Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare

Transcript

1 Facoltà di Ingegneria dell Informazione Laurea Specialistica e Magistrale in Ingegneria Informatica Facoltà di Ingegneria dei Sistemi Laurea Magistrale in Ingegneria Biomedica Dipartimento di Elettronica e Informazione Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare Marco Masseroli, PhD marco.masseroli@polimi.it

2 Bioinformatica e Biologia Computazionale per la Medicina Molecolare Misurazione dell Espressione Genica Marco Masseroli, PhD marco.masseroli@polimi.it 2

3 Indice Introduzione Tecniche di analisi di espressione genica Northern blot Analisi di un singolo trascritto DNA microarrays Piattaforme tecnologiche - Filtri di nylon ad alta densità - cdna microarray (spotted) - Microarray di oligonucleotidi Confronto cdna vs oligonucleotidi Riassunto esperimento microarray Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Disegno sperimentale di studi del trascrittoma Esperimenti statici con microarray Esperimenti dinamici con microarray Analisi dati di espressione Acquisizione e pre-elaborazione segnale Data mining Problemi analisi dati di microarray Microarray and Gene Expression Data (MGED) Tools per l analisi dati da microarray 3

4 Introduzione Dai geni alle proteine 4

5 Introduzione Geni di cellula codificano un pool di informazione biologica Espressione genica: conversione di informazione codificata in un gene, prima in RNA messaggero, poi in proteina Non tutti geni sempre necessari alla vita di cellula Solo geni costitutivi sono sempre espressi Altri geni espressi quando serve Espressione geni è regolata da necessità cellula: condizioni ambiente e funzioni da svolgere (es. geni per sintesi lattosio) In organismi pluricellulari: L ambiente di una cellula è l organismo stesso A partire da una stessa cellula, meccanismo regolazione genica differenziale porta ad avere diverse cellule specializzate (tutte con stesso DNA) 5

6 Introduzione L informazione genica è la stessa in tutte le cellule somatiche di un organismo. Specifica la natura di tutte le proteine presenti nell organismo L espressione genica, e quindi proteica, si differenzia a seconda del tipo di cellula e della risposta all ambiente (stato della cellula) Il trascrittoma è l insieme completo dei trascritti e dei loro livelli di espressione in un particolare tipo di cellule o di tessuto in condizioni ben definite In una cellula viene espresso solo 20% circa del trascrittoma N.B. I livelli dei trascritti non si traducono necessariamente in espressione o attività di proteine (alcuni trascritti non sono tradotti; alcune proteine tradotte non funzionano ) 6

7 Introduzione Conoscere genoma e geni non basta per capire come un gene, una cellula, un organismo funzionano Per capire gli organismi biologici nel loro complesso (e complessità) bisogna studiare: regolazione ed espressione dei geni funzionalità delle proteine espresse occorrenze quantitative dei metaboliti effetti dei difetti dei geni sul fenotipo di un organismo Systems biology: studio delle interazioni tra i componenti di un sistema biologico, e di come tali interazioni determinano funzioni e comportamento del sistema 7

8 Introduzione Per l analisi funzionale dei genomi esistono metodi moderni: Trascrittomica Proteomica Metabolomica Generalmente utilizzano procedure high-throughput che richiedono rilevanti attività di gestione e analisi dei dati L obbiettivo è identificare i componenti del sistema (i.e. trascritti, proteine, metaboliti) e loro interazioni e funzioni Tali approcci di genotipizzazione (determinazione genotipo e suoi componenti di un individuo/organismo) devono essere correlati con, e completati da, analisi fenotipiche high-throughput di organismi modello e cellule in vitro 8

9 Tecniche di analisi di espressione genica Dopo sequenziamento (conoscenza della sequenza) e annotazione (conoscenza dei componenti: geni, elementi di regolazione, ) del genoma, l analisi del trascrittoma è importante area di ricerca della scienza genomica funzionale Come si misura l espressione genica? Metodi per esaminare il livello di espressione di un gene alla volta: RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction; amplifica numero di sequenze nucleotidiche specifiche derivate (per transcrittasi inversa) da mrna) Le principali tecniche di analisi di tutto il trascrittoma sono: Microarray a cdna Microarray di oligonucleotidi SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 9

