Come ordinare Geni sintetici Online

Transcript

1 Come ordinare Geni sintetici Online I geni sintetici di Eurofins MWG Operon possono essere ordinati online grazie all esclusivo software GENEius. Di seguito una guida dettagliata per effettuare la richiesta di quotazione e l ordine online. Prima di iniziare Prima di iniziare è necessario raccogliere le seguenti informazioni: La sequenza del gene che deve essere sintetizzato I siti di restrizione e/o altri motifs alle estremità 5 e 3 Nel caso si richieda l adattamento dei codoni, specificare l organismo di interesse e controllare gli stop codons Tipologia di vettori Standard Vector vettore standard selezionato a scelta dai laboratori Eurofins (senza costi aggiuntivi) Commercial unmodified vector vettore non modificato che può essere fornito da Voi o acquistato da Eurofins, la mappa del vettore e la sequenza AB1 sono indispensabili se siete Voi a spedire il vettore Custom modified vector il vettore deve essere da Voi fornito insieme alla mappa e la sequenza AB1 1. Sequenza Selezionare Gene Synthesis Service nel menu (cliccare Order or Request Synthetic genes ). Inserire il nome del vostro gene Inserire la sequenza: dalla sequenza di DNA o di amminoacidi Eurofins MWG Operon sintetizzerà il Vostro gene di interesse DNA Sequence or Amino Acid Sequence In questa pagina è possibile inserire la sequenza di interesse partendo da DNA o da amminoacidi. Se si usa la sequenza amminoacidica, deve essere effettuato l adattamento dei codoni. NB: Siti di restrizione al 5 e al 3 o altri motifs devono essere inseriti come sequenze di DNA nelle apposite stringhe (vedi sotto). - Page 1 -

2 2. Siti di Restrizione Nel caso in cui siano necessari alcuni siti di restrizione fiancheggianti il tuo gene di interesse, è necessario aggiungerne le sequenze negli appositi campi come descritto nell immagine qui sotto. Sequenza di DNA senza necessità di ottimizzazione dei codoni con siti di restrizione Inserire la sequenza di DNA inclusi i siti di restrizione nella sezione A Aggiungere il nome dei siti di restrizione nella sezione D Sequenza di DNA con ottimizzazione dei codoni con siti di restrizione Inserire la sequenza che deve essere ottimizzata nella sezione B Inserire la sequenza dei siti di restrizione ed ogni altra sequenza che non necessiti di ottimizzazione nella sezione C, per essere certi che non subiranno modifiche durante la fase di ottimizzazione Aggiungere il nome dei siti di restrizione nella sezione D Sequenza in amminoacidi con ottimizzazione e con siti di restrizione Inserire la sequenza di amminoacidi nella sezione B Inserire la sequenza dei siti di restrizione nella sezione C Aggiungere il nome dei siti di restrizione nella sezione D Nessun sito di restrizione Cliccare none nella sezione D - Page 2 -

3 3. Codon Usage Adattamento dei codoni Un codone è una serie di 3 nucleotidi (tripletta) che codifica un certo amminoacido. Poiché il codice genetico è degenerato, tutti tranne due amminoacidi sono codificati da più di una tripletta. Organismi diversi mostrano preferenze differenti nell uso di queste triplette per la produzione di amminoacidi. Se si usa il codon usage Adaptation required, il nostro software GENEius adatterà la sequenza data seguendo la tabella del codon usage per l organismo selezionato. Di conseguenza si sintetizzerà una diversa sequenza di DNA che però codifica per la medesima sequenza amminoacidica. Questo migliora sensibilmente l espressione della proteina di interesse in sistemi eterologhi. L adattamento dei codoni sarà effettuato seguendo i vostri setting (step 4). Sequenze di DNA con adattamento dei codoni Il vostro gene sarà sintetizzato tenendo conto di quanto segue: I due siti di restrizione e/o altri motifs alle estremità 5 e 3 saranno sintetizzati come specificato da Voi La sequenza di DNA sarà ottimizzata dal Software GENEius dopo che avrete scelto l organismo per l adattamento e cliccato su Adapt and Optimize the sequence (step6) Inserire le sequenze dei siti di restrizione in 5 e 3 e inserire il nome degli enzimi (es. AstII e EcoRI) nei rispettivi box, vedi sotto DNA sequence or Amino acid sequence Sequenza amminoacidica con adattamento dei codoni e siti di restrizione o altro motif Il tuo gene sarà sintetizzato tenendo conto di quanto segue: I due siti di restrizione e/o motifs al 5 e 3 saranno sintetizzati come specificato. La sequenza amminoacidica data sarà tradotta in DNA. Il software GENEius, una volta specificato l organismo di interesse, ottimizzerà la sequenza ed cercherà di evitare strutture secondarie complesse (step4). Cliccare su Adapt and optimize sequence. Inserire le sequenze dei siti di restrizione in 5 e 3 e inserire il nome degli enzimi (es. AstII e EcoRI) nei rispettivi box NOTA BENE! In caso sia necessario un codone di STOP all estremità 3, inserire uno stop codon (TAA, TAG, TGA) nel box della sequenza in 3 prima della sequenza dei siti di restrizione - Page 3 -

