DUPLICα RealTime AEAC Chlamydia trachomatis kit

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1 DUPLICα RealTime AEAC Chlamydia trachomatis kit Ref. EBR tests 0459 INTENDED USE DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit is a qualitative assay for the detection of Chlamydia trachomatis 16s gene and the cryptic plasmid DNA. PRINCIPLE OF THE TEST DUPLICα RealTime AEAC (Advanced Extraction/Amplification Control) Dual Easy Chlamydia trachomatis kit is an assay for the DNA-based detection of Chlamydia trachomatis. The reagents for the amplification are ready to use and provided in four separate tubes: AMPLIFICATION MIX with Hot Start Taq DNA polymerase (modified Antibody technology), nucleotides, MgCl 2 and buffer. OLIGO MIX with different sets of with primers and fluorogenic probes for the amplification of target DNA and extraction-amplification control (human β-globin gene). CONTROL to validate amplification reaction. Reaction Blank to verify the absence of contaminations. The Advanced Real Time PCR, patented by EuroClone, exploits the features of a classic PCR reaction as well as the features of a standard Real Time PCR. Briefly, nucleic acid amplification occurs through two phases: in the first phase target nucleic acids are pre-amplified by PCR reaction, whereas in the second phase are further amplified and detected by a Real Time PCR reaction. From the analytical point of view the use of this technology allows a sharp decrease of the threshold cycle (C t ) leading to an increase of the system sensitivity as well as the data reproducibility. This features is extremely useful in case of clinical samples that for several reasons (e.g. the nature of the specimens or of the target or the efficiency of the purification system) have a low amount of target DNA and/or an high amount of interfering substances. Most commonly, PCR is carried out in three steps: denaturation, annealing (primers binding) and extension. These steps, which are carried out in a thermal cycler that allows heating and cooling, represent the basic cycle of amplification; the continuous repetition of a basic cycle produces billions of fragments of the examined DNA. The denaturation of DNA which is carried out at high temperatures is followed by the annealing of specific primers to the target DNA: the enzyme Taq polymerase recognizes the 3 -ends of these primers and polymerizes the DNA using the dntps, thus creating several copies of the template. In all real-time PCR systems the amplified products are detected by using a fluorescent dye that in fluorogenic probes is called reporter. PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 1 / 8

2 The DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit allows the detection of bacterial DNA by using specific fluorogenic sequence probes. The kit uses probes labelled with different dyes for the target microorganism and for the extraction-amplification control; in particular the probes detecting the bacterial sequences have a FAM molecule (6-carboxyfluorescein) covalently bound at the 5 -end whereas the other probe detecting the control gene (β-globin) has a HEX molecule (hexa-chlorofluoresceine) at 5 -end. All probes have at their 3 -ends a dark quencher. REAGENTS PROVIDED Each kit contains sufficient reagents to perform 32 tests. The kit allows to detect a human endogenous gene (β-globin), therefore validating the extraction-amplification process. The kit allows to set up 4 analytical runs, each of them including 6 samples, 1 control and 1 reaction blank. For Real Time PCR Amplification mix (400 ul) Reagents Oligo Mix* (with primes and probes for target DNA along with endogenous human β-globin gene) (400 ul) Control (>50 ul) Reaction blank (B) (50 ul) *store the tube away from light Colour Code Blue Cap Green Cap Red Cap White Cap STORAGE AND HANDLING All reagents have to be stored at -22 C/-18 C. All reagents can be used until the expiration date printed on the labels. EuroClone Diagnostica recommends freezing and thawing the products at most six times. Warning: after complete thawing and before using the kit is recommended to spin all reagents and to resuspend them by pipetting 3 times. REAGENTS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Micropipette 1-10 µl with filter tips Micropipette µl with filter tips Kit for DNA extraction Bio-hazard hood (bio-safety level 2) Micro-centrifuge Rack for 0.2 ml tubes Optical tubes or microplate for Real-Time PCR Thermal cycler for Real Time PCR PRECAUTIONS AND WARNINGS Do not use the reagents after the date of expiration. Mix the reagents of the kit before use. Periodically verify the calibration of micropipette and instrumentation. Change gloves frequently. Laboratory equipments (pipettes, tips etc.) should not be moved from one working area to another. Periodically clean the working area with hypochlorite 0,5%. Use powder-free gloves. Do not leave fingerprints on optical caps. Do not write on caps as this may cause an interference with fluorescence detection. OPERATING PROCEDURE a) DNA extraction for clinical specimens The kit has been validated using the following biological specimens: swabs, urine and seminal fluid. For extraction from urine is recommended to: collect ml of first morning clean-catch, midstream urine into a clean, sealed container with no preservative; centrifuge at 800g between +2 C and +8 C for 5 minutes; verify the presence of pellet; re-suspend the pellet in 500 ul of PBS or physiological solution. The specimens should be stored between +2 C and +8 C and ideally tested immediately or within 24 hours. For the extraction EuroClone Diagnostica recommends the automated systems: (1) Duplicα Prep Body Fluid kit (ref. EDI004200); (2) Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref ). b) Thermal Cycler set up EuroClone Diagnostica validated the kit using the flowing Real-Time PCR thermal-cycler: PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 2 / 8