10 Tecniche di analisi di espressione genica 1980: analisi RNA di uno o pochi geni alla volta: Northern Blotting PCR quantitativa (Q-RT-PCR, o real-time PCR) : analisi RNA dell intero genoma (DNA microarrays) Tecniche di biologia molecolare Micro/Nano tecnologie Informatica - Alta densità (potenzialmente misura l RNA di tutto il genoma della cellula) Due tecnologie principali di DNA microarrays: cdna spotted arrays (Schena et al. 1995) Oligonucleotide arrays (Lockhart et al. 1996) 10

11 Northern blot - Analisi di un singolo trascritto Northern blotting: tecnica di laboratorio per studiare l espressione genica individuando l RNA (o mrna isolato) in un campione Normale (riferimento) Patologico Espressione genica: quantificazione del livello di abbondanza di un trascritto in un singolo campione Regolazione genica: comportamento del trascritto in comparazione trattato-controllo Diminuzione dell attività di un gene Aumento dell attività di un gene Comparsa di una nuova attività genica 11

12 Northern blot - Analisi di un singolo trascritto 12

13 Northern blot - Analisi di un singolo trascritto Northern blot: analisi di trascritti (mrna) (video: Southern blot: analisi di DNA (video: Western blot: analisi di proteine 13

14 RT-PCR - Analisi di un singolo trascritto La polymerase chain reaction (PCR) è una tecnica di laboratorio che sfrutta replicazione DNA per amplificare una singola o poche copie di specifica sequenza di DNA, lunga fino a ~10 kb, ma anche fino a 40 kb, sintetizzandone miliardi di copie ( tutorials/dna/4.html) PCR si basa su cicli termici ripetuti di riscaldamento e raffreddamento di una soluzione in cui avviene la reazione di replicazione del DNA (video: v=_ygxcj4n-kq) 14

15 RT-PCR - Analisi di un singolo trascritto La reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) è variante della PCR, in cui un elica di RNA è prima retro-trascritta nel suo DNA complementare (cdna), usando l enzima trascrittase inversa, e il risultante cdna è amplificato mediante PCR tradizionale, o real-time PCR, realizzata in un ciclatore termico per il controllo automatico di tempi e temperatura RT-PCR non va confusa con la real-time polymerase chain reaction, o PCR quantitativa (Q-PCR, o qrt-pcr) Ciclatore termico per PCR 15

16 Clonaggio con plasmidi Altro metodo per replicare tratti di DNA sfrutta i plasmidi (DNA extranucleare) di batteri (es. E. coli) come vettori per clonare sequenze di DNA Frammenti di DNA da clonare, esogeno al batterio usato come vettore, vengono inseriti nella sequenza del DNA del plasmide utilizzando degli enzimi di restrizione, per tagliare il DNA del plasmide, e l enzima DNA ligase per legare al DNA del plasmide il frammento di DNA da clonare, creando così un plasmide ricombinante (video:

17 DNA microarrays Microarrays: disposizioni ordinate e miniaturizzate di frammenti di DNA con sequenze note su supporto solido Ciascuna posizione contiene un frammento di DNA (singola elica) specifico, chiamato sonda (probe), e complementare alla sequenza di un trascritto Quando il frammento è messo in presenza del frammento complementare, test, (mrna marcato con fluorocromo), questi tenderanno ad appaiarsi per complementarietà con interazione forte In scansione, quantità di segnale di fluorescenza derivante da una specifica posizione dell array è direttamente proporzionale ad abbondanza del trascritto corrispondente nel campione biologico utilizzato ( tutorials/dna/6.html) A B C D E 17

18 DNA microarrays Applicazioni: non solo misurazione espressione genica: Misurazione abbondanza di un trascritto genico Caratterizzazione sequenza di un gene (es. esoni/introni) Caratterizzazione alterazioni del numero di copie di un dato gene o sequenza di DNA (es. dovute a mutazioni cromosomiche di duplicazione) Caratterizzazione interazioni DNA-proteine 18

