Lavoro di Diploma Ardia Claudia SSMT 2005/2006. Ricerca eseguita presso: Istituto Cantonale di Microbiologia

Dimensione: px
Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "Lavoro di Diploma Ardia Claudia SSMT 2005/2006. Ricerca eseguita presso: Istituto Cantonale di Microbiologia"

Transcript

1 Messa in evidenza tramite Real-Time PCR del gene della tossina Panton-Valentine leucocidina in ceppi di Staphylococcus aureus meticillino resistenti di acquisizione ospedaliera ed extra ospedaliera. Lavoro di Diploma Ardia Claudia SSMT 2005/2006 Ricerca eseguita presso: Istituto Cantonale di Microbiologia Responsabile: D.ssa Martinetti Lucchini Gladys 1

2 RIASSUNTO L aumento dei ceppi batterici multi-resistenti, dovuto all esposizione continua agli antibiotici per lungo tempo e all abuso di quest ultimi, sta diventando un grosso problema ospedaliero a livello mondiale. Fanno parte di queste famiglie multi-resistenti gli Staphylococcus aureus meticillino resistenti (MRSA).Oltre agli Staphylococcus aureus MRSA d origine nosocomiale, ci sono anche famiglie di Staphylococcus aureus MRSA d origine ambientale, la cui resistenza alla meticillina è già geneticamente predisposta dal battere e non acquisita come succede nei ceppi ospedalieri. Alcuni studi, non ancora definitivi, stanno mettendo in evidenza la presenza del gene della tossina Panton-Valentine leucocidina (PVL) negli Staphylococcus aureus MRSA di origine ambientale piuttosto che negli Staphylococcus aureus MRSA di origine ospedaliera. La teoria ipotizzata da questi studi è la possibilità che il gene PVL diventi un marcatore che ci permetta di differenziare l origine degli Staphylococcus aureus MRSA. Qui è nata l idea e l esigenza di questo lavoro di diploma. L obiettivo di questo lavoro di diploma è mettere in evidenza, tra tutti i campioni presi in considerazione, i ceppi che possiedono il gene PVL e valutare se i miei risultati concordano con le nuove teorie. L obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di assemblare 300 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale e 100 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria dalla collezione dell Istituto Cantonale di Microbiologia e amplificarli tramite la tecnica in Real Time PCR per mettere in evidenza l eventuale gene PVL. Le varie amplificazioni hanno messo in evidenza il gene PVL nel 11% dei ceppi MRSA di origine comunitaria rispetto al 1.3% dei ceppi ospedalieri. La maggior parte dei ceppi PVL positivi sono stati isolati soprattutto da strisci ferita di varia gravità e sono stati coinvolti maggiormente i bambini e gli adulti. In conclusione i risultati ottenuti sono stati interessanti e concordanti con i nuovi studi pubblicati ABSTRACT The increase of multiresistant bacterial strains in the hospital environment in due to the selection pressare of antibiotic use. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major cause of hospital-acquired infection worldwide. Recently, however, there have been reports indicating an increased incidence of MRSA infections afflicting individuals with no apparent risk for hospital acquisition. These community-acquired MRSA strains possess several features that distinguish them from nosocomial MRSA. In particular they carry thes genes for Panton- Valentine leucocidin (PVL), a bicomponent cytotoxin virulence factor associated with skin and soft-tissue infections. The aim of my diploma work is ha detect PVL gene in nosocomial and community acquired MRSA strains. Using Real-Time PCR, a fragment of the PVL gene is amplified with specific primers. A melting curve analysis was performed; this enables an assessment of the specificity of the amplication reaction. The Istituto Cantonale di Microbiologia is collecting MRSA isolates since Two different collections were included in this study. The first collection of 300 strains was isolated from hospitalized patients from , the second from private patients from Those collections were investigated for the presence of the genes coding for PVL. Results of the study indicate a prevalence of PVL positive isolates in the community-acquired MRSA strains. The incidence was 11% comparing to 1.3% of the nosocomial isolates. The majority of strains were isolated from wound swabs, the patients were especially in children and young adults. My results are interesting and in complete agreement with studies published recently. 1

3 INDICE Pagina Introduzione 1-5 Le forme dei batteri 1 Struttura generale di un battere Parete cellulare 2 Membrana citoplasmatica 2-3 Citoplasma... 3 Nucleoide/Plasmide. 3 Ribosomi.. 3 Capsula 3 Flagelli. 3 Pili Fimbrie La colorazione di Gram. 4 Lo Staphylococcus aureus. 4 Lo Staphylococcus aureus MRSA e il gene PVL. 5 Obiettivi del lavoro. 6 Materiale e metodi Criteri di selezione 7 Test MRSA-Screen 8-9 L estrazione del DNA batterico. 9 Real-Time PCR 9-12 LightCycler MasterMix. 10 Programma Staph. PVL Controllo positivo.. 12 Risultati/Discussione Conclusione. 15 Bibliografia Ringraziamenti.. 17 Allegati Metodica MRSA-Screen Metodica estrazione DNA 21 Metodica estrazione controllo positivo 22 Lotto dei Kit utilizzati

4 INTRODUZIONE LE FORME DEI BATTERI I batteri sono microrganismi procarioti di piccole dimensioni, che possono variare tra lo µm, e di differenti forme. Le forme principali sono i cocchi, di forma sferica, i bacilli diritti, che hanno una forma a bastoncello e i bacilli spiraliforme, di forma bastoncellare ma più ricurva. I cocchi possiamo trovarli disposti in modo singolo, a coppie (diplococchi), raggruppati a forma di grappolo (stafilococchi) o in fila come una catena (streptococchi), i bacilli diritti, generalmente, sono disposti singolarmente (piccoli, lunghi, tozzi,..) in modo casuale, a forma di clava (Corinebatteri) o con le estremità appuntite (Fusobatteri), mentre i bacilli spiraliforme possono essere incurvati (Vibrioni) o incurvati a spirale (Spirilli, Spirochete) [1,2]. Figura 1 L immagine mostra la possibile morfologia delle tre Figura 1: classi batteriche, i cocchi, i bacilli diritti e i bacilli spiraliforme; la posizione delle varie spore e dei flagelli [1]. 1

5 STRUTTURA GENERALE DI UN BATTERE Un battere è formato da una parete cellulare e dalla membrana citoplasmatica, dette strutture esterne, e da strutture interne quali il citoplasma, il nucleoide ed i ribosomi. Inoltre alcune specie batteriche possono avere anche delle strutture facoltative come la capsula, i flagelli, i pili e le fimbrie. Figura 2 L immagine rappresenta il modello di un battere con le strutture interne e facoltative [2]. Parete cellulare: È composta da sostanze chimiche presenti solo nei batteri come l acido diamminopimelico, l acido muramico, l acido teicoico, degli amminoacidi, come ad esempio gli amminozuccheri, dei carboidrati e dei lipidi. Unendosi tra di loro formano delle sostanze polimeriche, di cui una molto importante: la mureina. La mureina, o peptoglicano, è indispensabile perché fornisce alla parete cellulare la sua struttura rigida che conferisce al battere la sua forma. La parete cellulare dei batteri gram negativi ha una struttura più ricca di amminoacidi e lipidi rispetto ai batteri gram positivi, che però contengono una maggiore quantità di mureina. Le funzioni della parete cellulare sono: evitare la lisi osmotica del battere, protezione della cellula batterica dall esterno e riconoscimento di batteri o virus nelle vicinanze. Membrana citoplasmatica: La membrana citoplasmatica, si trova subito dopo la parete cellulare ed è formata da un doppio strato di fosfolipidi con intercalate delle proteine. Soprattutto nei batteri gram positivi, in alcuni punti, la membrana forma dei prolungamenti chiamati mesosomi (che svolgono funzioni analoghe alla membrana citoplasmatica). La membrana batterica è molto simile alla membrana cellulare delle cellule eucariote, ma non contiene colesterolo che, negli eucarioti, funge da protezione per le variazioni osmotiche, infatti, i batteri hanno la parete cellulare che svolge anche questa funzione di protezione osmotica. La membrana citoplasmatica ha una funzione: selettiva, grazie alla proteina permeasi che regola l entrata delle sostanze nutritive dall esterno all interno della cellula; di trasporto (proteine di 2

