTIDICI E DEI LIPIDI CON FENOLO

72 6. DIGESTIONE DEGLI ACIDI RIBONUCLEICI CON RNASI A 7. PRECIPITAZIONE DEL DNA GENOMICO CON SALI ED ETANOLO 8. RISOLUBILIZZAZIONE DEL DNA 9. ANALISI DEL DNA MEDIANTE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO

73 IL PBS O PHOSPHATE BUFFERED SALINE E ESSENZIALMENTE UNA SOLUZIONE FISIOLOGICA TAMPONATA. ESSA CONTIENE TAMPONE FOSFATO ph 7,4 E SALI (NaCl e KCl) IN CONCENTRAZIONI TALI CHE LA FORZA IONICA SIA PARI A 0,15 M. acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)

74 SOUTHERN BLOT

75 IL SOUTHERN BLOT E UNA METODICA CHE CONSENTE DI ANALIZZARE UN DNA GENOMICO PER VERIFICARE LA PRESENZA DI UN GENE DI INTERESSE.

76 LA METODICA DEL SOUTHERN PREVEDE LE SEGUENTI FASI: DIGESTIONE DEL DNA GENOMICO CON ENZIMI DI RESTRIZIONE ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO DENATURAZIONE DEL DNA NEL GEL TRASFERIMENTO DEL DNA SU MEMBRANA IBRIDAZIONE CON UNA SONDA MARCATA CON 32P

77 FIGURA 7.23 DNA RICOMBINANTE, MODIFICATA DNA TAGLIATO CON VARI ENZIMI DI RESTRIZIONE DENATURAZIONE CON ALCALI

79 NORTHERN mrna DI INTERESSE (+) SONDA (+) (-) SOUTHERN GENE DI INTERESSE (+) (-) (+) (-) (+) (-) (+) (-)

80 LA SONDA UTILIZZATA IN UN ESPERIMENTO DI SOUTHERN BLOT PUO ESSERE RAPPRESENTATA DA UN GENE OMOLOGO ISOLATO DA UNA SPECIE DIVERSA.

82 L IBRIDAZIONE TRA SONDA E DNA BERSAGLIO IN UN ESPERIMENTO DI ZOOBLOT E POSSIBILE PERCHE LA DOPPIA ELICA IBRIDA PUO TOLLERARE ALCUNI DISAPPAIAMENTI. IN GENERALE SI PUO RISCONTRARE UN CHIARO SEGNALE DI IBRIDAZIONE SE L IDENTITA DI SEQUENZA E MAGGIORE DEL 70 %.

83 DISAPPAIAMENTI O MISMATCH SONDA GENE DI INTERESSE

84 LA METODICA DEL SOUTHERN NON SOLO PERMETTE DI EVIDENZIARE UN GENE MA CONSENTE ANCHE DI DEFINIRNE LA MAPPA DI RESTRIZIONE, CIOE DI STABILIRE LA PRESENZA E LA LOCALIZZAZIONE DI SITI DI RESTRIZIONE NEL GENE ED INTORNO AD ESSO.

85 ESEMPIO: UN DNA GENOMICO E DIGERITO CON VARI ENZIMI DI RESTRIZIONE ED ANALIZZATO MEDIANTE SOUTHERN PER EVIDENZIARE UN GENE DI INTERESSE. Eco R1 Bam H1 Eco R1+ Bam H bp bp bp bp bp

86 I RISULTATI DEL SOUTHERN DEFINISCONO LA SEGUENTE MAPPA DI RESTRIZIONE B E B E B

87 PROGETTAZIONE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE

88 GLI ESPERIMENTI DI SOUTHERN BLOT SONO POSSIBILI ANCHE QUANDO NON SIA DISPONIBILE UNA SONDA NATURALE (GENE OMOLOGO). IN QUESTI CASI SI RICORRE AD UN OLIGODEOSSINUCLEOTIDE SINTETICO (A SINGOLO FILAMENTO) PROGETTATO SULLA BASE DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA DELLA PROTEINA CODIFICATA.

