IMMUNOFLUORESCENZA: TECNICHE DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI. Massimo Riccio

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1 IMMUNOFLUORESCENZA: TECNICHE DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Massimo Riccio

2 LOCALIZZAZIONE DI PROTEINE TRAMITE FLUORESCENZA IMMUNOFLUORESCENZA - disponibilità di Abs specifici - tecniche immunocitochimiche che prevedono l uso di Ab coniugati con fluorocromi PROTEINE FLUORESCENTI (FP) - Chimerizzazione della proteina in esame con proteine fluorescenti (BFP, GFP, YFP, RFP) - Transfezione di cellule in coltura - Produzione di organismi transgenici MARCATURE MULTIPLE - Impiego simultaneo di 2 o più Abs e/o FP per co-analizzare la distribuzione di due o più proteine

3 IMMUNO-FLUORESCENZA Metodo diretto L anticorpo specifico per la molecola di interesse è direttamente coniugato al Fluorocromo FITC-mouse anti X X I II I Metodo indiretto Si usa un anticorpo (primario) per rilevare l antigene d interesse. L Ab primario è rivelato da un secondo Ab (secondario), coniugato al fluorocromo e diretto contro la specie in cui è stato prodotto il primario FITC-goat anti mouse mouse anti X X

4 IMMUNO-FLUORESCENZA: METODO DIRETTO Fissazione Lavaggio in PBS Permeabilizzazione Lavaggio in PBS Saturazione dei siti aspecifici con BSA 3% in PBS Anticorpo coniugato (FITC, TRITC, Cy3, ecc ) Lavaggio in PBS Montaggio con anti-fading Si possono avere problemi di segnale scarso o insufficiente a causa dell ingombro sterico fra le molecole di fluorocromo E utile nelle marcature di Ag di superficie in cellule vive

5 IMMUNO-FLUORESCENZA: METODO INDIRETTO Fissazione Lavaggio in PBS Permeabilizzazione Lavaggio in PBS Saturazione dei siti aspecifici con BSA 3% in PBS Anticorpi primari Lavaggio con BSA 3% in PBS Anticorpi secondari (coniugati con FITC, TRITC, Cy3, ecc ) Lavaggio in PBS Montaggio con anti-fading Vantaggi: - notevole riduzione dei problemi dovuti ad ingombro sterico - amplificazione del segnale; su una molecola di Ab primario si legano più molecole di Ab secondario

6 CAMPIONI BIOLOGICI Cellule in coltura adese su vetrino coprioggetto Sezioni di tessuto Preparati in toto piccoli organismi, ovociti, embrioni, da osservasi in microscopia confocale

7 FISSAZIONE Formalina (formaldeide 4%): troppo acida, può compromettere l antigenicità Paraformaldeide 4% PBS ph , è di sicuro quella ottimale Glutaraldeide: sconsigliata, può indurre autofluorescenza nei tessuti Fissazioni alcoliche: metanolo; acetone; metanolo/acetone; metanolo/ac. acetico - possono essere utili per smascherare alcuni antigeni nucleari - Impiegati nelle tecniche di biologia molecolare in situ perché smascherano il DNA e l RNA

8 SEZIONAMENTO Inclusione in paraffina e taglio al microtomo - spessore delle sezioni: da 5-7 mm a 30 mm o più dipende dal microscopio con cui si osserverà il preparato - utilizzare vetrini polilisinati o polisilanati Criostato - da preferire quando possibile poiché crea meno artefatti e limita il mascheramento antigenico - se l antigene lo richiede si può omettere la fissazione

9 PERMEABILIZZAZIONE E indispensabile: - per immunomarcature su cellule in coltura in quanto permeabilizza le membrane permettendo l ingresso dell Ab negli organuli Non è necessaria: - per marcature di Ag di membrana - per preparati ottenuti per sezionamento, ma si può usare per smascherare antigeni celati Si effettua trattando i campioni fissati con detergenti blandi e preferibilmente non-ionici Detergenti non-ionici Triton X100: 0.02% - 0.2% in PBS Tween 20 Nonidet P-40 (NP40) Saponin

10 SMASCHERAMENTO ANTIGENICO Può essere utile nel caso che alcuni antigeni vengano mascherati dal processo di fissazione, inclusione, ecc ; si usa soprattutto in sezioni in paraffina o ottenute al criostato Trattamento Termico - Microonde con vetrini immersi in tamponi salini: Citrato 10mM ph 6.6 Tris/HCl 10mM ph 8.0 EDTA 1 mm ph 8.0 Enzimi Proteolitici - Tripsina a bassa concentrazione - Pronasi allo 0.1% in Tris 0.5M, ph 7,.5 - Pepsina 0.4% in HCl 0.01N.

