Sistemi STR per applicazioni NON-Forensi Alessandro Bosetti Techincal Services Manager Promega Italia

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1 Sistemi STR per applicazioni NON-Forensi Alessandro Bosetti Techincal Services Manager Promega Italia

2 Introduzione A Powerful Genotyping Tool I kit Promega PowerPlex STR sono stati sviluppati per l utilizzo in genetica forense e test di paternità utilizzando specifiche e validate condizioni (es. Array 36cm; POP-4 polymer) La tecnologia STR produce genotipi multi-locus altamente discriminanti L analisi STR è una valida tecnologia utile anche in applicazioni NON Forensi/Paternità che richiedono analisi di campioni puri o misture Molti laboratori che utilizzano gli STR per applicazioni non forensi utilizzano fanno anche sequenze di DNA, tipizzazioni HLA ecc. In condizioni diverse da quelle specifiche per I nostri kit (POP7; POP6; 50cm) Più in generale, i kit STR di Promega sono specifici per la tipizzazione umana, tra cui analisi forensi, test di parentela e molto altro

3 STR Overview Short Tandem Repeats Short Tandem Repeats (STR) sono unita ripetute: Pentanucleotide: Tetranucleotide: Trinucleotide: Dinucleotide: AAAGA AAAGA AAAGA AAAGA AAAG AAAG AAAG AAAG CTT CTT CTT CTT CTT AG AG AG AG AG AG Tetranucleotidi tipizzazione umana Buon compromesso tra facilità di interpretazione e variabilità Pentanucleotides Altamente discriminanti, bassa percentuale di Statter Inclusi nei kit promega (!)

4 STR Overview Multiplexing: separazione per colore e dimensione La dimensione dell amplimero può essere variata in base al posizionamento dei primer nella regione costante Dimensione COLORE I primer sono marcati con diversi fluorofori

5 STR Overview esempio di elettroferogramma di un locus Penta E locus (dimensioni degli alleli STR attesi) Eterozigote genotipo 12/13 (SoftGenetics GeneMarkerHID v )

6 STR Overview PowerPlex 16 HS: profilo completo; singolo contribuente potere di discriminazione del PowerPlex 16 HS: 3 x 10-19

7 Analysis STR: Protocollo Amplificazione e marcatura dei loci STR; separazione elettroforetica; analisi dei frammenti Multiplex PCR/Marcatura dei loci STR selezionati Analisi dei dati> Comparazione del profilo del campione con l allelic ladderm per identificare l allele Campione di DNA Separazione per dimensione e rilevamento della fluorescenza mediante elettroforesi capillare (CE) Sample Profile Allelic Ladder Color 1 Color 2 Compare Color 3 STR amplicon size

8 Applicazioni: Overview Due gruppi principali Sample ID/Caratterizzazione Comparare campioni ad un campione di riferimento Sono la stessa cosa? Cos è? TEST Sample REFERENCE Sample Profiles Match (TEST=REFERENCE) Analisi di misture Mixed Sample Analysis (MSA) Il campione è puro o è contaminato da altri tipi di cellule? = piccihi del Contribuente B indicano contaminazionel Contribuente A Contribuente A puro Contribuente A + Contribuente B Contribuente B puro

9 Applicazioni A Wide-array of Powerful Applications STR Profiling Across Many Types of Life Science Research Sample Identification and Characterization Forensic cases Ancestry studies Cancer research Genetic disease research Twin zygosity testing Mixed Sample Analysis (MSA) Tissue provenance testing Slide Floater analysis Mosaicism analysis Maternal cell contamination SQ-MSA Characterization Biobanking Cell authentication Contamination

10 Obiettivi dell analisi STR Generare profili completi e ben bilanciati Analisi semi quantitativa di misture (SQ-MSA) Workflow con molti step TUTTI cruciali!

11 Complete STR Analysis Workflow Sample Tissue Cells Blood FFPE Direct to PCR Kits Available DNA Isolation Quantitation Choose STR Kit Multiplex PCR CE Data Analysis

12 Purificazione del DNA DNA Isolation Purificazione automatica e manuale del DNA a seconda delle specifiche esigenze Automated Purification of 1 to 16 Samples Cost-effective Manual Purification Maxwell 16 Instruments and Kits ReliaPrep Kits

13 Quantificazione del DNA Quantitation Semplice, Sensibile, SPECIFICA, Riproducibile Easy-to-Use Fluorometers Sensitive, Reproducible DNA Quantitation Quantus Fluorometer QuantiFluor -ST and QuantiFluor -P Instruments QuantiFluor dsdna Kit

