Applied BioSystems 7500 Campioni Respiratori REF

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1 : Applied BioSystems 7500 Campioni Respiratori Applied BioSystems 7500 Campioni Respiratori REF Uso previsto MycAssay Pneumocystis è studiato per l'uso presso laboratori professionali qualificati per la determinazione qualitativa del DNA genomico di Pneumocystis jirovecii estratto da campioni respiratori ottenuti dalle basse vie respiratorie (ad es. campioni bronchiali) come ausilio alla diagnosi in pazienti adulti con presunta polmonite da P. jirovecii. MycAssay Pneumocystis è stato convalidato per l uso con il sistema Applied BioSystems 7500 (che utilizza il software SDS versione 1.4). Introduzione e spiegazione La polmonite da Pneumocystis jirovecii (ex carinii) (PCP) è una forma comune di polmonite opportunistica in pazienti immunocompromessi, soprattutto quelli con infezione HIV avanzata e AIDS 1. Viene di norma contratta in comunità, è subacuta nella manifestazione e porta ad una progressiva insufficienza respiratoria e a morte 2 se non curata. Di norma si somministra a numerosi pazienti a rischio una profilassi con trimetoprim-sulfametoxazolo (Bactrim o Septrin), una pratica che ha notevolmente ridotto l'incidenza di PCP, anche se si verifica un breakthrough e coloro che non sanno di essere HIV positivi possono ammalarsi di PCP in presenza di AIDS 3. La PCP si manifesta anche in altri pazienti immunocompromessi, fra cui i riceventi di trapianti di organi solidi, i soggetti con ipogammaglobulinemia e leucemia cronica. Attualmente la diagnosi della PCP si basa su metodi microscopici, perché non è possibile effettuare colture di P. jirovecii nei comuni laboratori di microbiologia. Il lavaggio broncoalveolare (BAL) è la tecnica preferenziale per la raccolta dei campioni. I metodi approvati per la diagnosi includono l'immunofluorescenza o fluorescenza diretta (IF) e la colorazione istologica dei campioni 4. è un kit diagnostico molecolare per la determinazione di P. jirovecii basata sulla tecnica PCR con sonde Molecular Beacons 5. L intera procedura di analisi, compresa l estrazione del DNA dal campione clinico, può essere completata in 4 ore oppure in sole 2 ore se il DNA estratto è già disponibile. Questo dosaggio ha il vantaggio diretto di un'aumentata efficienza di laboratorio, associata alla rapidità di analisi che consente di ottenere prevedibili benefici clinici. La precisione diagnostica del test dipende in gran parte dalla qualità del campione. Principi della procedura Dopo aver miscelato i reagenti del kit con un campione contenente la sequenza di DNA bersaglio di Pneumocystis (una porzione della subunità maggiore dei ribosomi mitocondriali di Pneumocystis), il ciclo termico produce l amplificazione del DNA. Il dosaggio contiene inoltre una sequenza del di Amplificazione Interno (IAC), un frammento di DNA non presente in Pneumocystis, altri genomi fungini, batterici o umani, per individuare sostanze inibitorie della PCR e confermare la funzionalità dei reagenti del dosaggio. I bersagli di DNA amplificati vengono individuati con le sonde Molecular Beacons. Si tratta di sonde di ibridazione oligonucleotidiche a singolo filamento, che formano una struttura "stem-and-loop". Il loop (porzione ad anello) contiene una sequenza della sonda complementare alla sequenza bersaglio, mentre lo stem (porzione a colletto) è formato da due sequenze complementari appaiate, disposte su entrambi i lati della sequenza della sonda. Un fluorocromo, che emette luce fluorescente se eccitato da luce a lunghezza d'onda adeguata, viene legato in modo covalente ad un'estremità, mentre un quencher, che sopprime la fluorescenza del fluorocromo se vi si trova fisicamente vicino, viene legato in modo covalente all altra estremità. Le sonde Molecular Beacons non emettono luce fluorescente quando sono libere in soluzione. Tuttavia, quando ibridano con un filamento di acido nucleico contenente una sequenza bersaglio, subiscono una trasformazione conformazionale che consente loro di emettere luce fluorescente. La quantità di fluorescenza in un dato ciclo, o nel ciclo successivo, dipende dalla quantità di ampliconi specifici presenti in quel momento. Il sistema Real- Time PCR monitora simultaneamente la fluorescenza emessa da ogni beacon. 