6 trasporto) per le sostanze che devono entrare o uscire dalla cellula; secretoria, cioè che secerne esoenzimi (che servono alla digestione di molecole grandi fuori dalla cellula) ed esotossine. Inoltre, sulla membrana, troviamo delle proteine che servono: alla regolazione e separazione del DNA durante la divisione cellulare, da enzimi che prendono parte al processo di produzione di energia (catena respiratoria), da enzimi necessari alla sintesi della parete cellulare (durante la divisione cellulare) e presenza di proteine sensoriali, cui scopo è ricevere informazioni dall esterno. Citoplasma: Il citoplasma è il luogo dove avvengono tutte le reazioni chimiche del battere, esso è formato soprattutto d acqua, dai ribosomi, enzimi, polisaccaridi come l amido e il glicogeno, ed altre piccole molecole organiche. Nel citoplasma è contenuto anche il nucleoide. Nucleoide/Plasmide: Il nucleoide è formato da un lungo filamento di DNA a doppia elica, cioè il cromosoma batterico, libero nel citoplasma e senza un nucleo attorno. Il cromosoma batterico contiene tutte le informazioni che servono al battere per riprodursi e vivere. Il plasmide è una piccola sequenza di DNA di forma circolare, indipendente dal nucleoide, presente in quasi tutti i batteri, che contiene informazioni supplementari. Le informazioni più importanti che possono essere trasmesse da battere a battere tramite il plasmide sono le resistenze agli antibiotici. Ribosomi: I ribosomi sono degli organelli situati in gruppo vicino alla membrana cellulare e hanno il compito, di sintetizzare le proteine partendo dal RNA messaggero. Capsula: La capsula è uno strato, più o meno spesso, di polipeptidi che avvolge il battere e che lo rende più virulento, cioè più resistente agli attacchi del sistema immunitario rendendo più difficile la sua fagocitosi. Questi polipeptidi sono del materiale di scarto che il battere produce quando si trova in un ambiente favorevole. Flagelli: I flagelli sono delle appendici composte da una proteina elastica, la flagellina, che ruotando su se stessi, permettono il movimento attivo del battere. Sono ancorati alla parete cellulare e possono disporsi in unità singole, monotrichi, diverse unità disposte in un area precisa, lofotrichi, o sparse su tutta la superficie batterica, peritriche. I batteri sprovvisti di flagelli, possono spostarsi solo passivamente tramite peristalsi, per inerzia, con una corrente o tramite l organismo ospite. Pili: I pili sono dei piccoli tubi cavi che partono dalla parete cellulare, e servono allo scambio di materiale genetico (p. esempio i geni della resistenza ad un antibiotico) tra batteri. Fimbrie: Le fimbrie sono dei tubi simili ai pili, ma non sono cavi, e servono al battere per aderire meglio alle superfici delle cellule, aumentando così la sua patogenicità [1,2]. 3

7 LA COLORAZIONE DI GRAM La colorazione di Gram fu inventata dal fisico danese Hans Christian Gram [3], ed è una tecnica semplice, veloce, a basso costo, che permette di dividere i batteri in gram positivi (color viola) e negativi (color rosa), col vantaggio di poter inoltre distinguere la morfologia di quest ultimi [4]. Principio della colorazione: Inizialmente il materiale viene strisciato su un vetrino e poi fissato con metanolo puro, una volta asciutto si copre il materiale con una soluzione di violetto di genziana (primo colorante), che entra all interno della parete cellulare; in seguito il materiale viene ricoperto con un'altra soluzione chiamata Lugol (mordente), che forma un complesso col violetto di genziana. Per la fase di decolorazione viene utilizzato l alcool-acetone, che serve ad asportare fuori dalla cellula il complesso violetto di genziana-lugol. L asportazione del complesso dipende dalla permeabilità della parete cellulare del battere, quindi più la parete cellulare è permeabile, più il battere tenderà a decolorarsi eliminando il colore viola (violetto di genziana); viceversa se la parete cellulare è poco permeabile il battere avrà una colorazione viola. Questa fase è abbastanza delicata, perché se decoloriamo troppo rischiamo di togliere a tutti i batteri la colorazione viola, mentre se decoloriamo troppo poco vedremo solo batteri viola; alterando così l interpretazione del preparato. Comunque l occhio esperto non si basa solo sulla colorazione, ma anche sulla morfologia, il modo in cui si dispone il battere e prende in considerazione anche il tipo di materiale che sta guardando. Dopo la fase di decolorazione, bisogna dare un colore ai batteri decolorati in modo da metterli in evidenza, e per fare ciò viene usata la fucsina, che dà un colore rosa [5]. LO STAPHYLOCOCCUS AUREUS Lo Staphylococcus aureus fa parte dei cocchi gram positivi, anaerobio facoltativo ed è visibile nei preparati con la colorazione di Gram, dove appare in gruppi a forma di grappolo. Sulle piastre di coltura, a occhio nudo, la sua colonia appare bombata, di colore panna-oro e, ma non di regola, su piastra agar-sangue intorno alla colonia può formarsi un alone di emolisi totale (β-emolisi). Tutti gli stafilococchi sono catalasi positivi, mentre solo lo Staphylococcus aureus è anche coagulasi positivo. Le principali patologie provocate da enzimi e tossine prodotte dallo Staphylococcus aureus sono: Affezioni cutanee: foruncoli, ascessi, acne, impetigine, infezioni di ferite. Tossinfezioni alimentari: gastroenteriti (nausea, vomito, diarrea) senza febbre, dopo 1-10 ore dall ingestione di alimenti (carne, creme, latticini, gelati..) contaminati da enterotossine. Infezioni respiratorie: sinusiti, broncopolmoniti, pleuriti. Infezioni ematogene: setticemie, meningiti. L habitat principale dello Staph. aureus sono la cute e le mucose, soprattutto le narici del naso. La trasmissione da un individuo all altro, avviene soprattutto in maniera diretta tramite le mani o indirettamente tramite l aria, ad esempio con uno starnuto [1,2,6]. 4

8 LO STHAPYLOCOCCUS AUREUS MRSA E IL GENE PVL A livello ospedaliero esistono dei ceppi batterici che, grazie ad una continua esposizione agli stessi medicamenti, alla loro mutazione e selezione, e ad uno scambio di informazioni genetiche, sviluppano una resistenza ad uno o più antibiotici. Questi batteri vengono chiamati multi-resistenti. Lo Staphylococcus aureus meticillino resistente (MRSA) è un battere che fa parte dei ceppi multiresistenti che a livello ospedaliero sta creando grossi problemi, sia per la sua resistenza alla meticillina, un antibiotico creato per inibire la crescita dei batteri gram positivi resistenti all antibiotico penicillina, per la presenza di penicillinasi, sia per la sua facile diffusione. Questi ceppi batterici, inoltre, risultano resistenti anche a tutti i β-lattamici e alle cefalosporine. La presenza di ceppi MRSA in un ospedale è fortemente correlata ad un aumento delle batteriemie causate da questo microrganismo, questo fenomeno comporta un aumento sia dei costi che della lunghezza della degenza ospedaliera. Malgrado lo Staphylococcus aureus MRSA è considerato un battere di origine ospedaliera, ci sono alcuni ceppi di origine comunitaria. Questi ceppi comunitari di Staphylococcus aureus MRSA non hanno acquisito la resistenza alla meticillina tramite una continua selezione degli antibiotici. Alcuni studi stanno lavorando sugli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria e stanno mettendo in evidenza un gene che la maggior parte di questi ceppi hanno: il gene della tossina Panton-Valentine leucocidina (PVL). Questo gene da origine ad una tossina, la tossina Panton-Valentine leucocidina. Tutti i ceppi di Staphylococus aureus producono più di 30 tipi di prodotti extracellulari. Quasi tutti i ceppi secernono un gruppo di enzimi e citotossine tra le quali diversi tipi di emolisine, nucelasi, proteasi, lipasi e collagenasi. PVL e,γ emolisine sono considerate appartenenti alla stessa famiglia, infatti agiscono entrambe sulla membrana cellulare per sinergia di due proteine che formano un poro. Lo Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL può causare gravi lesioni a dipendenza del luogo infettato, ma soprattutto lesioni cutanee e complicazioni con possibilità di necrosi del tessuto polmonare. Per tutte queste ragioni, in tutto il mondo, sono stati formati dei gruppi di monitoraggio e di studi per questo battere che sta diventando sempre più di grande importanza clinica L obiettivo finale di questo studio è quello di testare la diffusione del gene PVL nella collezione di ceppi d origine nosocomiale e comunitaria tra gli anni dell Istituto Cantonale di Microbiologia di Bellinzona [7,8,9]. 5

