Sequenziamento ed analisi dell esoma intero (All Exon)

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1 Sequenziamento ed analisi dell esoma intero (All Exon) Obiettivi La procedura ha l obiettivo di sequenziare solo le regioni trascritte e codificanti del genoma che rappresentano, almeno nell uomo, circa 1/60 del totale. Queste regioni sono molto più annotate delle altre ed inoltre questi studi, focalizzandosi su aree specifiche e non sull intero genoma, permettono una semplificazione dell analisi genetica e dell interpretazione dei dati di sequenza rendendo fattibili studi genetici con un numero di campioni più alto e statisticamente più rilevante. Il sequenziamento mirato delle regioni esoniche in generale comprende la preparazione di una libreria di frammenti dal DNA genomico accoppiata all arricchimento selettivo delle regioni stesse. Il sistema di arricchimento di genomi adottati in Genomnia utilizza la piattaforma SureSelect sviluppata da Agilent. La piattaforma SureSelect Ad oggi sono stati sviluppati da Agilent diversi kit, principalmente per uomo e topo. Il kit umano è in continua evoluzione, sia in termini di copertura dell esoma, dalle 38 Mb iniziali alle 50 Mb che vengono coperte ad oggi dall ultima versione del kit in uso in Genomnia (V5), che in termini di banche dati utilizzate per l annotazione, coprendo ad oggi esoni in geni. La versione umana All Exon + UTRs, invece, permette di raggiungere le 71 Mb grazie all aggiunta delle regioni non codificanti UTR. Il kit Mouse All Exon, copre esoni distribuiti all interno di geni, per un totale di 50Mb. Esiste inoltre un kit All Exon umano Plus che offre la possibilità di aggiungere fino a 6.8 Mb di sequenze trascritte addizionali mediante lo strumento web di Agilent earray. Per maggiori dettagli, è consigliabile consultare il sito https://www.genomics.agilent.com. Procedura Il sistema di arricchimento SureSelect utilizza dei crna biotinilati di 120 bp come sonde di cattura a cui si legano, per ibridazione in soluzione, i frammenti di DNA genomici complementari. L ibrido RNA-DNA viene quindi catturato da biglie magnetiche coperte di streptavidina. In maggior dettaglio, il DNA genomico di partenza viene frammentato, usando la tecnologia di sonicazione Covaris Adaptive Focused Acoustics (AFA), fino a bp, dimensione media del picco di DNA. Si prepara una libreria di frammenti SOLiD, in modo tale che il frammento di DNA derivato dagli originali campioni di DNA genomico intero, sia affiancato dai due adattatori SOLiD P1 e P2-IA. Una volta preparata la libreria, avviene l arricchimento mirato delle regioni esoniche. Le molecole sono denaturate col calore, le sequenze degli adattatori sono bloccate tramite ibridazione con oligoribonucleotidi complementari, quindi sono aggiunti gli oligoribonucleotidi biotinilati trappola della libreria Agilent SureSelect, e l intera miscela è lasciata ad ibridare per 24 ore. Dopo l ibridazione, gli oligoribonucleotidi trappola biotinilati, che portano le molecole ibridate, sono legati a biglie magnetiche ricoperte di streptavidina, lavati per rimuovere i contaminanti non ibridati, e quindi distrutti per permettere il recupero delle molecole della libreria catturate. Infine, l amplificazione tramite PCR delle molecole della libreria catturate permette di introdurre codici a barre di identificazione. La libreria è quindi purificata, la sua qualità e quantità misurata e i campioni con codice a barre sono uniti per essere sequenziati in multiplex.