3 (1) SmartCycler (Cepheid) using FCTC25 dye-set, (2) CFX96 and DX Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Thermal Profile: Time Temperature N of Cycles 5 min 95 C 1 15 sec 95 C 60 sec 68 C 15 sec 95 C 60 sec 54 C X 10 Fluorescence Acquisition off X 50 Fluorescence Acquisition on c) Preparation of PCR mix For each run prepare a PCR mix for 1 control (Control), 1 reaction blank, n+1 samples, using the following volume of PCR reagents for each test: REAGENT VOLUME (ul) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Mix well and aliquot 20 µl of Master Mix into the tubes or microplate for PCR and then add to each tube/well 5 µl of extracted DNA or control (Control); place the tubes/plates inside the instrument and start the program of amplification you had set before. Remember at the end of the program to remove the tubes from the thermal cycler. d) ANALYSIS and INTERPRETATION of the RESULTS The fluorescence signal registered by the instrument detects the presence of the DNA; in particular the fluorescence detected in the FAM channel reveals the target DNA, whereas the fluorescence detected in the HEX channel reveals the extraction-amplification control (β-globin endogenous gene). Results are interpreted by analyzing the threshold Cycle (Ct) value for each sample. The Ct is defined as the cycle at which the amplification curve crosses the threshold line. When a signal at fluorophore FAM (Ct > 0) is detected, the sample is surely positive and the signal detected by fluorophore HEX (Ct 0) is not relevant. When no signal at fluorophore FAM (Ct = 0) is detected, to confirm a negative result, the amplification of extraction-amplification control, and therefore the appearance of a HEX fluorescent signal (Ct > 0), must occur. Only in this case it can be stated that the analyzed sample: contains human cells; has been correctly extracted; is definitely negative. The absence of amplification signal for both fluorophores FAM-HEX (Ct=0) indicates: the presence of PCR inhibitors or that the analyzed sample does not contain human cells or the extraction failed. In this case it is suggested to: (1) dilute 1:10 the target DNA (to try to overcome inhibitors presence); (2) repeat the complete analytical procedure, including the extraction. FAM HEX RESULT Ct > 0 Not relevant (Ct 0) POSITIVE Ct = 0 Ct > 0 NEGATIVE Ct = 0 Ct = 0 INHIBITED/ACELLULATED SAMPLE/EXTRACTION FAILED EuroClone Diagnostica recommends: for SmartCycler (Cepheid) to set the threshold line at 10 RFU in both channels; for Bio-Rad DX Real-Time PCR Detection System (software version 1.7) to automatically set the threshold line using the Regression option. Warning: The run is valid only if: The Blank is negative in both FAM-HEX channels. The Control is positive in both FAM-HEX channels. PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 3 / 8

4 If these two conditions have been met, the run is valid and it is possible to analyse the data. Otherwise the run is not valid. It is responsibility of the user to validate the run by checking that these conditions have been met. TROUBLESHOOTING Problem 1: No signal 1. Wrong channel/filter was chosen. 2. Pipetting error due to omitted reagents or samples. 3. Inhibitory effect of the sample: insufficient DNA purification 4. Insufficient DNA extraction or acellulated sample 5. Check if the kit was stored correctly. 6. Assess the performance of the thermal cycler Problem 2: Fluorescence intensity too low 1. Deterioration of dyes and/or primers in the reagents due to incorrect storage conditions. 2. Very low starting amount and/or purity of genomic DNA. Problem 3: Fluorescence intensity varies 1. The prepared PCR master mix is not well mixed 2. Air bubbles trapped in the PCR tubes THE PURCHASE OF THIS PRODUCT GRANTS THE PURCHASER RIGHTS UNDER CERTAIN ROCHE PATENTS TO USE IT SOLELY FOR PROVIDING HUMAN IN VITRO DIAGNOSTIC SERVICES. NO GENERAL PATENT OR OTHER LICENSE OF ANY KIND OTHER THAN THIS SPECIFIC RIGHT OF USE FROM PURCHASE IS GRANTED HEREBY PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 4 / 8