9 OBIETTIVI DEL LAVORO Testare 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale e comunitaria con la tecnica in Real-Time PCR, con l apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche, per mettere in evidenza un eventuale presenza del gene della tossina Panton Valentine leucocidina (PVL). Dopo aver testato i 400 campioni, valutare la percentuale dei ceppi batterici con il gene PVL positivo, la provenienza del campione e il tipo di materiale da cui è stato preso il ceppo. OBIETTIVO PERSONALE Approfondire e migliorare, durante la stesura di questo lavoro, le mie conoscenze sulla tecnica in RT-PCR e sull apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche. 6

10 MATERIALE E METODI Il mio lavoro di ricerca, è cominciato selezionando 400 campioni di Staphylococcus aureus MRSA dalle liste tra il dell Istituto Cantonale di Microbiologia, dove sono contenute tutte le informazioni riguardanti il paziente, la provenienza del materiale (ospedaliero, da medico privato o da cliniche) e che tipo di materiale è stato inviato. A questo punto è stata fatta una scelta fra i vari campioni e con la mia responsabile, D.ssa Gladys Martinetti Lucchini, abbiamo deciso i criteri di selezione: I campioni devono essere scelti negli anni , e ogni anno deve essere rappresentato. Ogni prelievo di materiale deve essere unico, cioè sono stati scartati tutti i materiali che avevano come provenienza lo stesso paziente. I 300 campioni di origine ospedaliera devono provenire da reparti di degenza e sono stati presi in considerazione tre tipi di materiale di partenza, 200 strisci ferita di vario tipo (superficiali, profondi, strisci ascessi, necrosi, decubiti..), 70 espettorati e 30 uricult. Per i 100 campioni di origine extra ospedaliera (medici privati), sono stati presi in considerazione tutti i tipi di materiale d origine (strisci orecchio, naso, emocolture, strisci ferita, espettorati..), semplicemente perché altrimenti non era possibile avere un numero sufficiente di campioni. Sono stati scartati i campioni inviati da cliniche private perché ci siamo concentrati strettamente sui materiali inviati dagli ospedali. La decisione di prendere in considerazione soprattutto gli strisci ferita, gli espettorati e gli uricult è dovuta al fatto che si è riscontrato un aumento degli Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL in particolar modo in questi materiali. Dopo aver creato delle nuove liste di lavoro, ho cercato ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA (tramite il loro numero di archiviazione), conservati in appositi terreni per la congelazione (Skim Milk), nei congelatori a -80 C e, una volta individuati i vari ceppi, inseminarli con la tecnica dei tre settori su piastre Agar-sangue (terreno di arricchimento, arricchito con sangue di montone, dove è ben visibile l emolisi dello Staphylococcus aureus). La tecnica dei tre settori consiste nello spatolare con l ansa il materiale da analizzare su una placca in tre settori ben distinti in modo da diminuire la concentrazione del battere nel materiale, ottenendo delle colonie ben separate nel terzo settore. Quest ultime verranno poi utilizzate per altri test d identificazione. Figura 3 In questa figura sono stati messi in evidenza i tre settori di una placca. 1) primo settore (troviamo una patina dove il battere è fortemente concentrato; 2) secondo settore e 3) terzo settore (troviamo le colonie batteriche isolate)[6]. 7

11 In seguito alla messa su placca del battere, viene posizionato sul primo settore un dischetto dell antibiotico cefoxitina (dove il battere è più concentrato), in modo che le colonie batteriche che si svilupperanno in prossimità del dischetto, serviranno per il test MRSA-Screen. In seguito le piastre sono incubate 24 ore nel termostato a 35 C in CO 2, permettendo una crescita ottimale del battere. La cefoxitina è un antibiotico simile e della stessa famiglia dell antibiotico meticillina, solo che ha il vantaggio di far esprimere meglio al battere la proteina PBP2 (Penicillin Binding Protein 2 ), che è responsabile della resistenza da parte del battere alla meticillina. In seguito la piastra viene tolta dall incubatore e controllata per verificare che sia pura, quindi viene eseguito MRSA-Screen. Figura 4 Questa fotografia rappresenta la crescita di uno Staph. aureus MRSA su placca Agar-sangue, con il dischetto di cefoxitina nel primo settore [14]. TEST MRSA-SCREEN Il kit MRSA-Screen, della ditta DENKA SEIKEN CO LTD di Tokyo, è un test qualitativo ad agglutinazione finale per la ricerca del prodotto del gene meca, la PBP2 (Penicillin Bilding Protein 2 ), che è responsabile della resistenza alla meticillina da parte degli Staphylococcus aureus (Staph. aureus MRSA). Il test MRSA-Screen è eseguito per verificare che la proteina PBP2 non si sia degradata con la conservazione del ceppo batterico. Principio del test: Il test è composto principalmente da due parti, inizialmente il materiale batterico (prelevato con un ansa di platino dall alone, massimo di 13 mm, attorno alla cefoxitina) viene incubato a 95 C per 3 min con il primo enzima di estrazione, in seguito viene aggiunto un secondo enzima di estrazione e il tutto viene poi centrifugato. Il primo enzima di estrazione, crea un ph alcalino che viene poi neutralizzato dal secondo enzima di estrazione. Il cambiamento di ph, permette di staccare la PBP2 che si trova sulla membrana cellulare del battere, per poi ritrovarla nel sopranatante. La positività del test, cioè la presenza della proteina PBP2, viene messa in evidenza tramite l agglutinazione del sopranatante batterico con degli anticorpi monoclonali specifici per la proteina presa in questione. 8

12 Solo i ceppi positivi al MRSA-Screen vengono utilizzati per l estrazione del DNA batterico, nella quale si usa un protocollo rapido. L ESTRAZIONE DEL DNA BATTERICO L estrazione viene eseguita sotto cappa per evitare contaminazioni. Prima di tutto sono risospese 3-5 colonie isolate di materiale batterico in 200 µl di IstaGene Matrix (precedentemente aliquotata nelle Eppendorf safe-look) con dei movimenti rotatori dell ansa di plastica, poi il tube viene vortexato. Questo passaggio è molto importante perché nell Istagene Matrix è contenuto un solvente che si lega gli organelli e alle particelle che vengono rilasciate durante la lisi delle cellule batteriche. Dopo di ciò, l Eppendorf è incubata nel termoblocco a 95 C per 10 minuti; per favorire la lisi batterica. Le cellule lisate vengono centrifugate per 10 minuti a rpm per far scendere sul fondo tutte le particelle pesanti (organelli legati al solvente), così che nel sopranatante rimane solo il DNA purificato pronto per l amplificazione. Il DNA così estratto è conservato a 2-8 C. Una volta fatto l MRSA-Screen, confermando la resistenza alla meticillina, ed estratto il DNA da ogni ceppo di Staphylococcus aureus, bisogna amplificare tramite la Real-Time PCR il DNA del battere per la ricerca della tossina PVL. REAL-TIME PCR La Polymerase Chain Reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare in modo esponenziale il DNA. Per il mio lavoro viene utilizzata la Real-Time PCR che, oltre ad amplificare il DNA, permette di monitorare in tempo reale il prodotto amplificato tramite l utilizzo della molecola fluorescente SYBR Green 1. Questa tecnica in Real-Time PCR è utilizzata sull apparecchio LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics. LightCycler 2.0 Il LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics è un apparecchio che permette di effettuare la tecnica in Real-Time PCR in tempi brevi, circa 1 ora, grazie alla sua velocità nello scambio termico (20 C /secondo). L apparecchio è formato essenzialmente da due unità: il sistema thermocycler e un unità ottica di rilevamento. Il sistema thermocycler è composto da una camera di riscaldamento, controllata da un sistema di riscaldamento posto nel coperchio dell apparecchio, che riscalda o raffredda l aria prelevata dall ambiente esterno in base ai bisogni dalla reazione, mentre l unità di rilevamento è formata da un fluorimetro a microvolume che serve a emettere energia ad una particolare lunghezza d onda che eccita le molecole fluorescenti (SYBR Green 1) nel campione, e a rilevare la fluorescenza emessa a sua volta dal campione. Un'altra parte fondamentale del LightCycler 2.0 sono i capillari in borosilicio. Il sistema thermocycler e il materiale di costruzione dei capillari permettono uno scambio termico molto veloce, che consentono di effettuare la Real-Time PCR in tempi brevi. L apparecchio può amplificare un massimo di 32 campioni per run [11]. 9