19 DNA microarrays DNA microarrays: principio e passi principali: Costruzione del microarray (supporto solido sul quale sono immobilizzati, in posizioni ben definite, migliaia di sequenze di geni differenti (sonde, o probes)) Estrazione RNA totale di cellule da esaminare (test) - Retrotrascrizione a cdna (coding DNA), se necessaria - Amplificazione e marcatura Ibridazione (del test) al microarray Valutazione attività genica Poiché permettono di determinare il profilo di espressione della cellula in un dato stato, si dice anche che consentono expression profiling 19

20 DNA microarrays.. L intensità della fluorescenza è misurata con uno scanner (confocale) ad alta sensibilità 20

21 DNA microarrays Una tecnologia che sta cambiando il modo di affrontare la biologia molecolare I metodi tradizionali: un gene/alcuni geni osservati in un esperimento: manca una visione di insieme Ricerca guidata da ipotesi Tecnologia con microarrays: migliaia di geni su un array al fine di studiare la loro funzione simultaneamente Ricerca che genera ipotesi, guidata dai dati Due le tecnologie più utilizzate: cdna microarray e oligonucleotide chip Entrambe misurano il livello di espressione genica in termini di abbondanza di mrna 21

22 DNA microarrays Piattaforme tecnologiche High density filters (quasi obsoleti) cdna microarrays Oligonucleotide arrays (oligo chips) Dettaglio: Dettaglio: Dettaglio: ~2 400 cloni in 12 cm x 8 cm marcatura radioattiva 1 condizione sperimentale per filtro ~25'000 cloni in 5 cm x 2 cm marcatura fluorescente 2 condizioni sperimentali per array ~60'000 geni in 1.28 cm x 1.28 cm marcatura fluorescente 1 condizione sperimentale per array 22

23 DNA microarrays Filtri di nylon ad alta densità Ormai poco usati Devono essere comprati dal produttore Sulla membrana di nylon del filtro è spottato un set di cdna La rappresentatività del filtro è definita dal costruttore Filtro deve essere ibridizzato con cdna, un campione per filtro Campione è marcato con 33P-dCTP (marker radioattivo) Immagine del filtro ibridizzato è ottenuta con fosfoimager Intensità ibridizzazione valutata con software commerciali, ma ulteriori elaborazioni necessarie 23

24 DNA microarrays Filtri di nylon ad alta densità Vantaggi: Tecnicamente facili: non sono necessarie procedure di setup o di fabbricazione Di uso immediato: non richiedono strumentazione specifica Relativamente poco costosi Buona sensitività: sonde radioattive Svantaggi: Utente non ha il controllo di cosa c è effettivamente sul filtro Bassa qualità dei cloni spottati Qualità delle immagini bassa (alto background, macchie) Confronto tra due filtri è difficile (sono necessari vari esperimenti replicati ed efficiente sistema di analisi) Spesso sostituiti con cdna microarray miniaturizzati 24

25 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) 1. Preparazione del cdna microarray: si utilizzano intere porzioni di ESTs (Expressed Sequence Tags, brevi sottosequenze di una sequenza di cdna trascritto) Si fissano per ogni gene molte copie di EST ( bp) ottenute da librerie di cdna (amplificate tramite RT-PCR) su uno spot di un vetrino (10-50 spot per mm 2 ). Ciascuna EST dovrebbe essere specifica (set unigenico) 25

26 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) 2. Preparazione campioni : si preparano due campioni di mrna, retrotrascritti a cdna e resi fluorescenti con colori diversi (marcatori Cy3, verde, e Cy5, rosso). 3. Ibridizzazione: i campioni preparati sono messi a contatto con il cdna microarray preparato; i geni espressi nei campioni si ibridizzano con la loro sequenza complementare sul microarray 4. Misura espressione genica: la misura di fluorescenza in ogni spot del microarray determina quali geni sono espressi in ciascuno dei due campioni Esempio: misura di fluorescenza di Cy5 effettuata con laser elio-neon (HeNe) a 633 nm e l emissione avviene a 680 nm 26

27 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Preparazione del microarray: Collezione di cloni (plasmidi in E. Coli) Cloni di cdna sono selezionati e cresciuti Lisi dei batteri ed estrazione del DNA plasmidico Amplificazione del DNA in PCR Controllo su gel dei prodotti di PCR Preparazione in piastra da 384 (16x24) pozzetti Spotting su vetrino 27