89 FIGURA 7.6 DNA RICOMBINANTE (WATSON)

91 LA SONDA OLIGONUCLEOTIDICA DEVE ESSERE SUFFICIENTEMENTE LUNGA DA RICONOSCERE SELETTIVAMENTE IL GENE DI INTERESSE (ALMENO 17 NUCLEOTIDI MA MEGLIO 20) LA SONDA PUO ESSERE DEGENERATA, CIOE COSTITUITA DA UNA MISCELA DI OLIGONUCLEOTIDI

92 RETROTRADUZIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE

93 SIGLE DELLE BASI AZOTATE

94 GRAFICO DI DEGENERAZIONE OTTENUTO CON UNA FINESTRA DI 6 RESIDUI LIVELLO DI DEGENERAZIONE POSIZIONE DELLA SEQUENZA AMMINOACIDICA

95 INDIVIDUAZIONE DELLA SEQUENZA MENO DEGENERATA

96 SINTESI CHIMICA DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE LA SINTESI E EFFETTUATA IN FASE SOLIDA LA DIREZIONE DI SINTESI E 3 ->5 POSSONO ESSERE SINTETIZZATI OLIGONUCLEOTIDI LUNGHI FINO A 100 NUCLEOTIDI.

97 5 -GGATTTACCGATGACGATGA-3 G A-5 OH T A-G-5 OH A-G-T-5 OH

98 FIGURA 5.5 DNA RICOMBINANTE (WATSON) LA SINTESI PREVEDE L USO DI NUCLEOTIDI FOSFORAMMIDITI IN AMBIENTE ANIDRO DMT = DIMETOSSITRITILE

99 SONDE DEGENERATE CIOE MISCELE DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE POSSONO ESSERE SINTETIZZATE CON UN APPROCCIO COMBINATORIALE.

100 5 -GGATTTACCGATGACGATGA-3 5 -GCATTTACCGATGACGATCA-3 A A G + C T A-G A-C A-G-T A-C-T

101 MARCATURA DI SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE HO-CH2 * GAMMA 32P-ATP A * T4 POLINUCLEOTIDE CHINASI OLIGONUCLEOTIDE

102 COSTRUZIONE ED ANALISI DI GENOTECHE

103 L ISOLAMENTO DI UN GENE DA UNA DETERMINATA SPECIE ANIMALE O VEGETALE VIENE EFFETTUATO IN DUE FASI: 1. CLONAGGIO DI TUTTI I GENI DELLA SPECIE IN ESAME IN MODO DA OTTENERE UNA GENOTECA 2. ANALISI DELLA GENOTECA CON UNA SONDA SPECIFICA PER INDIVIDUARE IL CLONE CONTENENTE IL GENE DI INTERESSE

104 FIGURA 7.6 DNA RICOMBINANTE (WATSON) II EDIZIONE

105 GENOTECA IN E.COLI GENOTECA IN LAMBDA

106 UNA GENOTECA DI UNA DETERMINATA SPECIE (ALTRIMENTI DETTA BIBLIOTECA GENOMICA O LIBRARY GENOMICA) E UNA COLLEZIONE DI MICRORGANISMI, SPESSO RAPPRESENTATI DA E. COLI O DAL FAGO LAMBDA, CIASCUNO DEI QUALI OSPITA E REPLICA CON IL PROPRIO GENOMA UN SEGMENTO DI DNA DELLA SPECIE IN ESAME

108 ---GGATCC---> <--CCTAGG--- Bam H1 ----G <---CCTAG ---GATC---> <---CTAG--- Sau3A GATC---> --- REAZIONE LIGASICA ----GGATC---> <---CCTAG--- SITO IBRIDO

109 FIGURA 13.6B GENOMI II

112 COSTRUZIONE ED ANALISI DI ARCHIVI DI cdna

113 Un cdna E UN DNA COMPLEMENTARE AD UN RNA MESSAGGERO, OTTENUTO IN VITRO MEDIANTE TRASCRIZIONE INVERSA. TRASCRIZIONE INVERSA mrna cdna

114 IL cdna NON HA NECESSARIAMENTE LA STESSA SEQUENZA NUCLEOTIDICA DEL GENE CODIFICANTE, AD ESEMPIO PERCHE NON CONTIENE INTRONI.