5 DUPLICα RealTime AEAC Chlamydia trachomatis kit Ref. EBR tests 0459 FINALITA D USO DUPLICα RealTime AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit è un test qualitativo, impiegato per la ricerca del gene 16s e del plasmide criptico di Chlamydia trachomatis. PRINCIPIO DEL TEST DUPLICα RealTime AEAC (Advanced Extraction/Amplification Control) Dual Easy Chlamydia trachomatis kit é un test molecolare basato sul riconoscimento del DNA di Chlamydia trachomatis. I reagenti per la reazione di amplificazione sono pronti all uso e suddivisi in quattro mix di reazione: AMPLIFICATION MIX: contenente Taq DNA polymerase, nucleotidi, MgCl 2 e buffer. OLIGO MIX contenente distinti set di primers e le sonde fluorogeniche per l amplificazione del DNA target del controllo di estrazione-amplificazione (gene umano β-globina) CONTROLLO per validare la reazione di amplificazione. BIANCO DI REAZIONE per verificare l assenza di contaminazioni La nuova tecnologia Advanced Real Time PCR brevettata da EuroClone Diagnostica sfrutta le caratteristiche di una classica reazione di PCR e quelle della standard Real Time PCR. Brevemente l amplificazione degli acidi nucleici avviene attraverso due fasi: nella prima fase vengono pre-arricchiti gli acidi nucleici bersaglio attraverso una PCR, mentre nella seconda i target vengono amplificati ulteriormente e poi rilevati grazie ad una Real Time PCR. Da un punto di vista analitico, l applicazione di questa tecnologia si traduce in una netta diminuzione del ciclo soglia (C t ) e quindi accresce la sensibilità del sistema così come la riproducibilità dei dati. Questa caratteristica risulta estremamente vantaggiosa per quei campioni clinici che per vari motivi (quali ad esempio la natura stessa del campione o del target o l efficienza del sistema estrattivo) sono caratterizzati da una scarsa quantità di DNA target nel campione di partenza e/o da elevata quantità di sostanze interferenti. La polymerase chain reaction (PCR) è una reazione che permette di amplificare una sequenza target di DNA generando numerose copie di un templato. La reazione si compone generalmente di tre fasi: denaturazione del DNA, annealing (appaiamento dei primers) ed estensione. Queste fasi, che si realizzano attraverso riscaldamenti e raffreddamenti automatizzati mediante un termociclatore, rappresentano un ciclo di amplificazione; la ripetizione in continuo del ciclo base porta alla produzione di miliardi di frammenti del DNA in studio. Alla denaturazione del DNA che avviene ad alte temperature segue l appaiamento di specifici primers al DNA target: l enzima Taq polymerase riconosce le estremità 3' di questi primers ed utilizzando i nucleotidi trifosfati (dntps) polimerizza il DNA, creando in questo modo PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 5 / 8