11 SATURAZIONE SITI ASPECIFICI - BSA (sieroalbumina bovina) al 3% in PBS satura i siti di legame aspecifici determinati da interazioni di carica elettrica - Siero non immune proveniente dalla stessa specie animale che ha prodotto l'anticorpo secondario NGS (normal goat serum) NRS (normal rabbit serum) Saturano le eventuali aspecificità specie-specifiche Possono essere utilizzati entrambi in combinazione L uso dei sieri è sempre meno necessario grazie alla purificazione per affinità e alla disponibilità di secondari Fabbati E opportuno usare la BSA anche nei lavaggi fra primario e secondario

12 ANTICORPI Abs Primari Abs Primari direttamente coniugati Abs Secondari Coniugati Molecola integra F(ab ) 2 fragment

13 ANTICORPI: DILUIZIONE E INCUBAZIONE Abs Primari DILUIZIONE: da 1:10 a 1:3000 (determinata per ogni Ab) in PBS con 3% BSA + eventuali sieri non immuni INCUBAZIONE: 1-2h a RT (in camera umida) 12h (overnight) a 4 C (in camera umida) LAVAGGI CON PBS + 3% BSA!!! Abs Secondari DILUIZIONE: da 1:10 a 1:1000 (determinata per ogni Ab) in PBS con 3% BSA INCUBAZIONE: 30min - 1h a RT al Buio (in camera umida)

14 Intercalanti del DNA Utilizzati in gran parte per colorare nuclei e/o cromosomi, i più comuni sono: - DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindolo cloridrato) - PI (Ioduro di Propidio) Si intercalano fra le basi azotate che costituiscono la doppia elica del DNA PI PI PI

15 Il fading viene generalmente definito come una riduzione di intensità dell emissione fluorescente. Molti autori suddividono il fading in bleaching e quenching. Il bleaching è l irreversibile decomposizione delle molecole fluorescenti a causa dell intensità della luce e della presenza di molecole di ossigeno. Il quenching è la riduzione dell intensità della fluorescenza dovuta ad agenti ossidanti come sali, metalli pesanti o composti alogeni.

16 FADING Anti-fading (sostanze che attenuano il decadimento della fluorescenza) p-phenylenediamine phenylenediamine: il più efficiente reagente per FITC. Efficace anche per la Rodamina. L effetto si attenua alla luce. Tossico n-propylgallate: il più efficiente reagente per Rodamina. Efficace anche per FITC. DABCO (1,4-diazabi-cyclo-2,2,2-octane): Molto efficiente per la FITC. Più resistente alla luce della p-phenylenediamine e meno tossico. Si usano allo 0.1% in glicerolo/tris o glicerolo/pbs.

17 CONTROLLI Presenza di Autofluorescenza del Campione Controllo del Secondario Si omette l Ab primario dalla reazione di immunocitochimica Non si deve ottenere marcatura II I Controllo di secificità: L Ab primario viene preincubato con l Ag usato per generarlo con concentrazione di cento volte maggiore di quella dell Ab L Ab primario una volta preincubato non deve marcare E cruciale per capire se l Ab primario riconosce l Ag in modo specifico. Spesso si unisce ad un controllo in Western Blot. Reazione Contr. del Secondario Contr. di Specificità

18 OSSERVAZIONE DEI PREPARATI!"# $!# $! %& " $ '( $ ')* * +,(&(-) +& $ +,".)("" " $ &- " $-$ %*& " ) * " "$ & / (

19 FLUORESCENZA La fluorescenza è un fenomeno ottico in cui l assorbimento molecolare di un fotone ad una determinata lunghezza d onda (λ) è seguito dall emissione di un altro fotone ad una l maggiore. Ogni sostanza fluorescente è caratterizzata da uno spettro di assorbimento (o eccitazione) e da uno di emissione.