13 Figura 5 LightCycler 2.0 system della ditta Roche Diagnostics [12]. MasterMix Per effettuare la reazione in Real-Time PCR il DNA è incorporato in una soluzione di tutti i componenti necessari per l amplificazione del campione. Il MasterMix che utilizzato, è costruito dalle componenti del kit LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green della ditta Roche Diagnostics, e contiene: La molecola SYBR Green 1 (responsabile della fluorescenza) Taq DNA polymerase (enzima che permette l amplificazione) Reaction buffer (soluzione tampone) dntp (nucleotidi: datp, dgtp, dctp e dutp al posto del dttp) Al MasterMix della ditta Roche Diagnostics si aggiunto i due primers PV 1 e PV 2 (sintetizzati dalla ditta Microsynth GmbH di Balgach), l acqua, il cloruro di magnesio (MgCl 2 ) e l UNG alle concentrazioni specificate sotto. I primer sono oligonucleotidi omologhi alle sequenze d inizio e finali del frammento. Primer Staph PV 1 ( 5 GTA AAA TGT CTG GAC ATG ATC CA 3 ) Primer Staph PV 2 ( 5 CAA S 1 TG TAT TGG ATA GCA AAA GC 3 ) L efficienza dell amplificazione è stata ottimalizzata variando la concentrazione dei primers, del cloruro di magnesio e della temperatura di ibridazione dei primers. Il mix finale è così composto [11]: Componenti : Conc. Finale 1 reazione H2O PCR-grade 8.1 µl Master Mix SYBR Green 1 1x 2.0 µl MgCl2 4 mm 2.4 µl Primer STAPH PV µm 1.4 µl Primer STAPH PV µm 1.0 µl UNG 0.1 U 0.1 µl Totale 15.0 µl 1 S = C/G 10

14 Programma Staph. PVL Lo Staph. PVL è il programma specifico per amplificare il DNA e determinare se il ceppo batterico preso in questione ha il gene PVL. Il programma è diviso in 4 parti: UNG, Denaturation, Amplification e la curva di Fusione. CYCLES TARGET ( C) HOLD (hh:mm:ss) RAMP RATE ( C) UNG :05:00 DENATURATION :10:00 20 AMPLIFICATION 95 00:00: :00: :00:18 20 MELTING 95 00:00: :00: :00: COOLING Questa parte del programma serve unicamente a raffreddare i componenti dell apparecchio in modo da renderli maneggiabili. Figura 6 Nella tabella è riportato il programma Staph PVL con i dettegli dei vari step. Il primo step (10 min a 37 C) serve ad attivare l UNG (Uracil-DNA N-Glycosilase), l enzima che elimina le eventuali contaminazioni da DNA già amplificato, chiamate carry-over. Durante l amplificazione, nel mix, si sostituisce il nucleotide dttp con il nucleotide dutp, creando così un DNA artificiale. Nel caso di una contaminazione da DNA già amplificato, l UNG si lega in modo specifico alla sequenza in corrispondenza del nucleotide dutp spezzando la catena nucleotidica. Nel secondo step c è la denaturazione totale del DNA, la disattivazione dell UNG e l attivazione della Hot Start DNA Polymerase. Questo genere di polymerase aumenta la specificità del prodotto, riducendo la formazione di primer dimers. Con denaturazione s intende il cambiamento della conformazione del DNA, cioè la sua struttura a doppia elica viene aperta e si creano due filamenti ben distinti. Nel terzo step avviene l amplificazione del materiale genetico. Nel protocollo del programma Staph PVL l amplificazione dura 35 cicli composti ognuno da tre temperature diverse. Nella prima parte si denatura il DNA ad una temperatura di 95 C. Nella seconda parte la temperatura scende a 52 C permettendo l ibridazione dei primers alle sequenze omologhe. Durante la terza parte la temperatura sale a 72 C e la Taq DNA polymerase riconosce i primer e inizia la sua attività duplicativa utilizzando i nucleotidi datp (A), dgtp (G), dctp (C) e dutp (U) a sua disposizione appaiandoli in modo complementare, A-U(Adenina-Uracile) e C-G (Citosina- Guanina). In questo caso al posto della Timina (dttp) utilizzo l Uracile (dutp), che è una molecola simile alla Timina, per i motivi che riguardano l UNG. In questa fase la molecola SYBR Green 1 si intercala tra, e solo, tra le basi del DNA amplificato emettendo fluorescenza. 11

15 La fluorescenza emanata dalla SYBR Green 1 è proporzionale al DNA amplificato. Il quarto step è rappresentato dalla curva di Melting, che è specifica per ogni prodotto amplificato, in quanto è correlata alla sequenza del frammento. Durante questa fase, composta da un solo ciclo, la temperatura si eleva da 65 C a 95 C in modo molto lento, provocando una graduale denaturazione del DNA e una diminuzione costante della fluorescenza. Quest ultima viene misurata in modo continuo, visibile graficamente come una curva discendente. Il software del computer tramite calcolo informatico riesce a ricostruire un grafico dove viene messa meglio in evidenza la temperatura di fusione. Figura 7 Questa figura rappresenta i due grafici che si ottengono come risultato alla fine di ogni run d analisi. Il primo grafico in alto mostra al curva di Melting, mentre il grafico in basso è il risultato del calcolo informatico del software per mettere meglio in evidenza la temperatura in cui il DNA è completamente denaturato [13]. Controllo positivo Ogni volta che si amplificano dei campioni si utilizzano un controllo negativo e di un controllo positivo. Come controllo negativo utilizzo H 2 O PCR-grade che serve a vedere come si comporta il grafico di un campione senza la sequenza bersaglio e per mettere in evidenza eventuali reagenti contaminati. Il controllo positivo è formato da DNA batterico isolato da un ceppo di Staphylococcus aureus MRSA contenente il gene PVL, con il QIAamp DNA Mini Kit con la sua metodica per l estrazione del DNA, della ditta QIAGEN AG. Il controllo positivo serve a monitorare l efficienza dell amplificazione, cioè in tutte le serie l andamento della fluorescenza dovrà essere simile. Dopo l estrazione il DNA viene diluito a 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 e poi amplificato. Verrà scelta la diluizione di DNA che presenta nel grafico una temperatura di fusione idonea, cioè che si situa tra C. La diluizione idonea verrà aliquotata e conservata a -20 C. 12

