supporto indispensabile alla pratica clinica sospetto diagnostico rapporto costo-beneficio

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2 Premessa Il Laboratorio fornisce supporto indispensabile alla pratica clinica. Il ricorso ad esso deve essere comunque e sempre ragionato. Nella pratica clinica è in particolare indispensabile procedere alla preliminare formulazione del sospetto diagnostico. La limitazione delle risorse economiche già condiziona e condizionerà sempre più in futuro gli interventi medici. La valutazione del rapporto costo-beneficio dovrà essere tenuta in sempre maggiore considerazione dal medico in ogni sua scelta ivi inclusa quella concernente il ricorso all ausilio laboratoristico. I criteri di valutazione dei rapporti costo-beneficio non possono tuttavia essere miopi.

3 Microbiologia Medica Il laboratorio di Microbiologia fornisce sostanziale supporto alla diagnosi, al trattamento ed alla prevenzione della PATOLOGIA DA INFEZIONE sia quella sostenuta da patogeni primari - in soggetti normoreattivi [Patologia Infettiva pr.detta] sia quella sostenuta da patogeni opportunisti o condizionati - in soggetti con difese compromesse (ospiti compromessi)

4 Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto finalizzato alla: acquisizione di conoscenze sulle complessive potenzialità diagnostiche del laboratorio di microbiologia e sulla possibilità che esso fornisca indicazioni per la realizzazione di una terapia mirata delle malattie da infezione e per la messa a punto di adeguate strategie di prevenzione. valutazione del ruolo e della incidenza dei singoli microrganismi nella etio-patogenesi delle diverse malattie da infezione, della loro circolazione in situazioni ambientali differenti, della loro capacità di esibire resistenze ai farmaci antimicrobici, della circolazione, nelle popolazioni microbiche, dei determinanti genetici di resistenza, con acquisizione, in questo caso, di indicazioni per la realizzazione di una terapia ragionata che eviti, quando non richiesto, il ricorso al laboratorio diagnostico di microbiologia, o che comunque possa essere adottata in attesa delle sue risposte.

5 Lo studio della Microbiologia Clinica deve essere pertanto effettuato: Con procedure convenzionali Osservazione della crescita nei terreni di isolamento (morfologia delle colonie e loro caratteri in terreni differenziali, odore, capacità di crescita in presenza o meno di ossigeno, richiesta di atmosfera arricchita in CO 2, ecc.); Osservazione di reazioni chimiche generate in colture in tubi; Evidenziazione di specifiche attività enzimatiche; Risultati della colorazione di Gram; Saggi di agglutinazione; Profili si sensibilità. Con metodi miniaturizzati di esecuzione di reazioni biochimiche convenzionali. Con sistemi basati sul profilo di utilizzazione di substrati opportunamente selezionati al fine di consentire l acquisizione di un insieme di reazioni positivo/negative.

6 Gli accertamenti microbiologici in corso di malattia da infezione si fondano sulla: evidenziazione (con varie metodiche) della presenza di un microrganismo potenzialmente responsabile ed accertamento del suo ruolo patogeno; valutazione della risposta immune, specifica nei confronti di microrganismi ritenuti potenzialmente responsabili,

7 Diagnosi batteriologica Ricerca microscopica nel campione clinico Ricerca di antigeni (o di acidi nucleici) nel campione clinico Coltivazione (amplificazione biologica) Identificazione.

8 Diagnostica microbiologica

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10 Isolamento L isolamento dell agente ha un valore che va oltre la diagnosi etiologica in quanto permette di valutare: caratteristiche infraspecifiche (interesse epidemiologico e preventivo) Fattori di virulenza e di patogenicità Suscettibilità agli antibiotici E necessario ipotizzare su base clinica una gamma di ipotesi etiologiche per ogni ipotesi richiamare lo schema patogenetico corrispondente per decidere quale materiale prelevare, in quale momento ed in quali condizioni inviare il materiale in laboratorio informandolo delle ipotesi da perseguire

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12 PRELIEVO DEL CAMPIONE ZONE NORMALMENTE STERILI Sangue e midollo Liquido cefalo rachidiano (LCR) Liquido articolare o della cavità pleurica Tessuti profondi Vie respiratorie inferiori Urine (se il campione è opportunamente raccolto) ZONE CON POPOLAZIONE BATTERICA RESIDENTE Bocca, naso, vie respiratorie superiori Cute Tratto gastrointestinale Tratto genitale femminile Uretra

13 MODALITA DI RACCOLTA DEL CAMPIONE Raccogliere il campione in quantità sufficiente Scegliere un campione rappresentativo del processo morboso facendo in modo che esso contenga il patogeno da identificare Raccogliere il campione nella fase acuta di malattia e comunque prima dell inizio del trattamento antibiotico Se il trattamento antibiotico è invece già stato iniziato segnalare al laboratorio quale terapia è stata somministrata Evitare contaminazioni da parte di microrganismi esterni

14 MODALITA DI TRASPORTO DEL CAMPIONE Usare contenitori idonei e opportuni terreni di trasporto Etichettare adeguatamente i campioni Completare la richiesta di esame con la diagnosi presunta Inviare rapidamente il campione al laboratorio in appropriate condizioni di temperatura (+4 C o al massimo a temperatura ambiente, mai a 37 C).