1 Morris A, Lundgren JD, Masur H, Walzer PD, Hanson DL, Frederick T, Huang L, Beard CB, Kaplan JE. (2004). Current epidemiology of Pneumocystis pneumonia. Emerg Infect Dis: 10: Miller RF, Allen E, Copas A, Singer M, Edwards SG. Improved survival for HIV infected patients with severe Pneumocystis jirovecii. pneumonia is independent of highly active antiretroviral therapy. Thorax 2006;61: Kovacs JA, Gill VJ, Meshnick S, Masur H. (2001). New insights into transmission, diagnosis, and drug treatment of Pneumocystis carinii pneumonia. JAMA: 286: Huang L, Morris A, Limper AH, Beck JM; ATS Pneumocystis Workshop Participants. An Official ATS Workshop Summary: Recent advances and future directions in pneumocystis pneumonia (PCP). Proc Am Thorac Soc 2006;3: Tyagi S, Kramer FR. (1996). Molecular beacons: Probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology: 14: Italiano 1

2 Precauzioni Il kit è studiato per l'uso esclusivamente presso laboratori professionali. Sono richieste procedure particolari per la manipolazione dei campioni in modo da prevenire la formazione di aerosol. Nella manipolazione dei campioni vanno rispettate precauzioni standard e norme istituzionali. Myconostica Ltd. mette a disposizione su richiesta la scheda di sicurezza del prodotto. Questo test è previsto esclusivamente per l'uso diagnostico in vitro. Questo test è previsto esclusivamente per l uso con il sistema Applied BioSystems 7500 che utilizza il software SDS versione 1.4. Con questo kit occorre utilizzare strip di provette per PCR MicroAmp Optical (per maggiori informazioni consultare la sezione Materiale occorrente non fornito ). L utilizzo di plastica da laboratorio di diverso tipo potrebbe invalidare i risultati del test. Non utilizzare i reagenti o i controlli se le buste protettive sono aperte o danneggiate al relativo ricevimento. I reagenti e i controlli non sono intercambiabili fra i kit di diversi lotti. Non creare mai pool di reagenti o controlli di diverse provette, anche se appartengono allo stesso lotto. Non utilizzare mai i reagenti o i controlli dopo la data di scadenza. I reagenti e i controlli non devono essere ricongelati o riutilizzati dopo l'apertura. Indossare indumenti protettivi e guanti monouso per manipolare i reagenti del kit. Evitare la contaminazione microbica e da deossiribonucleasi (DNAsi) dei reagenti durante il prelievo di aliquote dalle provette. Si raccomanda l'impiego di puntali per pipetta con filtro monouso, a bassa ritenzione, sterili, esenti da DNAsi oppure puntali per pipetta a spostamento positivo. Utilizzare un nuovo puntale per ogni campione o reagente. Smaltire i reagenti non utilizzati e i materiali di scarto in conformità con le normative nazionali, federali, statali e locali. Per evitare la contaminazione da ampliconi di Pneumocystis o di Amplificazione Interno (IAC), non aprire le provette di reazione dopo l'amplificazione. Possono essere testate ulteriori sostanze di controllo in conformità con le direttive o i requisiti delle organizzazioni locali, statali, provinciali e/o federali o di certificazione. Non mangiare, bere o fumare nei locali dove vengono manipolati i campioni o i reagenti del kit. Basse concentrazioni di DNA possono risultare instabili se non conservate correttamente. Si raccomanda di conservare le estrazioni del DNA dai campioni clinici a -80 o C per preservarne l integrità. Se possibile, si raccomanda inoltre di evitare molteplici cicli di scongelamento e ricongelamento. Italiano 2

3 Contenuto del kit Descrizione Il kit è costituito da cinque buste di alluminio sigillate a 3 scomparti, ciascuna delle quali può essere utilizzata separatamente. Ogni busta contiene reagenti sufficienti per 8 reazioni. Volume Provetta 1 (Cappucci o arancione) dntp MgCl 2 Soluzione tamponata di complesso DNA-polimerasi 66 µl Provetta 2 (Cappucci o blu) Provetta 3 (Cappucci o trasparent e) Provetta 4 (Cappucci o nero) Primer < 0,01% Sonde Molecular Beacons < 0,01% di Amplificazione Interno (IAC) <0,0001% Il di Amplificazione Interno è un DNA plasmidico ricombinante contenente una sequenza non infettiva senza legami con la sequenza bersaglio (di Pneumocystis). Tampone Tris-HCl negativo Acqua positivo DNA di controllo positivo < 0,0001% La molecola del controllo positivo è un plasmide ricombinante