16 RISULTATI / DISCUSSIONE Osservando la tabella sottostante, che riassume i risultati ottenuti dalle amplificazioni dei 400 ceppi di Staphylococcus aureus MRSA, possiamo osservare che c è una positività maggiore al gene Panton Valentine Leucocidina nei ceppi di origine comunitaria rispetto ai ceppi di origine nosocomiale. In particolare possiamo dire che su 300 campioni di Staphylococcus aureus MRSA di origine nosocomiale solo 4 ceppi sono risultati positivi al gene PVL, cioè l 1.3%; mentre dei 100 ceppi di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria sono risultati positivi al gene PVL 11 ceppi, ovvero l 11%. Questi dati dimostrano che non tutti gli Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria hanno il gene Panton-Valentine leucocidina, ma una buona parte sì, e questo va a conferma dei risultati dei nuovi studi sul gene PVL. Campioni analizzati N Gene PVL Pos Totale % Ospedalieri Comunitari Totale 400 Figura 8 Riassunto dei dati dei ceppi amplificati. Un altro obiettivo di questo lavoro di diploma è mettere in evidenza il tipo di materiale da cui sono stati isolati gli Staphylococcus aureus MRSA. Nei campioni di origine ospedalieri tutti i ceppi positivi al gene PVL sono stati isolati da strisci ferita, in particolar modo da due strisci ascesso, uno striscio ferita profonda e uno striscio ferita di cui non è stata specificata la gravità. Nessun ceppo PVL positivo è stato isolato dai materiali espettorati ed uricult. Per quanto riguarda i ceppi batterici positivi al gene PVL di origine comunitaria, i materiali d origine sono stati più variati, ma la maggior parte rimangono strisci ferita e più dettagliatamente i materiali sono: uno striscio orecchio, uno striscio naso, tre strisci ferita non specificati, due strisci ferita superficiali, uno striscio ferita profonda, due strisci coscia e uno striscio pus. Riassumendo, il materiale più frequente dove sono stati trovati i ceppi di Staphylococcus aureus MRSA con gene PVL positivo, indipendentemente dall origine del materiale, sono in generale gli strisci ferita; interessante è però notare la gravità di alcuni materiali come gli strisci ascesso e pus. Questa osservazione fa riferimento alla sinergia tra la tossina prodotta dal gene Panton-Valentine leucocidina e la tossina γ-hemolisina, che rendono l attacco batterico più aggressivo. Per esaminare in modo più approfondito i dati di questa ricerca sarebbe stato interessante conoscere la storia clinica del paziente (come si è procurato la ferita?, da quanto dura l infezione?, è peggiorata col tempo?...). Tipo di materiale Totale ceppi PVL Pos Strisci ferita 9 Strisci ascesso 2 Striscio pus 1 Striscio orecchio 1 Striscio naso 1 Figura 9 Riassunto dei materiali con ceppi PVL positivi 13

17 Un altro aspetto dei dati da evidenziare, è che la fascia d età dei pazienti a cui sono stati isolati gli Staphylococcus aureus MRSA con il gene PVL. È interessante notare come tutte le classi d età vengano colpite, ma soprattutto i bambini e gli adulti come descritto da alcuni studi [10]. Classe d'età dove sono stati riscontrati i ceppi PVL positivi Quantità Classe d'età Figura 10 Rappresentazione grafica della quantità dei ceppi PVL positivi nelle varie classi d età. Purtroppo anche in questo caso sarebbe stato interessante avere più informazioni cliniche del paziente riguardante il suo stato di salute, questo ci permetterebbe di capire il grado di aggressività del battere, cioè se il peggioramento dell infezione si è sviluppato su un individuo sano o gia indebolito per altri motivi. Un'altra osservazione è che nella collezione di ceppi analizzati dell Istituto Cantonale di Microbiologia non sono stati riscontrati ceppi di Staphylococcus aureus PVL positivi prima del 1999, il che dimostrerebbe la novità del problema. ANNO N CEPPI ANALIZZATI Quantità Numero di ceppi PVL positivi per ogni anno Anno Figura 11 Il grafico sulla sinistra mostra come sono stati divisi per anno i 400 ceppi di Staph. aureus MRSA analizzati. Il grafico a destra rappresenta la quantità di ceppi con il gene PVL positivi riscontrati per ogni ano. 14

18 CONCLUSIONI Riassumendo le conclusioni principali posso dire che il gene Panton-Valentine leucocidina è riscontrato in modo maggiore nei ceppi di Staphylococcus aureus MRSA di origine comunitaria (11%), e soprattutto in materiali come strisci ferita di varia gravità, strisci ascesso e pus. Questi tipi di materiali mettono in evidenza l aggressività del battere che tende a peggiorare l infezione. Confrontando le date di nascita dei pazienti, risultano interessate tutte le classi d età, ma in particolar modo, i bambini e gli adulti. Inoltre, non sono stati riscontrati ceppi PVL positivi prima del 1999, il che dimostra la novità del problema. In conclusione credo di aver raggiunto tutti gli obiettivi iniziali, sia quelli del lavoro che quelli personali. Per quel che riguarda una possibile continuità di questo lavoro, credo che sarebbe interessante poter fare una ricerca del gene PVL su tutta la collezione dell Istituto e fare la tipizzazione di ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA con il gene Panton-Valentine leucocidina positivo, per essere in grado di determinare se si tratta di un clone oppure se sono ceppi differenti. Come riportato dalla letteratura anche ceppi di Staphylococcus aureus sensibili alla meticillina (MSSA) possono produrre la tossina PVL. I ceppi MSSA provenienti da pazienti con ferite che presentano delle complicazioni dovrebbero essere testati per la presenza del gene PVL. Purtroppo l Istituto di microbiologia conserva i ceppi MSSA solo se provenienti da materiali considerati sterili e perciò uno studio retrospettivo non è possibile. In più credo che sarebbe interessante estendere la ricerca del gene Panton-Valentine leucocidina per ogni ceppo di Staphylococcus aureus MRSA isolato dalla routine per fare un monitoraggio costante, questo permetterebbe una visione della situazione in Ticino. 15

19 BIBLIOGRAFIA 1. Fritz H.Kayser Kurt A.Bienz Johannes Eckert Jean Lindenmann, Handboock di Microbiologia Medica (Immunologia, Batteriologia, Micologia, Virologia, Parassitologia), Mediserve Microbiologia, Atlanti scientifici Gunti, Giunti D:\LDD SSMT\Publicazioni\Loyola Univ_ Health Univ_ Health Sys- Microbiology & Immunology GRAM STAIN TECHNIQUE.htm 4. Manuale di Batteriologia clinica. Dalla teoria alla pratica in laboratorio, Rossetti Roberto, Firenze University Press Dispense varie dell Istituto Cantonale di Microbiologia, Bellinzona 6. Dispense scolastiche del corso di Batteriologia medica tenuto da Claudia Pelli 7. Eurosurveillance, Henry F. Chambers, Community-Associated MRSA- Resistance and Virulence Converge, N ENGL J MED 2005; 352: D. Johnsson, P. Mölling, K. Stalin and B. Söderquist, Detection of Panton-Valentine Leukocidin gene in Staphylococcus aureus by LightCycler PCR: clinical and epidemiological aspects, European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Vandenesch F, Naimi T, Enright MC, Lina G, Nimmo G, Hefferman H e al. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus carryng the Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide emergence. Emerg Infect Dis.2003 Aug ; 9(8): Blanca M.Fernandez Rodriguez, LightCycler Roche Diagnostics, ricerca scolastica di chimica clinica, 2005/ https://www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/lightcycler/system.jsp 13. Grafici LightCycler 2.0 della ditta Roche Diagnostics 14. Foto scattata da Claudia Ardia 16

20 RINGRAZIAMENTI In primo luogo i miei ringraziamenti vanno al Dr. Raffaele Peduzzi, direttore dell Istituto Cantonale di Microbiologia, che mi ha permesso di svolgere questo lavoro di diploma presso il suo Istituto e mi ha concesso il materiale per eseguirlo. In particolare vorrei ringraziare la mia responsabile D.ssa Gladys Martinetti Lucchini e il team della batteriologia e della sierologia per la loro grande disponibilità e pazienza. Vorrei ringraziare anche la D.ssa Valeria Gaia che ha conservato i ceppi più vecchi di Staphylococcus aureus MRSA, che ho potuto utilizzare per questo lavoro di diploma. Inoltre ringrazio il mio docente di metodologia, nonché direttore ad interim, Andrea Boffini per i consigli e il supporto morale di questi anni tre anni ma soprattutto in quest ultimo. Infine ringrazio le docenti Daniela Marcacci, Sonia Marci e Susan Gilbert per l aiuto e interessamento al mio lavoro. 17

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi

Dettagli

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di Ingegneria Genetica e Microbiologa Applicata Prof. Renato Fani Percorso1: Analisi della variabilità genetica di popolazioni

Dettagli

Protocollo Crime Scene Investigation

Protocollo Crime Scene Investigation Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!