6 numerose copie del templato. In tutti i sistemi PCR real-time la rivelazione dell amplificato avviene utilizzando un marcatore fluorescente che nelle sonde fluorogeniche viene chiamato reporter. AEAC Dual Easy Chlamydia trachomatis kit permette di rilevare il DNA batterico mediante l impiego di sonde fluorogeniche sequenza specifiche. Le sonde fluorogeniche sono costituite da una sequenza oligonucleotica che presenta all estremità 5 un marcatore fluorescente chiamato «reporter», mentre all estremità 3 legano un secondo marcatore chiamato «quencher». Il saggio è in grado di rilevare il prodotto specifico di amplificazione andando a monitorare l incremento del segnale di fluorescenza che risulta essere direttamente proporzionale alla quantità di prodotto amplificato; l'elevata specificità del sistema consente alla sonda di discriminare tra frammenti che differiscono di un solo nucleotide. DUPLICα RealTime Nel kit vengono usate sonde marcate con fluorofori differenti per il microorganismo bersaglio e per il controllo di estrazione-amplificazione; in particolare le sonde che vanno a rilevare le sequenze batteriche hanno legato in modo covalente come fluoroforo all estremità 5 la molecola FAM (6-carbossifluoresceina) mentre la sonda che va a rilevare il controllo di estrazione-amplificazione (gene β-globina) ha legato come fluoroforo all estremità 5 la molecola HEX (Esa-cloro-fluoresceina). Le due sonde hanno all estremità 3 un dark quencher. Se eccitata, la sonda integra non emette fluorescenza, in quanto la vicinanza del quencher al reporter, impedisce a quest ultimo l emissione della fluorescenza (effetto di quenching). COMPOSIZIONE DEL KIT Questo Kit è stato disegnato per poter eseguire 32 reazioni. Il Kit permette di rilevare un gene umano endogeno (β-globina) validando così il processo di estrazione-amplificazione. Il kit permette di effettuare 4 corse, ciascuna delle quali include: 6 campioni, 1 controllo e 1 bianco di reazione. Per Real Time PCR Mix di Amplificazione (400 ul) Reagenti Oligo Mix* (con primers e sonde per DNA target e controllo di estrazioneamplificazione gene endogeno umano β-globina) (400 ul) Controllo (>50 ul) Bianco di Reazione (B) (50 ul) *Proteggere la fiala da fonti luminose Codice Colore Tappo Blu Tappo Verde Tappo Rosso Tappo Bianco CONSERVAZIONE E STABILITA Tutti i reagenti devono essere conservati a -22 C/-18 C fino alla data di scadenza riportata sulla confezione. EuroClone Diagnostica raccomanda di non scongelare e ricongelare il prodotto più di sei volte. Attenzione: dopo il completo scongelamento e prima dell utilizzo si raccomanda di centrifugare tutti i reagenti e risospenderli pipettandoli 3 volte. MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO Micropipette 1-10 ul e relativi puntali con filtro Micropipette ul e relativi puntali con filtro Kit di estrazione del DNA Cappa biologica bio-hazard (bio-safety level 2), Microcentrifuga da banco Rack per tubi da 0.2 ml Micropiastra ottica per Real-Time PCR Tubi per PCR da 0.2 ml con tappi ottici Termociclatore Real-Time PCR PRECAUZIONI E RACCOMANDAZIONI DI UTILIZZO La strumentazione di laboratorio (pipette, tubi, etc.) non deve circolare da una stazione di lavoro all altra. Non utilizzare reagenti dopo la data di scadenza. Miscelare i reagenti del kit prima dell utilizzo. Periodicamente verificare la precisione delle pipette, e il corretto funzionamento della strumentazione. Cambiare spesso i guanti. Lavare periodicamente il banco di lavoro con Ipoclorito al 0,5%. Utilizzare i guanti senza talco e evitare di lasciare ditate sui tappi ottici. Non scrivere sui tappi, questo potrebbe creare dei problemi nella rivelazione della fluorescenza. PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 6 / 8