20 FLUORESCENZA: SHIFT DI STOKES La differenza di energia fra il fotone assorbito (λ minore) e quello emesso (λ maggiore) è dovuta alla dispersione di energia sotto forma di calore o di vibrazione molecolare. La differenza di λ di assorbimento e λ di emissione viene sfruttata per separare, tramite filtri, la fluorescenza emessa dal campione dalla luce usata per eccitarlo.

21 INTERCALANTI DEL DNA: DAPI Fissazione in Para 4% PBS DAPI 1 µg/ml in H 2 O per 5-10 min. Antifading DABCO

22 INTERCALANTI DEL DNA: PI PI 1 µg/ml in H 2 O per 5-10 min. Fissazione Alcolica: ottimale Para 4%: è opportuna una digestione con RNAsi

23 FLUOROCROMI: FITC (ex: 490; em:525 ) Fissazione in Para 4% PBS a RT (evita la depolimerizzazione dell actina) Permeabilizzazione: Triton 0.1% PBS per 5 min. RT Ab primario: mouse anti-actina 1h RT Ab secondario: goat anti-mouse FITC 1h RT al buio Osservazione con filtro LP

24 FLUOROCROMI: FITC (ex: 490; em:525 ) Fissazione in Para 4% PBS a 4 C Permeabilizzazione: Triton 0.1% PBS per 5 min. RT Ab primario: mouse anti-cnpasi (marker degli oligodendrociti) 1h RT Ab secondario: goat anti-mouse FITC 1h RT al buio osservazione con Filtro BP

25 FLUOROCROMI: Cy3 TM (ex: 554; em: 568) Fissazione in Para 4% PBS a 4 C Ab primario: mouse anti-gfap (marker degli astrociti) 1h RT Ab secondario: Donkey anti-mouse Cy3 TM 1h RT al buio

26 FLUOROCROMI: Cy5 TM (ex: 649; em: 666) Fissazione in Para 4% PBS a 4 C Ab primario: guinea pig anti-blbp (marker della glia radiale) 1h RT Ab secondario: goat anti- guinea pig Cy5 TM 1h RT al buio Cy5 TM : emette nell alto rosso; è molto utile nelle marcature multiple per separare due o più segnali con buona efficienza

27 MARCATURE MULTIPLE Consentono la visualizzazione di 2 o più molecole nello stesso campione Se i due (o più) segnali sono ben separati nello spettro si può analizzare la colocalizzazione tramite software specifici Le combinazioni più comuni sono: Coloranti (DAPI; PI) e Abs 2 o più Abs contemporaneamente Espressione di GFP e Abs

28 DOPPIA MARCATURA: DAPI + Ab DAPI DAPI Cy3 TM Rabbit anti-mater Sheep anti-rabbit Cy3 TM Cy3 TM DAPI merge

29 DOPPIA MARCATURA: 2 Abs PRIMARI mouse anti-tollip rabbit anti-sumo SECONDARI donkey anti-mouse FITC sheep anti-rabbit Cy3 TM PRIMARI mouse anti-tollip rabbit anti-sumo SECONDARI rabbit anti-mouse FITC mouse anti-rabbit Cy3 TM!!!!! NON VA BENE PRIMARI mouse anti-tollip rabbit anti-sumo SECONDARI donkey anti-mouse FITC 1 2 mouse anti-rabbit Cy3 TM!!!!! Non va bene ma si può fare sequenzialmente

30 DOPPIA MARCATURA: FILTRI NO FITC LP SI FITC BP Cy3 TM Cy3 TM

31 DOPPIA MARCATURA: 2 Abs e colocalizzazione Tollip-FITC Sumo-Cy3 TM merge Tollip-FITC / Sumo-Cy3 TM Colocalization map

32 DOPPIA MARCATURA Cathepsin B Cystatin B merge Colocalizzazione o overlap fra anticorpi? Come capirlo? 1. Controllare che non ci siano possibilità di cross reazioni fra Abs 2. Controllo dei secondari 3. Controllo con un primario e il secondario dell altro primario (e viceversa) 4. Controllo con Primario A, Secondari A e B (non deve esserci rosso) 5. Controllo con Primario B, Secondari A e B (non deve esserci verde)