Dettagli

Esperienza 10: la PCR

Esperienza 10: la PCR Esperienza 10: la PCR La tecnica della polimerizzazione a catena (in inglese polymerase chain reaction) o PCR, permette di amplificare milioni di volte un unico frammento di DNA. Questo metodo è diventato

Dettagli

Metodiche Molecolari

Metodiche Molecolari Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare

Dettagli

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI 62 1. Pazienti con IBS Per eseguire l analisi del polimorfismo 5HTTLPR è stato necessario ottenere campioni di sangue intero o saliva dai quali estrarre il DNA genomico. A tal fine è

Dettagli

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA

Dettagli

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento

Dettagli

Polymerase Chain Reaction - PCR

Polymerase Chain Reaction - PCR Polymerase Chain Reaction - PCR Real-Time PCR Saggio Saggio di PCR monitorato di continuo Tubi Tubi chiusi Nessuna analisi post PCR Nessuna elettroforesi Caratterizzazione del prodotto Possibilità di quantificare

Dettagli

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING SCOPO DELL'ATTIVITÀ Ciascuno studente estrae il proprio DNA da cellule della mucosa boccale. Quindi, mediante PCR, vengono amplificati frammenti corrispondenti

Dettagli

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano PROGETTO DNA chiavi in mano IFOM PROGETTO DNA

Dettagli

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica

Dettagli

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di

Dettagli

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). End point PCR vs quantitative Real-Time PCR PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando

Dettagli

Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4

Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi mediante Real time PCR Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Ancona

Dettagli

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando

Dettagli

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA

Dettagli

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)

Dettagli

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Moria del pero (Candidatus Phytoplasma pyri) Fitoplasmi: Microrganismi

Dettagli

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

Dettagli

Metodi di analisi mutazionale

Metodi di analisi mutazionale Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,

Dettagli

Struttura e funzioni della cellula. Corso di Biofisica, Università di Cagliari 1

Struttura e funzioni della cellula. Corso di Biofisica, Università di Cagliari 1 Struttura e funzioni della cellula 1 Riferimenti Books and others Biological Physics (updated 1 st ed.), Philip Nelson, Chap. 2 Physical Biology of the Cell, Phillips et al., Chap. 2 Movies Exercise 2

Dettagli

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA Materiali biologici In questo file sono elencati, capitolo per capitolo, i materiali biologici da richiedere al CusMiBio (o centro simile) per realizzare gli esperimenti che abbiamo illustrato (www.cusmibio.unimi.it).

Dettagli

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori Istruzioni d uso BAG Cycler Check REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori pronto all uso, prealiquotato Indice 1. Descrizione del

Dettagli

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E possibile scegliere selettivamente cosa amplificare (specificità)

Dettagli

Esperienza 3: clonaggio di un gene in un plasmide

Esperienza 3: clonaggio di un gene in un plasmide Esperienza 3: clonaggio di un gene in un plasmide Il clonaggio molecolare è una delle basi dell ingegneria genetica. Esso consiste nell inserire un frammento di DNA (chiamato inserto) in un vettore appropriato

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction

PCR - Polymerase Chain Reaction PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA,

Dettagli

Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi

Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi Metodi di laboratorio nel controllo microbiologico degli alimenti: classici ed innovativi Torino, 10-11 Giugno 2013 S.S. Laboratorio Controllo Alimenti fabio.zuccon@izsto.it 1 Aspetti normativi Cosa tratteremo

Dettagli

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi

Dettagli

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono

Dettagli

ENERGIA: FORME UTILIZZATE DALLE CELLULE

ENERGIA: FORME UTILIZZATE DALLE CELLULE ENERGIA: FORME UTILIZZATE DALLE CELLULE NEI PROCESSI ANABOLICI - CHIMICA (ENERGIA METABOLICA): ATP ATP ADP + Pi + Energia che viene utilizzata per "far andare avanti" reazioni chimiche che "vorrebbero

Dettagli

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno).

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Programma: Giorno 1Preparazione di DNA genomico da foglie 2 - Controllo qualità DNA

Dettagli

Identificazione e quantificazione degli acidi nucleici DNA RNA

Identificazione e quantificazione degli acidi nucleici DNA RNA BIOLOGIA MOLECOLARE Identificazione e quantificazione degli acidi nucleici DNA RNA ESTRAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI DNA genomico RNA totale messaggero 1) OMOGENIZZAZIONE LISI Soluzione alcalina concentrata

Dettagli

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo TECNICHE PER L ANALISI

Dettagli

Pellet cellulare. Vortexare per 10-30 sec. Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C

Pellet cellulare. Vortexare per 10-30 sec. Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Guida Rapida Per informazioni sulla sicurezza far riferimento alla sezione Safety del PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol (PN 4367554). Per tutti

Dettagli

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE)

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) SALVATORE GIRLANDO LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE ANATOMIA PATOLOGICA

Dettagli

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare Quantificazione di legionella pneumophila mediante metodo biomolecolare Laboratorio di Epidemiologia Genetica e Genomica di Sanità Pubblica Istituto di Igiene LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA

Dettagli

Strumenti e Tecniche di studio in patologia

Strumenti e Tecniche di studio in patologia Strumenti e Tecniche di studio in patologia Gli strumenti della patologia: Microscopia Biologia molecolare Indagini biochimiche Microscopia Ottica citopatologia ed istopatologia citochimica ed istochimica

Dettagli

SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO

SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO REPARTO GENOMICA LABORATORIO ANALISI GENOMICHE SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO DOCUMENTO ILLUSTRATIVO DEL SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO ACIDI NUCLEICI ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA LOMBARDIA

Dettagli

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA CLM Biotecnologie per l Alimentazione CLM in Biotecnologie Sanitarie Corso di Chimica e certificazione degli alimenti DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA VIRUS ENTERICI virus escreti tramite

Dettagli

BOZZA INDICE 1. INTRODUZIONE... 3 2. PREPARAZIONE DEGLI INOCULI... 4 3. PREPARAZIONE DELLE UNITA DI PROVA E RACCOLTA... 4

BOZZA INDICE 1. INTRODUZIONE... 3 2. PREPARAZIONE DEGLI INOCULI... 4 3. PREPARAZIONE DELLE UNITA DI PROVA E RACCOLTA... 4 Determinazione dell attività sanificante del sistema SUNOX (Pure Health ) indotta dal TiO 2 su superfici contaminate da Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. RELAZIONE

Dettagli

ATI POZZALI FRATELLI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI

ATI POZZALI FRATELLI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI POZZALI FRATELLI - POZZALI FRATELLI Srl Casaletto Ceredano CR - STELLA BIANCA Spa Ossago Lodigiano LO - MOLINO BRESCIANO Snc Azzano Mella BS - CRAM-BIOLAB Srl Brescia

Dettagli

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO La collaborazione con il Virgilio e il progetto dell IFOM Il progetto DNA chiavi in mano è un percorso pensato dal Centro di Ricerca internazionale IFOM per avvicinare i ragazzi

Dettagli

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Il primo passaggio per la maggior parte delle procedure che verranno trattate in questo corso consiste nell estrazione del DNA (e dell RNA) da materiale biologico, e nella sua purificazione mediante separazione

Dettagli

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica: DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di

Dettagli

La regolazione genica nei virus

La regolazione genica nei virus La regolazione genica nei virus Lic. Scientifico A. Meucci Aprilia Prof. Rolando Neri I VIRUS INDICE Caratteristiche dei virus: il capside e il genoma virale Classificazione virale Fasi del ciclo riproduttivo

Dettagli

Controllo microbiologico degli alimenti: metodi a confronto

Controllo microbiologico degli alimenti: metodi a confronto Fiera di Cremona, venerdì 17 aprile 2009 Controllo microbiologico degli alimenti: metodi a confronto Valerio Giaccone Facoltà di Medicina veterinaria Università di Padova Dal 1 gennaio 2006 è entrata in

Dettagli

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 SEDE LEGALE: Via Helsinki 21, 00144 Roma Tel. 06 97998273; Fax 06 52246148 e-mail: orgabiohuman@fastwebnet.it