7 PROTOCOLLO OPERATIVO a) Estrazione DNA Batterico da campioni clinici La validazione del kit è stata effettuata utilizzando i seguenti campioni biologici: tamponi, urine e liquido seminale. Per l estrazione dell urina si consiglia di: raccogliere ml della prima urina del mattino in un contenitore pulito e chiuso senza alcun conservante; centrifugare a 800g a +2 /+8 C per 5 minuti; verificare la presenza di pellet; rispospendere il pellet in 500 ul di PBS o fisiologica. I campioni possono essere conservati tra +2 C e +8 C e, preferibilmente estratti immediatamente o entro le 24 ore. EuroClone Diagnostica raccomanda per l estrazione del campione biologico i sistemi automatici: (1) Duplicα Prep Body Fluid kit (ref. EDI004200), (2) Qiagen EZ1 DNA Tissue Kit (48) (ref ). b) Amplificazione e Rilevazione EuroClone Diagnostica ha validato il kit utilizzando i seguenti termociclatori con tecnologia Real Time: (1) SmartCycler (Cepheid) con dye-set FCTC25, (2) CFX96 e DX Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). Profilo termico: Tempo Temperatura N di Cicli 5 min 95 C 1 15 sec 95 C 60 sec 68 C 15 sec 95 C 60 sec 54 C X 10 Acquisizione Fluorescenza off X 50 Acquisizione Fluorescenza on c) Preparazione della PCR mix Per ogni esperimento preparare una mix di PCR per 1 controllo, 1 bianco di reazione, n campioni più uno. La mix deve essere preparata miscelando i reagenti nei rapporti volumetrici di seguito indicati: REAGENTI VOLUME (ul) Amplification mix 10 Oligo mix 10 Terminata la preparazione della mix, aliquotare 20ul della Master Mix nei tubi o nelle micropiastre per PCR e aggiungere in ogni tubo 5 µl di DNA estratto o del controllo; disporre i tubi all interno dello strumento e avviare il programma di amplificazione precedentemente impostato. Al termine del protocollo di amplificazione, rimuovere i tubi dal termociclatore. d) ANALISI ed INTERPRETAZIONE dei RISULTATI Il segnale di fluorescenza registrato dalla strumentazione identifica la presenza del DNA, in particolare la fluorescenza rilevata dal CANALE FAM identifica il DNA target, mentre la fluorescenza rilevata dal canale HEX identifica l amplificazione del controllo di estrazione-amplificazione (gene endogeno β- GLOBINA). I risultati sono interpretati attraverso l analisi del ciclo soglia Ct (Threshold Cycle Ct) per ciascun campione. Il ciclo soglia è definito come il ciclo, a livello del quale, la curva di amplificazione interseca la linea soglia (Threshold line). Quando si registra un segnale a livello di fluoroforo FAM (Ct > 0), il campione è sicuramente positivo, ed il segnale rilevato dal fluoroforo HEX (Ct 0) non è rilevante. Quando non si registra segnale a livello di Fluoroforo FAM (Ct = 0), per confermare la negatività del risultato, si deve verificare l avvenuta amplificazione del controllo di estrazione-amplificazione e quindi la comparsa di un segnale di fluorescenza a livello di Fluoroforo HEX (Ct>0). Solo in questo caso si può affermare che il campione biologico utilizzato: contiene cellule umane; è stato correttamene estratto; è sicuramente negativo. L assenza di segnale di amplificazione a livello dei due fluorofori FAM-HEX (Ct=0) indica che: sono presenti inibitori della reazione PCR o che il campione non è cellulato o che l estrazione è fallita. In questo caso si suggerisce di: (1) effettuare una diluizione 1:10 del DNA target (per cercare di ovviare alla presenza di inibitori); (2) ripetere l analisi del campione a partire dalla fase di estrazione. PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 7 / 8

8 FAM HEX RISULTATO Ct > 0 Non rilevante (Ct 0) POSITIVO Ct = 0 Ct > 0 NEGATIVO Ct = 0 Ct = 0 INIBITO/CAMPIONE ACELLULATO/ESTRAZIONE FALLITA EuroClone Diagnostica raccomanda: per SmartCycler di posizionare la linea threshold a 10RFU in entrambi i canali; per Bio-Rad DX Real-Time PCR Detection System (versione del software 1.7) di utilizzare la funzione Regression per il posizionamento automatico della threshold. Attenzione: La corsa é valida solo se: Il Bianco é negativo in negativi entrambi i canali FAM ed HEX. Il Controllo è positivo in entrambi i canali FAM ed HEX. Se si verificano queste due condizioni la corsa risulta valida ed é possibile analizzare i dati, altrimenti la corsa non é valida. É responsabilità dell operatore convalidare la corsa controllando che queste due condizioni si siano verificate. TROUBLESHOOTING Problema 1: Mancanza completa di segnale 1. E stato scelto il canale/filtro sbagliato. 2. Errore nel pipettaggio per omissione di un reagente o del campione. 3. Effetti inibitori del campione: insufficiente purificazione del DNA. 4. Estrazione insufficiente del DNA o campione non cellulato. 5. Controllare la corretta conservazione del kit. 6. Controllare le prestazioni del termociclatore. Problema 2: Intensità di fluorescenza è troppo bassa 1. Deterioramento dei fluorofori e/o dei primers dovuto ad una errata conservazione del Kit. 2. Quantità di DNA non idonea e/o di bassa purezza. Problema 3: Intensità di fluorescenza variabile 1. La PCR Master Mix non è stata miscelata in modo corretto. 2. Presenza di bolle d aria intrappolate nei tubi di PCR. L acquisto di questo prodotto assicura all acquirente i diritti coperti da alcuni brevetti Roche allo scopo unico di offrire servizi di diagnostica umana in vitro. L acquisto di questo prodotto non concede nessun altro brevetto generale, diritto o licenza di alcun tipo, al di fuori dello specifico diritto di utilizzo. Rev PI EBR031032/Rev0/0113/1_ENITA Pag 8 / 8

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