contenente le sequenze bersaglio di Pneumocystis. Tampone Tris-HCl 66 µl 25 µl 25 µl Il kit contiene inoltre: CD-ROM del protocollo Myconostica Istruzioni per l'uso Certificato di analisi Conservazione Il kit deve essere conservato congelato (fra -15 e -25 C) fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta applicata sulla confezione. Alla scadenza il kit deve essere smaltito in conformità con le normative locali. Una volta aperta una busta, il relativo contenuto deve essere utilizzato immediatamente. Non ricongelare né riutilizzare. Materiale occorrente non fornito Sistema Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR (incluso il manuale d'uso, il computer collegato e il Software SDS versione 1.4). Strip da 8 provette MicroAmp Optical (Applied BioSystems, art. n ). Strip da 8 cappucci MicroAmp Optical (Applied BioSystems, art. n ). Microcentrifuga con adattatore per provette per PCR da 0,2 ml. Agitatore tipo Vortex Rack di supporto per provette per PCR. Micropipette (volumi necessari 7,5 µl - 20 µl) Puntali con filtro a bassa ritenzione, sterili Guasti monouso, non talcati Soluzione decontaminante proprietaria per rimuovere contaminazioni da DNA Pennarello indelebile Kit di isolamento del DNA (vedere di seguito) Italiano 3

4 Campioni I campioni per il dosaggio sono costituiti dal DNA totale estratto dai campioni clinici di BAL. A tale scopo si raccomanda l impiego del kit e dell apparecchiatura per l isolamento del DNA forniti da Myconostica Ltd., utilizzati anche per la procedura di convalida: - Kit di estrazione per DNA fungino MycXtra (Art. n : disponibile presso Myconostica) - Agitatore Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc., New York, USA) - Piastra adattatore per agitatore Vortex (Art. n : disponibile presso Myconostica) Note sulla procedura Prima di cominciare, leggere integralmente il protocollo. L intero processo di analisi con (esclusa l'estrazione del DNA) dura all'incirca 2 ore, a seconda del numero di campioni testati. La preparazione del test deve essere eseguita in una stazione di lavoro PCR o in un area di laboratorio pre-pcr. Se non è disponibile una stazione di lavoro PCR, il test deve essere preparato in un'area dedicata del laboratorio 6, da pulirsi regolarmente con agenti decontaminanti contro il DNA. Evitare, tuttavia, di utilizzare agenti decontaminanti contro il DNA quando si prepara il dosaggio Real-Time PCR, perché possono inibire il dosaggio. Utilizzare micropipette per trasferire i fluidi. Utilizzare micropipette dedicate per la preparazione di queste reazioni e sottoporle a regolare decontaminazione. Si raccomanda di utilizzare puntali con filtro a bassa ritenzione per accertarsi che non vada perso DNA durante la procedura di preparazione. Osservare cautela durante la manipolazione della Provetta 4, perchè contiene il DNA stampo e un'eventuale contaminazione potrebbe portare a risultati di analisi falsamente positivi. Indossare sempre guanti protettivi. Tutte le provette devono essere chiuse con i rispettivi cappucci dopo l'uso e prima dello smaltimento. Annotare esattamente le posizioni dei campioni quando si processano numerosi campioni di pazienti. Procedura per l'uso: 1. Preparazione del dosaggio Real-Time PCR 1.1 Per cominciare accendere il sistema AB7500 Real-Time PCR (strumento e computer associato) e lanciare il software SDS v1.4. Inserire i nomi utente e le password necessari. 1.2 Accertarsi che l area di lavoro sia stata pulita con agenti decontaminanti contro il DNA e che sia perfettamente asciutta; evitare però di utilizzare questi agenti durante la preparazione del dosaggio, perché un eccessiva quantità di soluzione decontaminante può inibire le reazioni PCR. 1.3 Una busta contiene rispettivamente una Provetta 1, una Provetta 2, una Provetta 3 e una Provetta 4. I reagenti di una busta sono sufficienti per eseguire 8 reazioni. Occorre includere almeno un controllo positivo e un controllo negativo in ogni analisi con i reagenti dello stesso lotto. Una busta consente quindi di analizzare 6 campioni di pazienti. Per analizzare più di 6 campioni è possibile utilizzare più buste, a condizione che le buste utilizzate appartengano allo stesso lotto. Utilizzando le 5 buste di un lotto è possibile analizzare al massimo 38 campioni di pazienti. 1.4 Calcolare il numero di reazioni necessarie facendo riferimento alla seguente tabella: Numero di buste Numero massimo di campioni di pazienti Togliere dal congelatore il numero adeguato di buste. Non utilizzare le buste che non sono più sigillate. Se i campioni dei pazienti sono stati congelati dopo l estrazione, rimuovere anche questi dal congelatore. 6 Vedere ad esempio Mifflin, T. E. (2003). Setting up a PCR Laboratory. In PCR Primer, 2nd Ed. Dieffenbach and Dveksler). Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. USA. Italiano 4