28 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Dettagli tecnici : Possono esserci fino a elementi per vetrino (ma più spesso ce ne sono circa 5 000) I vetrini sono tipicamente grandi 2.5 x 2.5 cm Vetrini più lunghi possono essere usati ma richiedono campioni con una maggiore quantità di cdna marcato Gli spot distano tipicamente µm Vengono stampati da robot con testine contenenti da 4 a 32 puntine distanti tra di loro circa 1 cm Esistono puntine di varie forme Video: 28

29 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Vari tipi di puntine da stampa: A) I modelli a pinzetta, o a puntina divisa, trasferiscono piccolissime quantità (nanolitri) della soluzione di cdna all array tramite fenomeni di capillarità nel momento in cui la puntina tocca la superficie solida B) Le puntine e le estremità TeleChem TM applicano piccole goccioline tramite il contatto tra la puntina e il substrato 29

30 DNA microarrays cdna microarray (spotted) C) Il modello a puntina-e-ansa raccoglie il cdna in una piccola ansa e in seguito una puntina trasferisce la soluzione su un vetrino, mantenendo uniforme la densità D) I modelli a getto d inchiostro (es. di STMicroelectronics) spruzzano quantità ancora più piccole (picolitri) di goccioline di liquido sotto pressione 30

31 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Preparazione dei campioni, ibridizzazione e misura: 31

32 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Sono complessivamente piuttosto costosi a causa del setup della loro preparazione Si devono ottenere cloni di cdna attraverso amplificazione di EST tramite PCR (per ciascun spot occorrono 10 ng di materiale) Si usano cloni di lunghezza intorno alle 1-2 kb Le soluzioni contenenti i cloni amplificati possono essere utilizzate per produrre sino a vetrini Servono 2 giorni per produrre 100 microarray con geni Infine occorre produrre cdna marcati a partire dai campioni biologici, usando la trascrittasi inversa in presenza di nucleotidi resi fluorescenti o radioattivi 32

33 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Il principio dell analisi con microarray a cdna Dopo che frammenti di EST disposti in piastre da 96 o 384 pozzetti sono depositati ad alta densità su un vetrino da microscopio, si effettua una ibridizzazione sull array con due diversi tipi di cdna, contrassegnati con coloranti fluorescenti e derivati da campioni indipendenti di mrna. Dopo il lavaggio, un laser effettua una scansione del vetrino e si calcola il rapporto di fluorescenza indotta nei due campioni per ciascuna EST: questo valore indica la quantità relativa di trascritto per l EST presente nei campioni Video: 33

34 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Video: 34

35 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Immagini di cdna microarray Rosso: gene espresso, per es. nei trattati ma non nei controlli Verde: gene espresso, per es. nei controlli ma non nei trattati Giallo: gene espresso in entrambi i campioni Grigio: gene non espresso in nessuno dei campioni 35

36 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Dalle immagini ai dati: Tumor cell Healthy cell Allineamento della griglia: ogni sonda deve essere localizzata nell immagine dell array Segmentazione: identificazione dei pixels appartenenti a ogni spot Estrazione dell intensità: calcolo di un valore numerico che rappresenti il livello d espressione (media, mediana, ) Correzione del background: l intensità del background è calcolata e sottratta dal valore di intensità dello spot Qualità dello spot: sono calcolati parametri (es. circolarità, uniformità, diametro, ) per valutare la qualità di uno spot, di un vetrino e di un esperimento 36

37 DNA microarrays cdna microarrays (spotted) Pregi e difetti della tecnica spotted : Ibridazione competitiva: analisi su mrna da cellule in due condizioni diverse Vantaggio: misure relative (spesso espresse sotto forma di log 2 ) Svantaggio: definizione del riferimento, problemi colorimetrici, possibili differenze delle quantità dei due mrna Difficoltà di comparare risultati provenienti da differenti array: l intensità dipende dalle quantità di sonde depositate Si richiede molto mrna per preparare il target ( µg) 37

38 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Microarrays di oligonucleotidi: genechips di Affymetrix e altri Al posto delle EST ci sono oligonucleotidi lunghi basi progettati per rappresentare ORFs Composizione di ogni sequenza di oligonucleotidi: Perfect match (PM): una sequenza che può ibridizzarsi Mismatch (MM): una sequenza che non dovrebbe ibridizzarsi, dato che la base centrale e invertita PM ATGAGCTGATGCGATGCCATGAGAG MM ATGAGCTGATGCCATGCCATGAGAG Per ogni probe con sequenza di PM vi è sul chip un altro probe con sequenza di MM 38