Dettagli

Il flusso dell informazione genetica. DNA -->RNA-->Proteine

Il flusso dell informazione genetica. DNA -->RNA-->Proteine Il flusso dell informazione genetica DNA -->RNA-->Proteine Abbiamo visto i principali esperimenti che hanno dimostrato che il DNA è la molecola depositaria dell informazione genetica nella maggior parte

Dettagli

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine Università degli Studi del Piemonte Orientale A. Avogadro CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE ALIMENTARE Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi

Dettagli

T V A. Il processo analitico è costituito da tre fasi distinte: a) Estrazione - arricchimento b) Retrotrascrizione c) Amplificazione Real Time TM

T V A. Il processo analitico è costituito da tre fasi distinte: a) Estrazione - arricchimento b) Retrotrascrizione c) Amplificazione Real Time TM genedia DIVISIONE BIOMOLECOLARE DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI RNA HCV MEDIANTE HPA (HIGH PERFORMANCE AMPLIFICATION) T V A L HPA è un protocollo d amplificazione che coniuga le conoscenze acquisite con

Dettagli

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici "Focus su sicurezza d'uso e nutrizionale degli alimenti" 21-22 Novembre 2005 Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici Simona

Dettagli

RNA polimerasi operone. L operatore è il tratto

RNA polimerasi operone. L operatore è il tratto La regolazione genica nei procarioti Alcune proteine vengono prodotte dalla cellula ad un ritmo relativamente costante e l attività dei geni che codificano queste proteine non è regolata in modo sofisticato.

Dettagli

LA GENETICA: DNA e RNA LA GENETICA. DNA e RNA. Prof. Daniele Verri

LA GENETICA: DNA e RNA LA GENETICA. DNA e RNA. Prof. Daniele Verri LA GENETICA DNA e RNA Prof. Daniele Verri L'acido desossiribonucleico o deossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni necessarie per la formazione di RNA e proteine. LA GENETICA:

Dettagli

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare Lotto N. DESCRIZIONE PRODOTTO Quantità annua richiesta Unità di misura Repertorio CND Codice Prodotto, Confezione Offerta e nome commerciale Prezzo unitario

Dettagli

Crescita microbica e metodi di determinazione del numero di cellule

Crescita microbica e metodi di determinazione del numero di cellule Crescita microbica e metodi di determinazione del numero di cellule La crescita microbica La crescita microbica 1 2 2 2 2 3 2 4 2 n Progressione geometrica in base 2 La crescita microbica Tempo di duplicazione

Dettagli

V Giornata di Genetica Forense Roma, 5 giugno 2013 INDAGINI GENETICHE SU REPERTI OSSEI MEDIANTE POWERPLEX FUSION SYSTEM: RISULTATI PRELIMINARI

V Giornata di Genetica Forense Roma, 5 giugno 2013 INDAGINI GENETICHE SU REPERTI OSSEI MEDIANTE POWERPLEX FUSION SYSTEM: RISULTATI PRELIMINARI V Giornata di Genetica Forense Roma, 5 giugno 2013 INDAGINI GENETICHE SU REPERTI OSSEI MEDIANTE POWERPLEX FUSION SYSTEM: RISULTATI PRELIMINARI Silvia Zoppis, Manuela Rosini, Carla Vecchiotti Università

Dettagli

Centro Interdipartimentale di Ricerca per l Innovazione in Viticoltura ed Enologia

Centro Interdipartimentale di Ricerca per l Innovazione in Viticoltura ed Enologia Il DNA come Elemento Tracciante in Spumantizzazione Centro Interdipartimentale di Ricerca per l Innovazione in Viticoltura ed Enologia Dr. Ileana Vigentini IL VINO SPUMANTE METODO CLASSICO (CHAMPENOISE

Dettagli

Aggiornamenti di biologia molecolare nella diagnostica microbiologica. Pier Sandro Cocconcelli

Aggiornamenti di biologia molecolare nella diagnostica microbiologica. Pier Sandro Cocconcelli Aggiornamenti di biologia molecolare nella diagnostica microbiologica Pier Sandro Cocconcelli Istituto di Microbiologia Centro Ricerche Biotecnologiche Università Cattolica del Sacro Cuore Piacenza-Cremona

Dettagli

Corso di aggiornamento

Corso di aggiornamento I n t r o d u z i o n e a l l e t e c n i c h e d i bi o l o g i a m o l e c o l a r e e l o r o a p p l i c a z i o n i ne l L a b o r a t o r i o C l i n i c o Corso di aggiornamento Milano - Sabato

Dettagli

Servizio colture primarie. Istruzioni per l uso di cellule epiteliali bronchiali umane

Servizio colture primarie. Istruzioni per l uso di cellule epiteliali bronchiali umane Servizio colture primarie Istruzioni per l uso di cellule epiteliali bronchiali umane Riassunto del procedimento Il metodo di coltura è basato su due fasi distinte: 1) Espansione del numero di cellule:

Dettagli

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92 PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92 Elementi trasponibili Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in

Dettagli

III Esercitazione 14-15 gennaio 2015. Tampone buccale Estrazione DNA. Preparazione di gel di agarosio Elettroforesi

III Esercitazione 14-15 gennaio 2015. Tampone buccale Estrazione DNA. Preparazione di gel di agarosio Elettroforesi Corso di Laurea in Ottica e Optometria, Università di Padova Insegnamento di Biologia Dr. Stefania Bortoluzzi, Prof. David Baroni, Dr. Francesca Boaretto III Esercitazione 14-15 gennaio 2015 Sommario schematico

Dettagli

FORNITURA IN SERVICE DI SISTEMI ANALITICI PER I LABORATORI DI ANALISI CHIMICO-CLINICHE E MICROBIOLOGICHE E LABORATORI DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA

FORNITURA IN SERVICE DI SISTEMI ANALITICI PER I LABORATORI DI ANALISI CHIMICO-CLINICHE E MICROBIOLOGICHE E LABORATORI DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA FORNITURA IN SERVICE DI SISTEMI ANALITICI PER I LABORATORI DI ANALISI CHIMICO-CLINICHE E MICROBIOLOGICHE E LABORATORI DI MICROBIOLOGIA E VIROLOGIA LOTTO 1: SISTEMA PER IDENTIFICAZIONI ED ANTIBIOGRAMMI

Dettagli

I RISULTATI DELL ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE. Anna Barbui S.C. Microbiologia AOU San Giovanni Battista di Torino

I RISULTATI DELL ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE. Anna Barbui S.C. Microbiologia AOU San Giovanni Battista di Torino I RISULTATI DELL ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI RIFERIMENTO REGIONALE Anna Barbui S.C. Microbiologia AOU San Giovanni Battista di Torino Sorveglianza delle malattie batteriche invasive Diagnosi di laboratorio

Dettagli

TIPI DI CELLULE : PROCARIOTE ED EUCARIOTE

TIPI DI CELLULE : PROCARIOTE ED EUCARIOTE TIPI DI CELLULE : PROCARIOTE ED EUCARIOTE Tutti i tipi cellulari presenti sul nostro pianeta appartengono ad uno di due gruppi fondamentali: procarioti ed eucarioti. I termini procariota (dal greco pro

Dettagli

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a)

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2.