5 1.6 Aprire il numero necessario di buste ed estrarre le provette. Se si utilizzano più buste, ma si include un solo set di controlli positivi e negativi, è necessario estrarre la Provetta 3 e la Provetta 4 da una sola busta. Osservare cautela durante la manipolazione della Provetta 4, perchè contiene il DNA di controllo positivo e un'eventuale contaminazione potrebbe causare risultati di analisi falsamente positivi. 1.7 Far scongelare il contenuto delle provette collocandole sul banco di laboratorio per 5-10 minuti, e accertarsi che il contenuto di ogni provetta sia completamente scongelato prima di procedere. Miscelare nell agitatore Vortex il contenuto delle provette e i campioni dei pazienti, quindi centrifugarli brevemente in una microcentrifuga affinché tutto il contenuto si raccolga sul fondo delle provette prima dell'uso. 1.8 Collocare il numero necessario di provette per PCR sul rispettivo rack. Non toccare mai con le mani il fondo delle provette di reazione. 1.9 Preparare sempre prima il controllo negativo, seguito dai campioni dei pazienti. Il controllo positivo deve essere preparato sempre per ultimo I volumi dei reagenti e del DNA sono indicati nella tabella sottostante: Reagente Provetta 1 (cappuccio arancione) Provetta 2 (cappuccio blu) Provetta 3 (cappuccio trasparente) Campione paziente del Provetta 4 (cappuccio nero) negativo Reazione Campion e del paziente positivo 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 7,5 µl 10 µl µl µl Volume totale 25 µl 25 µl 25 µl 1.11 Aggiungere i reagenti nell ordine indicato in tabella: Provetta 1, quindi Provetta 2, poi il template (controllo negativo, campione del paziente o controllo positivo). Prestare attenzione quando si prelevano le aliquote della Provetta 1; il liquido è leggermente viscoso e può aderire al bordo interno della provetta. In questo caso, centrifugare di nuovo la provetta per raccogliere il restante contenuto sul fondo prima di cercare di rimuovere le aliquote finali Utilizzare un nuovo puntale per ogni trasferimento di liquido. Dopo l uso, chiudere ogni provetta del reagente utilizzato e gettarla immediatamente con il contenuto eventualmente rimasto in un contenitore per rifiuti clinici sigillabile. I reagenti non utilizzati non possono essere conservati per usi futuri Osservare estrema cautela durante la dispensazione della Provetta 4 (contenente il DNA di controllo positivo) per accertarsi che non contamini altre provette di reazione. Chiudendo i cappucci delle altre provette di reazione prima di aprire la Provetta 4 si può ridurre il rischio di contaminazione crociata Accertarsi che tutte le provette di reazione siano perfettamente sigillate. Annotare la posizione di ogni campione nella strip di provette. Etichettare (ad esempio sul cappuccio) la prima provetta di ogni strip, se vengono utilizzate più strip di provette. Centrifugare le provette di reazione per 10 secondi utilizzando una minicentrifuga con adattatore per provette per PCR da 0,2 ml. Controllare visivamente che non vi siano bolle d aria nei miscugli di reazione Passare immediatamente alla sezione 2. Le reazioni di sono stabili sul banco di laboratorio per 60 minuti Dopo la preparazione del dosaggio PCR accertarsi che l area di lavoro venga accuratamente pulita utilizzando agenti decontaminanti contro il DNA. 2. Esecuzione dell'analisi 2.1 Aprire il Software SDS del sistema AB 7500, versione 1.4, e inserire nome utente e password. 2.2 Inserire il MycAssay Pneumocystis Myconostica Protocol CD-ROM. 2.3 Nel menu Quick Startup selezionare la prima opzione; Create New Document... Italiano 5