39 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Ogni gene viene rappresentato da un insieme di oligonucleotidi (es. lunghi 25 bp nei chips Affymetrix), che corrispondono a varie posizioni sul gene che rappresentano 39

40 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Costruzione di arrays di oligonucleotidi (realizzata da aziende specializzate che vendono tali arrays) Gli oligonucleotidi sono sintetizzati in situ sul chip di silicio tramite litografia, usando un lampo di luce e una maschera per permettere alla luce di colpire solo i punti richiesti sulla superficie del chip (processo simile a quello per la produzione delle CPU dei calcolatori) 40

41 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi In ciascun passaggio, il lampo di luce deprotegge (cioè libera) gli oligonucleotidi nel punto desiderato del chip; si aggiungono quindi nucleotidi protetti di uno dei quattro tipi possibili (A, C, G, o T), in modo che un solo nucleotide si aggiunga alle catene desiderate 41

42 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Sintesi oligonucleotidi in sito Su substrato di silicio vengono sintetizzati oligonucleotidi tramite cicli di addizione di uno specifico nucleotide in specifiche posizioni; I nucleotidi bloccati vengono deprotetti tramite esposizione alla luce Sono accessibili all aggiunta del nucleotide successivo soltanto quelli localizzati in corrispondenza dei buchi della maschera fotolitografica Vantaggi: - sequenze oligo verificate - lunghezza oligo predeterminata Video: 42

43 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi La realizzazione di maschere fotolitografiche con risoluzione costantemente in aumento permette di sintetizzare sulla stessa superficie un numero di singole cellette sempre maggiore numero celle 25 µm 18 µm 11 µm 8 µm 5 µm Dimensioni cella (µm) Numero di celle sintetizzabili su standard array 12.8 mm

44 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Maskless Array Synthesis (MAS): invece di maschere fotolitografiche, viene utilizzato un DMD (Digital Micromirror Device) che utilizza migliaia di specchi che riflettono la luce in specifiche posizioni del supporto solido per effettuare la deprotezione del gruppo chimico 44

45 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Microarray scannerizzato (con laser confocale) Ciascuna cella misura il livello di espressione di una sequenza genica Livello di espressione genica quantificato dall intensità (I) della cella nell immagine scannerizzata Espressione = avg[i(pm)-i(mm)] 45

46 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Dalle immagini ai dati: stessi passi che per cdna microarrays 46

47 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Punteggio della detection Si calcola il seguente score: R i = [I(PM) i -I(MM) i ] / [I(PM) i + I(MM) i ] (range [1;-1]) Determina l abilità della sonda (probe) di identificare il target Detection p-value: si effettua il test di ipotesi che lo score differisca significativamente da una soglia vicina a zero (si valuta l evidenza di una ibridizzazione non casuale) Si usa il Wilcoxon signed ranked test 47

48 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Una detection call descrive se l ibridizzazione di un probe set è avvenuta (P, presente), non è avvenuta (A, assente) o è stata solo marginale (M) Viene assegnata sulla base del p-value Valori suggeriti: Presente: p-value < 0.04 Marginale: 0.04 p-value 0.06 Assente: altrimenti 0 1 p-value 48

49 DNA microarrays Microarrays di oligonucleotidi Commento Procedura molto rapida ed efficace, ma è molto costoso fare le maschere, per cui questa tecnica è realizzata da aziende specializzate e utilizzabile solo per organismi modello Richiede inoltre di progettare opportunamente la combinazione di sequenze di oligonucleotidi che discriminano tra le varie ORF N.B. Come campione (test) si usa mrna amplificato e marcato anziché cdna (come nei cdna microarray) 49

50 DNA microarrays Confronto cdna vs oligonucleotidi Microarrays a cdna: Possono essere applicati a qualunque organismo senza necessità di aver sequenziato il genoma completo Complessivamente più economici (ma setup costoso) Sono più flessibili e si affidano all ibridizzazione tra molte basi e non poche in tale modo superano anche alcuni problemi legati ai polimorfismi Attualmente esistono anche alcune altre soluzioni proposte da Agilent ( che usano oligonucleotidi più lunghi (con basi) e deposizione a getto d inchiostro 50