Dettagli

1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive

1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive . Biotecnologie 1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive. «Rotor Gene Q una sola piattaforma. per Real Time e High Resolution Melt». Sala. 19/21 Gennaio 2011

Dettagli

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

SEQUENZIAMENTO DEL DNA SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico

Dettagli

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING 8-06-2010 TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR REAL TIME PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING BLOTTING delle proteine: MICROARRAYS MACROARRAYS

Dettagli

DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI

DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI LEZIONE 16 Sistemi di regolazione SISTEMI DI REGOLAZIONE A DUE COMPONENTI In che modo un batterio sente e risponde a specifici segnali provenienti dall ambiente? Per esempio, nel caso dell operone lac

Dettagli

Prof.ssa Gamba Sabrina. Lezione 7: IL DNA. Duplicazione e sintesi delle proteine

Prof.ssa Gamba Sabrina. Lezione 7: IL DNA. Duplicazione e sintesi delle proteine Prof.ssa Gamba Sabrina Lezione 7: IL DNA Duplicazione e sintesi delle proteine concetti chiave della lezione Costituzione fisico-chimica del DNA Basi azotate Duplicazione Concetto di geni Rna Trascrizione

Dettagli

LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14 PROTOCOLLO FISH. lezione 12. By NA

LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14 PROTOCOLLO FISH. lezione 12. By NA PROTOCOLLO FISH lezione 12 LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica 2013-14 cromosoma sul vetrino sintesi di una sonda complementare marcata con un fluorocromo FISH denaturazione doppia elica di DNA AT C

Dettagli

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione SINTESI DELL RNA Replicazione Trascrizione Traduzione L RNA ha origine da informazioni contenute nel DNA La TRASCRIZIONE permette la conversione di una porzione di DNA in una molecola di RNA con una sequenza

Dettagli

1 Finalità d uso. 5 Stabilità e modalità di conservazione. 2 Principio del test. 6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e non forniti

1 Finalità d uso. 5 Stabilità e modalità di conservazione. 2 Principio del test. 6 Materiali e strumenti addizionali richiesti e non forniti MYCHLE v.3 1 Finalità d uso RealCycler MYCHLE è un kit di reagenti che permette la rilevazione qualitativa per Real-time PCR del DNA di Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae spp. in campioni

Dettagli

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche I T A L B I O F O R M A i n c o l l a b o r a z i o n e c o n O R D I N E N A Z I O N A L E D E I B I O L O G I o r g a n i z z a i l c o r s o d i a g g i o r n a m e n t o BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione

Dettagli

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la LABORATORIO 2: ESTRAZIONE ED ANALISI ELETTROFORETICA DI DNA GENOMICO Come fare? Seguiamo 3 semplici passaggi: Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la carne) Alcol Cooome?? E' così facile??

Dettagli

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici In questa lezione darò qualche breve cenno sui metodi di sequenziamento del DNA e specialmente quelli con marcatura fluorescente che attualmente vengono effettuati

Dettagli

Capitolo 1 Introduzione alla PCR

Capitolo 1 Introduzione alla PCR Capitolo 1 Introduzione alla PCR La tecnologia della PCR ha rivoluzionato l attività dei laboratori di ricerca e di diagnostica trovando applicazioni ed impieghi in svariati campi della medicina e della

Dettagli

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: PCR e Immunosensori per la determinazione dei batteri patogeni

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: PCR e Immunosensori per la determinazione dei batteri patogeni Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: PCR e Immunosensori per la determinazione dei batteri patogeni Elisabetta Delibato Reparto Pericoli microbiologici connessi agli alimenti METODICHE

Dettagli

Approcci metodologici nella microbiologia delle acque e criticità dei metodi analitici

Approcci metodologici nella microbiologia delle acque e criticità dei metodi analitici Approcci metodologici nella microbiologia delle acque e criticità dei metodi analitici Istituto Superiore di Sanità Roma 30 ottobre 2007 Rossella Briancesco Metodi tradizionali spesso poco sensibili Metodi

Dettagli

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009 Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di 22-26 giugno 2009 DNA umano 1 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine

Dettagli

Plasmidi come vettori di clonaggio

Plasmidi come vettori di clonaggio Plasmidi come vettori di clonaggio Un vettore plasmidico di buona qualità deve possedere le seguenti proprietà: 1. Piccole dimensioni (

Dettagli

Risposta: 2. Uracile. Risposta: 2. legami idrogeno. Adenina, Citosina e Guanina si trovano sia nell RNA che nel DNA.

Risposta: 2. Uracile. Risposta: 2. legami idrogeno. Adenina, Citosina e Guanina si trovano sia nell RNA che nel DNA. Risposta: 2. Uracile Adenina, Citosina e Guanina si trovano sia nell RNA che nel DNA. La Timina si trova soltanto nel DNA; l Uracile si sostituisce alla Timina nelle molecole dell RNA. Risposta: 2. legami

Dettagli

Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010. aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM)

Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010. aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM) Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010 aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM) materiale del T-Rex system pfrt/laczeo = Flp-In target site vector for stable transfection

Dettagli

Progetto della classe II C

Progetto della classe II C Progetto della classe II C Preparazione allo svolgimento dell esperienza La II C è preparata all esperienza presso il centro di ricerca E.B.R.I. iniziando un intenso lavoro di approfondimento sulla genetica

Dettagli

CARLO ERBA Reagents. Biologia Cellulare Biologia Molecolare Labware Chemicals

CARLO ERBA Reagents. Biologia Cellulare Biologia Molecolare Labware Chemicals CARLO ERBA Reagents Biologia Cellulare Biologia Molecolare Labware Chemicals CARLO ERBA Reagents Una nuova realtà per il laboratorio e l industria DASIT GROUP, con l acquisizione di CARLO ERBA Reagents,

Dettagli

Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione

Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione Per la purificazione del DNA genomico proveniente dai kit di prelievo Oragene e ORAcollect. Per le istruzioni

Dettagli

GENETICA seconda parte

GENETICA seconda parte GENETICA seconda parte I cromosomi sono lunghe molecole di una sostanza l acido desossiribonucleico. DNA Il DNA è una lunga catena fatta da due lunghi fili avvolti su se stessi a doppia elica. Sembra una

Dettagli

DNA - RNA. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi.

DNA - RNA. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi. DNA - RNA Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Esistono 4 basi azotate per il DNA e 4 per RNA Differenze

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 017 INT rev. 1 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR LECTINA

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 017 INT rev. 1 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR LECTINA BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag 2

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag

Dettagli

Entamoebahistolytica. G. Di Bonaventura Università G. D Annunzio di Chieti-Pescara

Entamoebahistolytica. G. Di Bonaventura Università G. D Annunzio di Chieti-Pescara Entamoebahistolytica G. Di Bonaventura Università G. D Annunzio di Chieti-Pescara Epidemiologia Phylum: Sarcomastigophora, Subphylum: Sarcodina (amebe), Generi: Entamoeba, Acanthamoeba, Naegleria. Differenti

Dettagli

HISTO SPOT On-Call Typing Kit

HISTO SPOT On-Call Typing Kit Istruzioni per l uso HISTO SPOT On-Call Typing Kit REF 726070 Kit per test di tipizzazione tissutale HLA in biologia molecolare 10 test per HLA-A, B, C, DRB1, DRB3/4/5, DQ, DPB1 IVD 0123 Versione: 03/2014

Dettagli

Metodiche tradizionali

Metodiche tradizionali Diagnostica microbiologica innovativa INTRODUZIONE Attualmente, per la rilevazione dei microrganismi patogeni accanto alle metodiche tradizionali rappresentate: dall esame colturale, l esame diretto al

Dettagli

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione.

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione. Soluzioni ai problemi del Capitolo 12 Domande concettuali C1. A. I geni dei trna codificano molecole di trna e i geni degli rrna le molecole di rrna che si trovano nei ribosomi. Esistono anche dei geni

Dettagli

LE MOLECOLE INFORMAZIONALI. Lezioni d'autore Treccani

LE MOLECOLE INFORMAZIONALI. Lezioni d'autore Treccani LE MOLECOLE INFORMAZIONALI Lezioni d'autore Treccani Introduzione (I) I pionieri della biologia molecolare, scoperta la struttura degli acidi nucleici, pensarono di associare al DNA una sequenza di simboli,

Dettagli

Studio delle popolazioni microbiche riguardanti processi di fermentazione anaerobica in condizioni di mesofilia

Studio delle popolazioni microbiche riguardanti processi di fermentazione anaerobica in condizioni di mesofilia Agenzia Nazionale per le Nuove Tecnologie, l nergia e lo Sviluppo conomico Sostenibile RICRCA DI SISTMA LTTRICO Studio delle popolazioni microbiche riguardanti processi di fermentazione anaerobica in condizioni

Dettagli

La determinazione quantitativa in microbiologia

La determinazione quantitativa in microbiologia La determinazione quantitativa in microbiologia La determinazione quantitativa è una tecnica microbiologica che permette di verificare il numero di microrganismi presenti in un campione, per unità di peso

Dettagli