6 2.4 Selezionare le impostazioni come indicato di seguito. Selezionare il template MycAssay Pneumocystis SDS1_4v3_1.sdt dal CD-ROM tramite Browse Assegnare all analisi il nome della piastra nella corrispondente casella Plate Name. Di seguito è raffigurato un esempio: 2.6 Cliccare su Finish. Si apre un nuovo documento contenente i parametri PCR; i rilevatori vengono impostati automaticamente per il dosaggio in questione. Nella videata Plate del tab Setup utilizzare la funzione Well Inspector (selezionare un pozzetto e premere Ctrl+1 oppure cliccare con il tasto destro del mouse) per denominare i pozzetti secondo le posizioni dei campioni in Ad esempio, 2.7 Dopo aver denominato opportunamente tutti i pozzetti, salvare l analisi, mantenendo il Plate Name come nome del file. 2.8 Avviare l analisi nel tab Instrument cliccando sul pulsante Start. Per stabilire quanto tempo richiede l esecuzione dell analisi, è possibile osservare il tempo residuo visualizzato accanto al pulsante Start. Italiano 6

7 3. Analisi e interpretazione dei dati 3.1 Al termine dell analisi cliccare sulla freccia verde sulla barra del menu in alto per aggiornare i dati. 3.2 Aprire la videata Amplification Plot del tab Result. Sul lato destro impostare le soglie per ogni canale come segue: PNE MycAssay = MycAssay IAC = 4000 L impostazione Manual Baseline deve rimanere 3-15 per entrambi i rilevatori. 3.3 Cliccare sul pulsante Analyze per attivare le modifiche effettuate. Ad esempio, 3.4 Salvare le modifiche. 3.5 Selezionare i pozzetti contenenti i campioni ed esportare il file Report seguendo il percorso File>Export>Results... come mostra la figura seguente: 3.6 Per evitare confusione, salvare il file con lo stesso nome utilizzato per il file dell analisi. Si rammenta di salvare il file in una destinazione adeguata. 3.7 Se richiesto dal software, attivare la funzione Export only selected wells, quindi cliccare su OK. 3.8 Aprire il file.csv salvato con Excel o un software spreadsheet similare. 3.9 Analizzare ogni campione, partendo dai controlli, come mostra il diagramma di flusso seguente (per i dettagli consultare anche la tabella riportata dopo il diagramma): Italiano 7

8 NO Verificare il controllo negativo Il valore Ct di PNE MycAssay è 39,0 o non è stato rilevato? SÌ L analisi è contaminata AZIONE: ripetere l analisi NO Errore nell analisi AZIONE: ripetere l analisi Verificare il controllo negativo Il valore Ct di IAC MycAssay è ? SÌ Errore nell analisi AZIONE: ripetere l analisi NO Verificare il controllo positivo Il valore Ct di PNE MycAssay è 20,0-26,0? SÌ Positivo per il DNA di Pneumocystis AZIONE: riportare l esito 2 SÌ Verificare il campione del paziente Il valore Ct di PNE MycAssay è < 39.0? NO Negativo per il DNA di Pneumocystis AZIONE: riportare l esito 1 SÌ Verificare il campione del paziente Il valore Ct di IAC MycAssay è 29,0-32,7? NO Errore IAC AZIONE: ripetere il campione. Se il risultato è identico, riportare l esito 3 Campione negativo negativo negativo positivo positivo Paziente Valore Ct di PNE MycAssay 39,0 o non rilevato 39,0 o non rilevato Valore Ct di IAC MycAssay Entro 29,0-32,7 <39,0 Entro 29,0-32,7 Entro 20,0-26,0 Interpretazione negativo accettabile <29,0 o >32,7 Errore nel controllo negativo N/A Contaminazione positivo accettabile <20,0 o >26,0 N/A Errore nel controllo positivo 39,0 o non rilevato Entro 29,0-32,7 Negativo per il Pneumocystis Paziente <39,0 N/A Positivo per il Pneumocystis Paziente 39,0 o non rilevato *Vedere Report clinico per l esito 1, 2 o 3. <29,0 o >32,7 Errore IAC nel campione Ulteriori azioni I risultati del paziente sono validi. Ripetere l intera analisi. Ripetere l intera analisi. I risultati del paziente sono validi. Ripetere l intera analisi. Riportare il risultato: esito 1* Riportare il risultato: esito 2* Ripetere il campione: esito 3* Italiano 8