2 Quantità di campione necessaria La quantità di DNA genomico di alta qualità (A260/A280 da 1.8 a 2.0) necessaria per la procedura è 3 microgrammi, con l aggiunta di almeno 200 ng per i controlli di qualita. Materiale di partenza Quantità Standard (µg) Quantità Minima (µg) DNA > 3 > 3 Analisi Bioinformatica L analisi bioinformatica dei risultati degli esperimenti di Esoma Intero (All Exon) si compone di tre fasi consequenziali: mappaggio sul genoma di riferimento; analisi delle variazioni e relative statistiche; annotazione. (1) Mappaggio sul genoma di riferimento Questa attività parte dalla correzione ab initio degli errori di sequenza (ove il sequenziamento non sia stato svolto con la chimica ECC che implica una maggiore accuratezza di sequenziamento, prevedendo una lettura di 3 volte della stessa base (ACCUSEQ), che rende superflua questa procedura), che é possibile solo nel formato nativo (c.d. Color Space ) dei dati di sequenza SOLiD. L analisi prosegue con il mappaggio delle read di sequenza corrette sul genoma di riferimento (Homo sapiens hg19). Il parametro per la selezione dei risultati accettati in questa procedura é il valore di qualità dell allineamento (QV). Un valore QV di 20 ( la soglia adottata in questa parte della procedura Genomnia) corrisponde alla probabilità del 99% che l allineamento sia corretto. Le statistiche riassuntive sui risultati globali del mappaggio sono messe a disposizione del cliente, assieme agli allineamenti nei formati standard binario.bam (con i relativi indici.bai) e testuale.bed, al fine di consentire la visualizzazione diretta degli allineamenti delle read sul genoma di riferimento con il programma Integrated Genome Viewer (files.bam ed indici.bai: o come custom track da visualizzare sul genome browser UCSC Genome Viewer (files.bed: Vengono infine generate in questa fase dell analisi e fornite tabelle in formato Excel con metriche in formato testuale e grafico relative alla qualita del sequenziamento, con informazioni come le megabasi coperte da sequenza, il numero di sequenze effettivamente utilizzate per il mappaggio, la percentuale totale di sequenze mappate su quelle orriginate, la distribuzione dei valori di qualita degli allineamenti, la distribuzione delle lunghezze degli allineamenti e cosi via. (2) Analisi delle variazioni e statistiche relative La seconda parte dell analisi parte dalla identificazione analitica ( call ) dei polimorfismi di sequenza e delle piccole inserzioni e delezioni ( minori o uguali di 20 nt), sempre rispetto al genoma di riferimento e con riferimento alle zone effettivamente incluse negli esoni codificanti del progetto CCDS (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ccds/ccdsbrowse.cgi). Questa selezione garantisce l identificazione di mutazioni in zone del genoma trascritte e tradotte. Ambedue questi risultati vengono successivamente confrontati con il contenuto di dbsnp nella sua ultima versione disponibile, per assicurare la coordinazione con le annotazioni genomiche di UCSC ed ENSeMBL. Un esempio di statistica dei risultati finali dell identificazione di SNP da tipici esperimenti di sequenziamento ed analisi di esoma intero condotti in Genomnia è riportata in Figura 1. E possibile variare la stringenza di questo tipo di analisi da una situazione in cui si impone un tasso di falsi positivi molto basso, ad una in cui si richiede che l allele di interesse (nel caso di ricerca di varianti rare) sia confermato su tutti e due gli strand, ad una in cui i filtri sono ridotti al minimo. Questo tipo di scelta dei parametri analitici dipende principalmente dal tipo di ipotesi genetica alla base dell esperimento, e viene quindi stabilita in collaborazione diretta con il ricercatore interessato.