14 Kit STR Choose STR Kit Kit STR Potere di Discriminazione Vantaggi PowerPlex 16 HS 3 x Tipizzazione di 16 loci con la massima sensibilità PowerPlex 18D 4 x Versatile nel quantitativo di DNA templato, compatibile con FTA card, amplificazione DIRETTA e veloce PowerPlex FUSION 1.4 x Il più grande potere di discriminazione, miglior resistenza agli inibitori, compatibile con FTA card PowerPlex ESI & ESX 17 2 x Nuovi loci ESS, maggior numero di mini-str per campioni degradati GenePrint 21 7 x Il più grande potere di discriminazione, miglior resistenza agli inibitori, ottimizzato per biobanking GenePrint 10 1 x Tipizzazione dei 10 loci CLA, possibilità di multiplexing con lucus murino (staminali)

15 Obiettivi dell analisi STR Multiplex PCR PowerPlex 16 HS Quantitativo di DNA di partenza (500pg) Volume di reazione (25uL) Profilo di amplificazione (32cicli, rampe) Tutti questi fattori, ASSIEME,influenzano l altezza ed il bilanciamen dei picchi Voltaggio e Tempo di iniezione (3 kv, 5 ses) Ottimizzare tutti gli step per ottenere dati di qualità

16 Configurazione dei sequenziatori CE 1. Lunghezza degli Array (36cm o 50cm) 2. Tipo di polimero(pop-4, POP-6 TM e POP-7 TM ) 3. Calibrazione spettrale/filtri a) Promega Utilizza 2 filtri: F per 4-dye set and G5 per 5-dye set b) I fluorofori (colori, dye set) sono diversi da quelli di ABI 4. Parametri dello Spectral and Run module - Run temp, run voltage, run time, polymer fill volume - injection voltage, injection time

17 Configurazione dei sequenziatori CE Instrument POP-4 POP-6 TM POP-7 TM 36cm 50cm 36cm 50cm 36cm 50cm Avant xL xL = Configurazioni validate da Promega = run module esistente

18 ESEMPIO: 3130xL/ PowerPlex 16 HS Comparazione dell Allelic Ladder con 3 diversi polimeri POP-4 POP-6 TM POP-7 TM

19 Considerazioni importanti CE 1. Con i polimeri POP-7 TM e POP-6 TM alcuni kit possono evidenziare artefatti (es. nel PowerPlex 16HS c è un artefatto che corre prima dei bins nel locus D3) 2. Sono necessari bin set modificati quando si usa il PowerPlex 18D ed il PowerPlex 21 con il POP-7 3. Promega ha a disposizione Panel e Bin set specifici Per maggiori info contattare: it_techserv@it.promega.com

20 Analisi dei dati Data Analysis GeneMapper ID e GeneMapper ID-X sono specificamente sviluppati per l analisi dei dati di tipizzazione STR GeneMapper 4.x è utilizzato per analisi di frammenti di altro tipo è possibile utilizzare il bin offsetting per la tipizzazione E necessario installare specifici file panel, bin, analysis method (HID), table setting e plot setting Per avere i file più aggiornati : it_techserv@it.promega.com

21 Data Analysis Software Data Analysis Data Processing Software GeneMapper 4.0 / 4.1 by Life Technologies GeneMapper ID /IDx by Life Technologies Features and Applications Perform sizing and allele calling for Applied Biosystems electrophoresis-based genotyping systems. Require window XP Require downloading extra data analysis files. Perform sizing and allele calling for forensic samples with Applied Biosystems electrophoresis-based genotyping systems. Require window XP Require downloading extra data analysis files. GeneMarker by SoftGenetics GeneMarker HID by SoftGenetics ChimerMarker by SoftGenetics Complete genotype software with many linked applications such as: STR, MSI, LOH, SNP, AFLP, MLPA, Trisomy, and FragileX gene analysis. Unique data processing tools to reduce genotyping time and improve accuracy. Integrated data transfer and analysis functions for many commercial assay systems. Compatible with all major sequencing instrument systems Window XP, Vista, 7, 8. Expert System for human identity and all forensic STR profiling, sample identification and characterization applications such as: mixture analysis, missing person/family search, relationship testing, reference profiling, and paternity testing. Highly accurate and concordant with other expert systems Reliable records with audit trail and password control User-friendly interface reduces analysis time up to 25% Compatible with all major sequencing instrument systems and chemistries, Compatible with Window XP, Vista, 7, 8. Automated STR software for maternal cell contamination and mixture analysis. Streamlined data analysis workflow reducing analysis time as 85%. Unique data processing tools for Increased the accuracy Compatible with all major capillary electrophoresis systems and chemistries, Compatible with Window XP, Vista, 7, 8.

22 SoftGenetics Software Data Analysis SoftGenetics can provide help with software choices based on desired application (

23 Conclusione I kit STR di Promega, PowerPlex e GenePrint, possono essere usati in applicazioni NON forensi con configurazioni e condizioni diverse rispetto a quelle usate per indagini forensi ed analisi di paternità Sono disponibili protocolli e metodi per utilizzare I kit STR cone sostanzialmente tutte le configurazioni possibili. Contattare il servizio Tecnico di Promega per qualsiasi domanda/dubbio/richiesta/chiarimento/informazioni/esigenze/spegazione/indic azione/delucidazione/quesito it_techserv@it.promega.com

24 GRAZIE!

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