9 4. Guida alla risoluzione dei problemi 4.1 Il controllo negativo ha prodotto un segnale positivo nel canale FAM: Si è verificata una contaminazione durante la preparazione del dosaggio. I risultati dell intera analisi non possono essere ritenuti affidabili. Ripetere l intera analisi, prestando molta attenzione alla fase di aggiunta dei template, soprattutto il controllo positivo (Provetta 4), per essere certi di escludere una contaminazione crociata. Verificare che l area di lavoro e gli strumenti vengano accuratamente decontaminati prima e dopo l uso. Il controllo negativo è stato collocato in modo errato nello strumento. Accertarsi che tutte le reazioni vengano correttamente registrate nel software e che le strip di provette vengano collocate nello strumento nel senso corretto. Sono state utilizzate provette o piastre non consigliate. Le soglie sono valide solo se si utilizzano le provette e i cappucci MicroAmp consigliati. 4.2 Il valore Ct IAC del controllo negativo è esterno al range di accettazione: Il dosaggio PCR è stato inibito. Accertarsi che l area di lavoro e gli strumenti siano perfettamente asciutti dopo averli trattati con gli agenti decontaminanti prima di preparare il dosaggio PCR. Le condizioni di conservazione del kit non hanno rispettato le indicazioni riportate nella sezione Conservazione" delle presenti istruzioni per l uso oppure il kit è scaduto. Accertarsi che siano state rispettate le condizioni di conservazione corrette del kit. Verificare la data di scadenza dei reagenti (controllando l etichetta della confezione / della busta) e ripetere l'analisi con un kit non scaduto, se necessario. Il reagente della Provetta 1 o 2 non è stato aggiunto alla reazione PCR oppure è stata aggiunta una quantità doppia della Provetta 2. Ripetere l analisi prestando attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in una provetta di reazione si osserva un livello superiore o inferiore del liquido rispetto al livello nelle altre. Sono state utilizzate provette o piastre non consigliate. Le soglie sono valide solo se si utilizzano le provette e i cappucci MicroAmp consigliati. 4.3 Il controllo positivo è negativo/esterno al range: Le condizioni di conservazione del kit non hanno rispettato le indicazioni riportate nella sezione Conservazione" delle presenti istruzioni per l uso oppure il kit è scaduto. Accertarsi che siano state rispettate le condizioni di conservazione corrette del kit. Verificare la data di scadenza dei reagenti (controllando l etichetta della confezione / della busta) e ripetere l'analisi con un kit non scaduto, se necessario. Si è verificato un errore durante la preparazione e il template del controllo positivo (Provetta 4) è stato collocato nella provetta di reazione sbagliata. Ripetere l analisi prestando molta attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in una provetta di reazione si osserva un livello superiore o inferiore del liquido rispetto al livello nelle altre. Il reagente della Provetta 1 o 2 non è stato aggiunto alla reazione. Ripetere l analisi prestando attenzione alla fase di preparazione. Sono presenti tali errori se in questa reazione si osserva un livello inferiore del liquido rispetto al livello nelle altre. Il controllo positivo è stato collocato in modo errato nello strumento. Accertarsi che tutte le reazioni vengano correttamente registrate nel software e che le strip di provette vengano collocate nello strumento nel senso corretto. Sono state utilizzate provette o piastre non consigliate. Le soglie sono valide solo se si utilizzano le provette e i cappucci MicroAmp consigliati. Italiano 9

10 4.4 Il/I campione/i del/i paziente/i produce/ono l esito 3 - Invalid : È probabile che il/i campione/i clinico/i estratto/i contenga/ano inibitori della PCR. Consigliamo che il DNA di campioni clinici venga estratto utilizzando il kit di estrazione per DNA fungino MycXtra. 4.5 Mancano risultati per uno qualsiasi dei canali con uno qualsiasi dei campioni o dei controlli. Le condizioni di conservazione del kit non hanno rispettato le indicazioni riportate nella sezione Conservazione" delle presenti istruzioni per l uso oppure il kit è scaduto. Accertarsi che siano state rispettate le condizioni di conservazione corrette del kit. Verificare la data di scadenza dei reagenti (controllando l etichetta della confezione / della busta) e ripetere l'analisi con un kit non scaduto, se necessario. L attrezzatura utilizzata non funziona nel modo ottimale. Verificare che lo strumento Real-Time PCR possieda una cronologia di manutenzione aggiornata e sia stato perfettamente tarato come descritto nella relativa Guida di Installazione e Manutenzione. È stato utilizzato il file del protocollo errato durante la configurazione del software. Consultare la Sezione 2 e selezionare il file del protocollo corretto, come specificato per ogni tipo/versione di software, dal CD-ROM del protocollo Myconostica. È possibile caricare esclusivamente il file corrispondente al software. Ripetere l analisi con il file del protocollo corretto. Sono state utilizzate provette o piastre non consigliate. Le soglie sono valide solo se si utilizzano le provette e i cappucci MicroAmp consigliati. Per qualsiasi domanda o problema non esitate a contattare l Assistenza Tecnica Italiano 10