4 4. Bad Motifs e adattamento delle sequenze al Codon Usage Questa opzione è associata con il Codon Usage. Selezionate tutti i DNA motifs che devono essere evitati durante l ottimizzazione. Per esempio bad motifs sono tutti le sequenze dei siti di restrizione messe al 5 e al 3. Selezionare tutti i bad motifs dal menu a tendina o inserire un bad motif individuale (inserire nome e sequenza e cliccare su add Scegliere un organismo dal menu a tendina per l adattamento dei codoni Se l organismo di Vostro interesse non è nella lista, selezionare other e inserire il nome dell organismo nell apposita stringa 5. Selezione del Vettore E possibile scegliere tra diverse opzioni, cliccare su i per ulteriori informazioni. Per default è possibile ricevere il proprio gene sintetico in uno standard lab vector che è un vettore di clonaggio high copy scelto da Eurofins MWG Operon, senza costi aggiuntivi E possibile inviare un vettore commerciale per il subclonaggio cliccando su cloning into a vector of choice ed inserendo tutte le informazioni richieste E anche possibile inviare un vettore modificato da Voi per il subclonaggio, in questo caso è necessario inviare anche tutti i dettagli sulle modificazioni inserite nel vettore, la sequenza (AB1) ed una immagine del plasmide digerito via 6. Servizi aggiuntivi Per venire incontro alle Vostre necessità Eurofins MWG Operon offre un pannello completo di preparazione di plasmidi (La scala Mini è inclusa per default). E disponibile anche la preparazione Endotoxin Free per le scale Maxi e Giga. - Page 4 -

5 7. Analisi della sequenza Il software GENEius veirfica se la sequenza richiesta è Standard o Complex. Se è stata richiesto l adattamento dei codoni, la sequenza sarà per lo più standard. Gene Standard senza ottimizzazione dei codoni Se la vostra sequenza iniziale non contiene strutture secondarie complesse (es. ripetizioni o hairpin) che qualificano la sequenza come complessa, riceverete l informazione che l analisi ha avuto successo. Cliccare su proceed per aggiungere il gene all order basket e chiederne una quotazione Gene Standard dopo ottimizzazione dei codoni Le basi in grassetto sono siti di restrizione che rimangono invariati. Le altre basi sono ottimizzate a seconda dell organismo selezionato. Se volete ordinare la sequenza ottenuta dopo ottimizzazione cliccare su use this sequence. Complex Gene Se la vostra sequenza contiene strutture difficili (e. ripetizioni dirette, strutture secondarie) vi verrà segnalato con il messaggio di seguito: - Page 5 -

6 La sequenza del gene richiesto è classificata come Complex Gene e richiede una valutazione manuale da parte dei tecnici Eurofins esperti di sintesi genica. Cliccare su put into basket e continuare come descritto al punto 8, oppure tornare indietro e utilizzare l adattamento dei codoni per rimuovere Complex Gene Motifs. 8. Order Basket Per richiedere una quotazione o ordinare un gene nella pagina Order basket cliccare su Order/Request a quote La Pagina Summary mostra il prezzo finale per Geni Standard. A questo punto è possibile chiedere una quotazione senza impegno o ordinare direttamente la sintesi della sequenza di interesse. I geni complessi complex Genes devono essere controllati dagli specialisti Eurofins per poter formulare una offerta adeguata. Vi preghiamo di confermare la richiesta di quotazione per ricevere offerta ufficiale via , e per poter in un secondo tempo confermarla direttamente online per renderla un ordine operativo Informazioni aggiuntive possono essere scaricate qui: Gene synthesis FAQ: GENEius (free access test version): Per ulteriori informazioni contattare il distributore italiano dei servizi Eurofins MWG Operon: M-Medical srl Via Merendi Cornaredo 02/ GENEius software is designed and developed for Eurofins MWG Operon by BioLink Informationstechnologie GmbH. - Page 6 - Version 2-12_2012