115 UN ARCHIVIO DI cdna, ALTRIMENTI DETTO LIBRARY DI cdna, E UNA COLLEZIONE DI cdna, DERIVANTI DA UNO SPECIFICO TRASCRITTOMA, CLONATI IN E.COLI O NEL FAGO LAMBDA. UN ARCHIVIO DI cdna E UTILIZZATO PER ISOLARE SPECIFICI cdna.

120 REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI

121 LA REAZIONE A CATENA DELLA DNA POLIMERASI O POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) CONSENTE DI CLONARE IL DNA IN VITRO

122 PCR

123 FIGURA GENOMI II

124 REAGENTI UTILIZZATI NELLA PCR

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128 I CICLI TERMICI DELLA PCR Denaturazione (1min a 94 C) Extension o polimerizzazione (1min a 72 C) Annealing o ibridazione (1min a C)

129 IL PRODOTTO DI PCR HA UNA TAGLIA MOLECOLARE PARI ALLA DISTANZA TRA I 5 - OH DEI DUE OLIGONUCLEOTIDI PRIMER PCR

131 ESEMPIO DI ANALISI SU GEL DI AGAROSIO DI UN PRODOTTO DI PCR

132 CONFRONTO TRA LE DUE STRATEGIE DI CLONAGGIO CLONAGGIO IN UN VETTORE PLASMIDICO CLONAGGIO MEDIANTE PCR

133 PREGI DELLA PCR: ELEVATA VELOCITA DI ESECUZIONE ELEVATA SENSIBILITA

134 PUNTI DEBOLI DELLA PCR: LE DNA POLIMERASI TERMOFILE POSSONO INTRODURRE MUTAZIONI POSSIBILI AMPLIFICAZIONI ASPECIFICHE DOVUTE A TRACCE DI DNA CONTAMINANTE LIMITATA LUNGHEZZA DEL DNA AMPLIFICABILE

135 PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR: DNA FINGERPRINTING PER ANALISI MEDICO-FORENSI ISOLAMENTO DI GENI ISOLAMENTO DI cdna (RT-PCR) ASSEMBLAGGIO GENI SINTETICI TAILING DI MOLECOLE DI DNA MUTAGENESI SITO-DIRETTA DIAGNOSI DI MALATTIE INFETTIVE DIAGNOSI MALATTIE GENETICHE

136 FIGURA 4.3 GENOMI II GLI OLIGO SERVONO DA SONDE

137 RT-PCR AAAAAA INSIEME DI mrna (TRASCRITTOMA) AAAAAA TTTTTT TRASCRIZIONE INVERSA AAAAAA TTTTTT INSIEME DI cdna PRIMER SPECIFICI PER IL cdna DI INTERESSE TTTTTT 1 CICLO PCR AAAAAA TTTTTT SUCCESSIVI CICLI PCR cdna DI INTERESSE AMPLIFICATO

138 TAILING

139 TABELLA 27.6 DNA RICOMBINANTE

140 LA TIPIZZAZIONE DEL DNA CONSENTE DI DETERMINARE IL PROFILO GENETICO DI UN INDIVIDUO. TALE ANALISI E UTILE IN VARI CAMPI DELLA MEDICINA LEGALE, AD ESEMPIO PER: ANALISI DI PATERNITA RICONOSCIMENTO RESTI CORPOREI TRACCIARE IL PROFILO GENETICO DELL AUTORE DI UN CRIMINE

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