11 Caratteristiche di performance e limiti Tutte le caratteristiche di performance analitica e clinica e i vantaggi rivendicati per il test MycAssay Pneumocystis sono stati stabiliti originariamente sulla base del sistema Cepheid Smartcycler. Per convalidare il trasferimento del test sulla piattaforma AB7500 Real Time PCR e dimostrare l equivalenza fra le due piattaforme, sono stati ripetuti determinati studi analitici sulla piattaforma AB7500. I risultati di questi studi sono documentati qui di seguito. Sono indicati gli studi che sono stati eseguiti sul sistema Cepheid Smartcycler. Sensibilità analitica Utilizzando il protocollo sopra descritto e una molecola di DNA ricombinante di Pneumocystis generata da Myconostica è stato individuato un limite di rilevamento (LoD) per il Pneumocystis corrispondente a < 30 copie. Questo valore è stato ottenuto utilizzando un DNA plasmidico ricombinante che contiene la sequenza bersaglio. Dato che la sequenza bersaglio di Pneumocystis è mitocondriale, esistono numerose copie per cellula, ma non si conosce esattamente quante. Selettività analitica La selettività analitica è stata testata con il DNA estratto da un ampia gamma di specie fungine e non fungine. Le seguenti specie non hanno prodotto un risultato positivo: Alternaria alternata, Aspergillus flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus, Blastomyces capitatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, Cladosporium spp., Cryptococcus neoformans, Doratomyces microsporus, Fusarium solani, Histoplasma capsulatum, Rhizomucor pusillus, Rhodotonila rubra, Saccharomyces cerevisiae, Scedosporium apiospermum, S. prolificans, Sporothrix schenkii, Trichosporon capitatum. Le seguenti specie batteriche non hanno prodotto un risultato positivo: Bordetella pertussis, Corynebacterium diphtheriae, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, S. pyogenes, S. salivarius. Il DNA genomico umano non produce un risultato positivo con questo test. Sostanze interferenti (controindicazioni per l'uso) (I seguenti dati sono stati generati con il kit durante studi di convalida con il sistema Cepheid SmartCycler. La convalida è stata eseguita per dimostrare l equivalenza di performance fra le piattaforme.) I seguenti composti sono stati testati in concentrazioni clinicamente rilevanti e hanno dimostrato di non inibire il dosaggio: acetilcisteina, amfotericina, beclometasone dipropionato, budesonide, colistimetato sodio, fluticasone propionato, formoterolo fumarato diidrato, ipratropio bromuro, lidocaina, mannitolo, salbutamolo solfato, salmeterolo, Septrin (trimetoprimsulfametoxazolo), sodio cloruro, sodio cromoglicato, terbutalina e tobramicina. Valutazione della performance (I seguenti dati sono stati generati con il kit durante studi di convalida con il sistema Cepheid SmartCycler. La convalida è stata eseguita per dimostrare l equivalenza di performance fra le piattaforme.) In seguito ad analisi di un set di campioni clinici raccolti da diverse popolazioni di pazienti è stato stabilito il cut-off clinico ad un valore Ct pari a 39,0. I campioni clinici ottenuti mediante lavaggio broncoalveolare (BAL), che sono stati raccolti presso 2 ospedali, sottoposti ad estrazione con il kit MycXtra e conservati, sono stati utilizzati per valutare la performance del kit MycAssay TM Pneumocystis. I risultati PCR sono stati confrontati con la microscopia a immunofluorescenza. PCR vs. diagnosi microscopica Microscopia positiva Microscopia negativa PCR ,85 PPV positiva PCR ,94 NPV negativa 0,96 0,80 Sensibilità Specificità Tabella 1: Specificità e sensibilità diagnostica del kit MycAssay TM immunofluorescenza. Pneumocystis rispetto alla microscopia a Italiano 11