51 DNA microarrays Confronto cdna vs oligonucleotidi Chips di oligonucleotidi: Possono contenere una maggiore quantità di geni, anche geni previsti ma non ancora presenti in librerie di cdna Sono utilizzabili anche da chi non ha le possibilità di costruirsi un vetrino Hanno probabilmente minore variabilità tra un chip e l altro - E maggiormente possibile (anche se comunque difficoltosa) la comparazione dei dati prodotti da diversi gruppi di ricerca 51

52 DNA microarrays Confronto cdna vs oligonucleotidi Piattaforma a due colori: 2 campioni biologici su 1 unico array (cdna microarrays) Comparazione tra cellule normali tumorali Marcatura dei trascritti Microarray contenente una rappresentazione dell intero genoma Geni che si comportano in modo DIVERSO Pseudocolor image + = Pseudocolor image 52

53 DNA microarrays Confronto cdna vs oligonucleotidi Piattaforma a singolo colore: 1 campione biologico su 1 array (oligo chips) Comparazione tra cellule normali tumorali Marcatura dei trascritti Microarray contenente una rappresentazione dell intero genoma Geni che si comportano in modo DIVERSO VS = Immagine rappresenta variazione di espressione (asse y) di vari geni (linee) sovra- (arancione) e sotto- (azzurro) espressi in successivi istanti temporali (asse x) 53

54 Riassunto esperimento microarray Spotted microarray In-situ synthesized microarray 54

55 Riassunto esperimento microarray Risultati lettura array ID Trascritto Livello di espressione (rfu) [unità di fluorescenza relative] p-value I livelli di espressione di decine di migliaia di trascritti vengono quantificati in un unico esperimento Si parla quindi di analisi a livello genomico 55

56 Riassunto esperimento microarray Ricerca trascritti regolati (in comparazione trattato-controllo) L analisi comparativa permette di comparare, per ciascun trascritto rappresentato, il livello di espressione in una condizione rispetto ad un altra Comparando direttamente il livello di espressione del medesimo trascritto [probeset] E così possibile identificare e quantificare in modo accurato le alterazioni a livello trascrizionale tra due campioni Controllo p16 = rfu Trattato p16 = rfu rfu: relative fluorescent unit 56

57 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Analisi SAGE Metodo per determinare l abbondanza (o concentrazione) assoluta di ciascun trascritto espresso in una popolazione di cellule mediante sequenziamento automatico in serie di marcatori specifici per ciascun gene, prodotti tramite tecniche molecolari collegate tra loro Principi su cui si basa la SAGE: Una sequenza corta di bp contiene informazioni sufficienti per identificare in modo univoco un trascritto - Queste sequenze possono essere attaccate le una alle altre per formare una sequenza più lunga Il numero di volte in cui appare una sequenza corta esprime livello di espressione di trascritto corrispondente 57

58 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Vengono pertanto sequenziati in serie marcatori unici lunghi 15 bp In ciascuna reazione di sequenziamento vengono ottenuti fino a 50 marcatori Solitamente si usano due marcatori per gene, quindi occorrono circa marcatori per l intero genoma umano Procedura complessa e molto costosa (5 000 euro per campione) - Non adatta per ripetere gli esperimenti diverse volte Fornisce quella che si ritiene la misura esatta del numero di trascritti 58

59 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) Passi dell analisi SAGE: 1. Isolare l mrna del campione biologico da analizzare 2. Trascrivere mrna in cdna 3. Tagliare le opportune sequenze del cdna con enzimi di restrizione per ottenere brevi sequenze 4. Attaccare un adattatore creando un di-tag 5. Collegare i di-tag tra di loro 6. Amplificare in vettore batterico le catene lunghe di di-tag 7. Sequenziare le catene amplificate 8. Via software riconoscere le sequenze corte, contarle e associarle al relativo trascritto 59