33 TRIPLA MARCATURA DAPI PREPARATO IN TOTO: oocita Para 4% PBS a 4 C per 30 min Triton 0.2% PBS per 10 min. RT FITC Goat anti-lamin A/C overnight 4 C Rabbit anti MATER 1h RT Donkey anti Goat FITC Sheep anti rabbit Cy3 TM DAPI 1 µg/ml 5 min. RT 1h RT Cy3 TM

34 TRIPLA MARCATURA DAPI Lamin A/C FITC MATER Cy3 TM merge phase contr.

35 TRIPLA MARCATURA: 3 Abs FITC Cellule in coltura: Para 4% PBS a 4 C per 15 min Triton 0.1% PBS per 5 min. RT Cy3 TM chicken anti-ng2 mouse anti GFAP rabbit anti-cystatin B 1h RT donkey anti-chicken FITC sheep anti-mouse Cy3 TM Donkey anti rabbit Cy5 TM 1h RT Cy5 TM

36 TRIPLA MARCATURA NG2 FITC GFAP Cy3 TM Cyst.B Cy5 TM

37 TRIPLA MARCATURA Corteccia Cerebellare: chicken anti-ng2 donkey anti-chicken FITC rabbit anti-cystatin B donkey anti rabbit Cy3 TM mouse anti MAP-2 sheep anti-mouse Cy5 TM

38 QUADRUPLA MARCATURA: 3 Abs + DAPI Mesenchimal Stem Cell: rabbit anti-ckit (CD117) goat anti-rabbit FITC Mouse IgM anti-stro-1 goat anti-mouse IgM Cy3 TM mouse anti CD34 Donkey anti-mouse Cy5 TM DAPI

39 La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina di 238 aa (27 KDa) isolata dalla medusa Aequorea victoria. Il suo gene è stato clonato ed è disponibile commercialmente in diversi vettori plasmidici Inducendo mutazioni nel gene della GFP sono state prodotte varianti di questa proteina con caratteristici spettri di assorbimento ed emissione (BFP; CFP, YFP; DsRed) APPLICAZIONI : Over-espressione di proteine in cellule in coltura e analisi in vivo Coespressione di due o più molecole Analisi della colocalizzazione tramite FRET Generazioni di organismi transgenici

40 PROTEINE FLUORESCENTI BFP: blue fluorescent protein GFP: green fluorescent protein YFP: yellow fluorescent protein RFP (DsRed): red fluorescent protein

41 Costruzione di un vettore che contiene sequenzialmente il gene per GFP e per la proteina da studiare Tranfezione di cellule in coltura Espressione di una chime ra GFP-Proteina GFP Proteina in esame E anche possibile generare organismi transgenici che esprimono la chimera GFP-Proteina

42 PROTEINE FLUORESCENTI Neuroni: Co-tranfezione - doublecortin (DCX) DsRed - mannose phosphate receptor (MPR) GFP.

43 PROTEINE FLUORESCENTI: FRET FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Se la molecola-cfp e la molecola-yfp sono sufficientemente vicine l emissione della CFP causa l eccitazione di YFP

44 PROTEINE FLUORESCENTI: FRET R CFP Gp YFP Utilizzo della FRET per analizzare l interazione fra un determinato recettore e una G protein 430 nm 480 nm stimolo R CFP Gp YFP FRET 430 nm 480 nm 535 nm Nobles et al. 2005; PNAS, 102(51):

45 PROTEINE FLUORESCENTI: Organismi Transgenici Embrione di Zebrafish: marker neurale Embrione di Zebrafish: marker emopoietico Sezione di encefalo di topo transgenico per due marker neuronali cimerici con CFP e GFP

46 GRAZIE PER L ATTENZIONE Per eventuali contatti massimo.riccio@unimore.it