12 La tabella 1 rappresenta i dati ottenuti da pazienti con diagnosi di HIV, pazienti senza infezione da HIV e pazienti con stato HIV sconosciuto. I pazienti con polmonite da Pneumocystis presentano una carica fungina rilevabile molto variabile; minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. I pazienti affetti da HIV e polmonite da Pneumocystis tendono a presentare una maggiore carica fungina rilevabile rispetto ai pazienti senza infezione dal virus HIV, ma esiste una considerevole sovrapposizione. Il diagramma di dispersione nella figura 1 evidenzia questa sovrapposizione. A scopo di completezza, dato che il set di dati nella tabella 1 include pazienti il cui stato HVI è sconosciuto, il diagramma di dispersione nella figura 1 comprende anche questo gruppo di pazienti (colonna 3): Categoria 1 = HIV+ / Microscopia+; 2 = HIV-/ Microscopia +; 3 = HIV sconosciuto / Microscopia+ ; 4 = Tutta microscopia- Figura 1: Diagramma di dispersione dei valori Ct ottenuti da DNA estratto dai campioni respiratori di pazienti. Sono rappresentati quattro gruppi. Report clinico Il kit è concepito come un ausilio per la diagnosi della polmonite da Pneumocystis. I risultati devono essere considerati in relazione allo stato clinico del paziente e ai risultati di altri test diagnostici. I report di seguito consigliati hanno carattere indicativo; ciascuno dipende dall'interpretazione dei risultati del dosaggio. Esito n 1 Pneumocystis jirovecii not detected. ( Pneumocystis jirovecii non rilevato. ) Esito n 2 Pneumocystis jirovecii detected. Positive result. State Ct value ( Pneumocystis jirovecii rilevato. Risultato positivo. Indicare il valore Ct ) Esito n 3 Test failed; inhibitors or other unknown substance present. ( Test non riuscito; sono presenti inibitori o altre sostanze sconosciute. ) Minore è il valore Ct, maggiore è la probabilità della malattia. Valori Ct prossimi al cut-off di 39,0 indicano con maggiore probabilità una colonizzazione piuttosto che un infezione, ma alcuni pazienti possono manifestare la malattia con una carica molto bassa di P. jirovecii, il che sta a dimostrare la scarsa qualità del campione, un precedente trattamento o la natura della carica fungina in quel dato paziente. Italiano 12

13 Limiti della procedura Il limite principale di questa procedura riguarda la qualità del campione primario: - Se il campione è molto piccolo oppure non raccolto dalla zona del polmone interessata, il test è meno sensibile e può risultare falsamente negativo. - I campioni di BAL devono essere centrifugati prima dell'estrazione del DNA dal pellet. - I dati hanno inoltre dimostrato che una riduzione del volume del supernatante utilizzato nel processo di estrazione, ottenuto mediante la fase di centrifugazione, abbassa la percentuale di inibitori che entrano nel sistema. Sebbene la procedura di estrazione del DNA fungino MycXtra sia studiata per eliminare gli inibitori della PCR, non sono stati presi in considerazione tutti i farmaci o tutte le popolazioni di pazienti. La procedura non è stata valutata completamente su espettorato, tanto meno su campioni salini indotti o su campioni pediatrici. Risultati falsamente positivi possono derivare dalla contaminazione esterna del campione originale o del test. Tale contaminazione potrebbe essere riconducibile ad aria contaminata da P. jirovecii, tecnica sperimentale di scarsa qualità in relazione al controllo positivo oppure a materiale esterno (in particolare la pipetta) contaminato da DNA di P. jirovecii. Data la possibilità di ottenere un risultato effettivamente positivo per pazienti colonizzati in modo temporaneo o persistente da P. jirovecii, è necessaria una valutazione clinica nell'interpretazione del risultato del test. LICENZA TopTaq TM Hot Start è fornito da QIAGEN. QIAGEN è un marchio registrato di Qiagen GmbH, Hilden, Germania. Questo prodotto è venduto sotto licenza dell'istituto di Ricerca per la Salute Pubblica di Newark nel New Jersey (USA) e può essere utilizzato nel rispetto dei diritti brevettuali del PHRI esclusivamente per la diagnostica umana in vitro. Applied BioSystems è un marchio registrato di Applera Corporation o delle sue consociate negli Stati Uniti e/o in altri paesi. SmartCycler è un marchio registrato di Cepheid, 904 Caribbean Drive, Sunnyvale, CA, 94089, USA. Lab21,184 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 0GA, United Kingdom. Telephone: +44 (0) Facsimile: +44 (0) Italiano 13

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