15 DISTRIBUZIONE DEI MICRORGANISMI NEL CORPO UMANO

16 ESAME MICROSCOPICO DIRETTO Il campione colorato può fornire indicazioni relativamente a: Presenza o assenza di batteri quantità assoluta di batteri presenti percentuale relativa di Gram + e Gram - localizzazione dei batteri intra o extra-cellulare

17 ESAME MICROSCOPICO DIRETTO L esame microscopico può fornire precise indicazioni diagnostiche: quando si esamini un materiale normalmente sterile o comunque proveniente da zone non in comunicazione con l esterno (liquido cefalo-rachidiano, essudato pleurico o peritoneale, materiale purulento proveniente da raccolte chiuse) quando si esamini un materiale nella cui popolazione batterica normale non siano compresi batteri con i caratteri morfologici e/o tintoriali del batterio osservato

18 ESAME MICROSCOPICO A FRESCO Tale sistema consente di osservare microscopicamente: Forma e disposizione microbica Vitalità del microrganismo Mobilità del microrganismo Osservazione dei batteri difficili da colorare come gli spirilli Tecniche: Osservazione a fresco con comune portaoggetto Esame a goccia pendente (cellula di Kock) Celletta di Ranvier

19 ESAME MICROSCOPICO A FRESCO Evidenziazione di Treponema pallidum in materiale patologico proveniente da una lesione mucosa. Il materiale, non fissato, è osservato in campo oscuro Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

20 COLORAZIONI SEMPLICI Sono quelle che prevedono l impiego di un solo colorante: cristalvioletto fucsina basica blu di metilene Tutti i batteri assumono lo stesso colore e permetted i individuare la morfologia microbica.

21 COLORAZIONI DIFFERENZIALI Sono quelle che prevedono l impiego di più di un colorante: Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Colorazione di Kinyoun Colorazione di Giemsa Colorazione con fluorocromi

22 Colorazione di GRAM

23 COLORAZIONE DI GRAM

24 COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

25 ESAME COLTURALE I terreni di coltura si distinguono in base allo stato fisico in: liquidi (brodo) solidi (brodo normale solidificato con agar) BRODO NORMALE o BRODO NUTRITIVO peptone (composto derivato dalla digestione parziale di proteine animali) 0,5% estratto di carne 0,3% NaCl (per renderla isotonica) tampone fosfato (ph 7,0) H 2 0

26 AGAR COMPOSIZIONE CHIMICA DEI TERRENI Chimicamente definita molto costosi ed utilizzati esclusivamente per l identificazione di batteri con particolari esigenze nutrizionali Indefinita contenenti sostanze naturali quali peptone, siero, liquido ascitico, sangue, estratto di lievito etc. polisaccaride acido estratto da alghe rosse del genere Gelidium, frequenti nei mari tropicali formato per il 70% da agarosio e per il 30% da agaropectina non viene metabolizzato dalla maggior parte dei batteri liquido a temperatura > 80 C addizionato ad un terreno di coltura nella proporzione dell 1,5-2% gelifica a temperatura compresa tra C.

27 Terreni minimi TERRENI Contengono carbonio, azoto, zolfo e fosforo sotto forma di sali inorganici, aggiunti in concentrazione nota Terreni di arricchimento Sono addizionati di: sangue siero estratto di lievito infusi di cuore e cervello carboidrati amminoacidi Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni particolarmente esigenti

28 Terreni selettivi: TERRENI Terreni non selettivi: permettono la crescita di molte specie microbiche coloranti (cristalvioletto, verde brillante, fucsina basica) antibiotici con attività batteriostatica nei confronti dei microrganismi contaminanti. Vengono utilizzati per far crescere microrganismi patogeni che si trovino frammisti alla flora microbica residente (campioni provenienti da pelle, gola, naso, intestino, vagina) Terreni di trasporto Sono semisolidi non posseggono alcun carattere nutrizionale, ma hanno lo scopo di rendere compatibile il trasporto di un campione contenente un agente microbico inibendo le attività enzimatiche e le reazioni di ossidazione