60 Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) 60

61 Microarray and Gene Expression Data (MGED) Sforzo di standardizzazione dei dati di microarray e annotazioni Il gruppo MGED (Microarray and Gene Expression Data): Obbiettivo del gruppo è di facilitare: l adozione di standards per l annotazione di esperimenti con DNA microarrays e la rappresentazione dei loro dati l introduzione di controlli sperimentali e di metodi di normalizzazione dati/risultati Coinvolge molti centri a livello mondiale (TIGR, Affymetrix, Stanford, Sanger, Agilent, Rosetta, ecc.) Coordinato da European Bioinformatics Institute (EBI) 61

62 Microarray and Gene Expression Data (MGED) Glossario MGED ( MIAME (Minimum Information About a Microarray Experiment): standard per l annotazione degli esperimenti MAGE-OM (MicroArray Gene Expression - Object Model): modello dei dati generati con microarrays ArrayExpress ( database basato su MAGE-OM MAGE-ML (MicroArray Gene Expression Markup Language): linguaggio di markup per condividere, fra database, gli esperimenti e i loro dati Expression Profiler ( strumento di analisi dei dati da microarrays che utilizza direttamente ArrayExpress 62

63 Microarray and Gene Expression Data (MGED) Principi generali di MIAME [Brazma et al., Nature Genetics, 2001] Le informazioni raccolte devono essere sufficienti per interpretare i risultati e replicare gli esperimenti L informazione deve essere strutturata in modo che l interrogazione e l analisi automatica siano fattibili 63

64 Microarray and Gene Expression Data (MGED) Contenuto del database dal punto di vista dell analisi dei dati Campioni Geni Annotazioni Annotazioni Espressioni geniche Livelli di espressione 64

65 Microarray and Gene Expression Data (MGED) ArrayExpress ( Database di dati di esperimenti con microarrays, in cui le informazioni sono riportate in modo standard Conforme con MIAME Interfaccia Web: Queries: esperimenti, arrays, campioni Browsing: viste su esperimenti 65

66 Microarray and Gene Expression Data (MGED) ArrayExpress - queries 66

67 Microarray and Gene Expression Data (MGED) ArrayExpress - browsing: geni up o down regolati in esperimenti con Saccharomyces cerevisiae (lievito) in condizione di crescita rehydration 67

68 Disegno sperimentale di studi del trascrittoma Disegni sperimentali di studi di espressione genica: Esperimenti statici Due o più classi di soggetti (fenotipi/trattamenti diversi) - Esempio 1: Selezione di geni differenzialmente espressi (in diverse classi di soggetti) - Esempio 2: Classificazione (supervisionata) Esperimenti dinamici Un soggetto a tempi diversi - Serie temporali di espressione genica durante una perturbazione - Esempio 3: Selezione di geni differenzialmente espressi nel tempo Clustering 68

69 Esperimenti statici con microarray Due o più classi di soggetti (fenotipi/trattamenti diversi) 69

70 Esperimenti statici con microarray Esempio 1: Selezione di geni differenzialmente espressi (d.e.) 70

71 Esperimenti statici con microarray Esempio 2: Classificazione (supervisionata) 6 gruppi (tipologie) di Leucemia linfoblastica acuta (ALL) infantile M=m 1 +m 2 =132; N=

72 Esperimenti dinamici con microarray Un soggetto a tempi diversi 72

73 Esperimenti dinamici con microarray Esempio 3: Selezione di geni differenzialmente espressi nel tempo Clustering 379 geni insulina-regolati Principalmente geni del metabolismo dei lipidi e del trasporto di elettroni Principalmente geni della glicolisi 73

74 Esperimenti dinamici con microarray Esempio 3: Selezione di geni differenzialmente espressi nel tempo Reverse engineering Gene networks Synthetic biology 74

75 Analisi dati di espressione Dati di espressione Immagini scannerizzate da microarrays 75

76 Acquisizione e pre-elaborazione segnale Acquisizione e pre-elaborazione del segnale (intensità della fluorescenza) includono: Analisi dell immagine Normalizzazione di immagini/dati Trasformazioni dati Software: GenePix, MAS5, Immagini Dati 76

77 Acquisizione e pre-elaborazione segnale Analisi dell immagine Identificare la posizione delle sonde (probes) relative ad ogni gene (Gridding) Differenziare i pixel relativi a foreground e background (Segmentation) Estrazione delle intensità delle varie aree dell immagine 77