3 Figura 1- Statistiche riassuntive del risultato finale della procedura di analisi di varianti su quattro esperimenti di sequenziamento ed analisi di esoma intero su malattie rare condotti in Genomnia. Il numero di varianti identificate è tipico di un esoma intero con il kit di cattura utilizzato in questo caso, comprende sia le SNP presenti in banche dati pubbliche che quelle nuove (solitamente qualche centinaio per campione) e può variare sensibilmente a seconda dei diversi parametri analitici. Il dataabse di riferimento al momento della generazione di questa statistica era dbsnp135. Le variazioni identificate in questo passaggio, sia SNP che indel, vengono riportate in un file di risultati non annotati nel formato standard.vcf. Questo può essere utlizzato con diversi strumenti analitici, anche basati su web. Le stesse varianti, vengono annotate estensivamente nella seconda fase della procedura analitica per permettere allo sperimentatore l esplorazione e la riduzione del dataset di risultati con parametri come la profondità del sequenziamento, l omo/eterozigosità, il tipo di gene coinvolto, la localizzazione della variante di interesse nel gene, la percentuale di variazione effettivamente riscontrata e cosi via. Un esempio di tabella di annotazione dei risultati di variazione è riportata in Figura 2. Le varianti vengono classificate come NEW per confronto con una banca dati come dbsnp. L analisi di inserzioni e delezioni entro i 20 nucleotidi (Figura 3) rappresenta una risorsa addizionale molto interessante e poco esplorata di identificazione di variazioni potenzialmente patogeniche. Il sistema analitico associato ai dati in Color Space SOLiD genera con alta confidenza questo tipo di informazioni. Le tabelle dei risultati di indel riportano anche le call degli alleli, la sequenza nel contesto della indel ed il calcolo di omozogosita /eterozigosita /emizigosita delle varianti identificate. Un altro risultato elaborato in questa fase dell analisi bioinformatica comprende l analisi di arricchimento per target annotato, cioé una statistica dei risultati fisici legati direttamente all efficienza della cattura e del sequenziamento, e dei files di statistica del coverage, in modo da poter identificare con certezza gli esoni eventualmente non catturati dalla procedura di arricchimento.

4 Figura 2 Tabella riassuntiva dei risultati di analisi di variazione (SNP) di un singolo esperimento di analisi di esoma intero. Sono cerchiati in rosso i valori di coverage di sequenza e percentuale di variazione relativi a due varianti classificate come nuove. Figura 3 Tabella riassuntiva dei risultati di analisi di variazione (inserzioni e delezioni) di un singolo esperimento di analisi di esoma intero. La classificazione in noti (KNOWN) e nuovi (NEW) è eseguita in base alla comparazione con l ultima versione del database dbsnp disponibile al momento dell analisi (3) Annotazione delle varianti di sequenza e delle inserzioni/delezioni Viene generata in questa ultima fase analitica una serie di tabelle in formato Excel con i risultati di annotazione funzionale delle varianti elaborati in maniera integrata ed automatica dal software Variant Effect Predictor (http://www.ensembl.org/info/vep.html), che utilizza sistemi come SIFT e Polyphen e la classificazione della localizzazione della variante rispetto alla struttura del gene target (in esone; in UTR; etc). Vengono riportate in questa tabella di annotazione sia informazioni fisiche (localizzazione della variante, allele associato alle referenza, identificativo EnsEMBL del gene che contiene la variante identificata) che classificazioni dell eventuale conseguenza funzionale associata alla variante intronica; downstream o upstream al gene; associata ad un trascritto coding/non coding e cosi via, derivata dall utilizzo di software predittori come SIFT e PolyPhen. Ogni analisi é accompagnata da documentazione che illustra il significato delle colonne delle tabelle dei risultati e la relativa intepretazione.

5 Informazioni per gli ordini Controllo di qualità di DNA Prodotto codice a barre, Human All Exon V5 codice a barre, Human All Exon V5 + UTR codice a barre, Mouse All Exon Sequenziamento forward con codice a barre 50 bp tags Sequenziamento forward con codice a barre 75 bp tags Sequenziamento Paired-end con codice a barre 50 bp + 25 bp tags Sequenziamento Paired-end con codice a barre 75 bp + 35 bp tags Exact Call Chemistry Module Analisi Bioinformatica (identificazione, classificazione ed annotazione delle varianti) Numero di catalogo DNA06 SSV5 SSUTR SSM SEQ50B SEQ75B SEQ50.25B SEQ110B ACCUSEQ FEX-BF01 All Exon Rev. 2 02/2014

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