29 TERRENI Terreni differenziali Contengono carboidrati (zuccheri) ed indicatori di ph, che consentono di distinguere tra microrganismi in grado di fermentare specifici carboidrati, in base alla colorazione delle colonie e alla loro morfologia. Indicatori di ph sono: rosso fenolo blu di bromofenolo Agar-sangue Terreno allestito con l aggiunta di 5% di sangue (di montone o di cavallo) utilizzato per evidenziare la capacità di emolisi dei batteri α-emolisi = emolisi parziale che dà luogo alla formazione di un alone verde intorno alla colonia per degradazione della bilirubina a biliverdina ß-emolisi = emolisi completa che dà luogo alla formazione di un alone trasparente intorno alla colonia γ-emolisi = mancanza di emolisi

30 β-emolisi

31 Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin Da: Microbiologia e Microbiologia Clinica R. Cevenini, V.Sambri Piccin

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34 TEMPO DI DUPLICAZIONE DEI BATTERI Escherichia coli (in condizione di coltura ottimali) min Escherichia coli (nell intestino umano) 12 ore Mycobacterium tuberculosis 18 ore Treponema pallidum 33 ore

35 FATTORI CHE INFLUENZANO LA CRESCITA BATTERICA TEMPERATURA Psicrofili C (Listeria monocytogenes anche <10 C) Mesofili C Termofili C OSSIGENO Aerobi obbligati: crescono solo in presenza di ossigeno atmosferico Anaerobi facoltativi: Anaerobi obbligati: Microaerofili: ph Acidofili ph 2-4 Neutrofili ph 5-8 Alcalofili ph 8-11 crescono sia in condizioni aerobie che anaerobie crescono solo in assenza di ossigeno atmosferico crescono in ambienti con ridotta pressione parziale di ossigeno; crescono bene in atmosfera addizionata di CO 2 Il valore ottimale di ph è compreso tra 6,5 e 7,5 PRESSIONE OSMOTICA I microrganismi replicano generalmente meglio in un terreno con concentrazione osmotica più bassa della propria, in quanto questa condizione permette la penetrazione dell acqua all interno della cellula. La pressione osmotica del terreno può essere modificata in base alla concentrazione di cloruro di sodio o di glucosio

36 I batteri aerobi tendono a formare una patina sulla superficie del terreno di coltura liquido. Quando vengono fatti crescere in terreno liquido vengono mantenuti in continua agitazione, perché possano avere sempre disponibile ossigeno atmosferico I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido, depositandosi sul fondo come sedimento. Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l ossigeno atmosferico fino ad esaurirlo Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO 2 e H 2 e successivamente H 2 O con scomparsa dell ossigeno.

37 I batteri anaerobi tendono a rendere torbido il terreno di coltura liquido, depositandosi sul fondo come sedimento Vanno fatti crescere in terreni riducenti ed in incubatori speciali Terreni riducenti sono terreni che contengono dei composti chimici (tioglicolato di sodio) che si combinano chimicamente con l ossigeno atmosferico fino ad esaurirlo Incubatori speciali a tenuta stagna, contengono sostanze chimiche (bicarbonato di sodio e sodio boroidruro) che, quando vengono umidificate, producono CO 2 e H 2 e successivamente H 2 O con scomparsa dell ossigeno.

38 ISOLAMENTO BATTERICO E necessario tenere conto del sito di provenienza del campione: pus liquido cefalo rachidiano sangue generalmente contengono un solo tipo di microrganismo materiale fecale tamponi oro-faringei altri materiali biologici generalmente contengono microrganismi contaminanti, oltre al patogeno o ai patogeni responsabili dell infezione

39 SEMINA PER ISOLAMENTO

40 ISOLAMENTO COLTURALE MEDIANTE TECNICA DELLA DISSEMINAZIONE IN SUPERFICIE Utilizzare terreni solidi in piastre di Petri del diametro di 12 cm. Deporre una piccola quantità di materiale patologico da esaminare al margine della piastra (se il materiale è molto denso stemperarlo con soluzione fisiologica o brodo sterile) Utilizzando una spatola distribuire il materiale sulla superficie del terreno in modo da avere la formazione di colonie ravvicinate nel primo tratto di semina e colonie isolate nell ultimo tratto Successivamente prelevare sterilmente i batteri di una colonia isolata (formata cioè da una sola cellula batterica iniziale) ed allestire una coltura pura

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44 PRINCIPI D IDENTIFICAZIONE DEI BATTERI CARATTERISTICHE NEI TERRENI LIQUIDI

45 Morfologia delle colonie

46 Sistema automatizzato per l identificazione di microrganismi

47 Diagnosi eziologica delle malattie infettive (approcci) Dimostrazione nel materiale patologico dell agente infettivo o di suoi componenti Diagnosi diretta Dimostrazione nell organismo infettato di una risposta anticorpale specifica recente Diagnosi indiretta

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