Quantitative Real-time PCR

Dimensione: px
Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "Quantitative Real-time PCR"

Transcript

1 Quantitative Real-time PCR Tecnica che consente la simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target AMPLIFICAZIONE: prevede essenzialmente gli step di una classica PCR QUANTIFICAZIONE: effettuata aggiungendo composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato

2 Real-Time PCR: la reazione COMPONENTI DELLA REAZIONE: 1) DNA target 2) DNA polimerasi 3) Due oligonucleotidi 4) dntps 5) Fluorocromo

3 APPLICAZIONI Diagnosi malattie infettive Quantificazione patogeno RICERCA Espressione genica OGM

4 Perché Real-Time? Misura l amplificazione in tempo reale nella fase esponenziale

5 Curva di amplificazione PCR Target copy number Exponential phase Pateau phase cycle number

6 RT-PCR quantitativa La fluorescenza emessa ad ogni ciclo di amplificazione viene rilevata e analizzata tramite computer Plot lineare Incremento di fluorescenza Cicli di PCR

7 Plot di amplificazione

8 Curve di amplificazione Fluorescenza Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di templato iniziale

9 Curva di amplificazione PCR 96 replicati di uno stesso campione danno quantità finali di c-dna molto diverse

10 Differenze quantificazione PCR convenzionale/real-time PCR PCR conv. Real-time PCR End-point No monitoraggio < Sensibilità Post-PCR Fase esponenziale Monitoraggio > Sensibilità No post-pcr

11 Strumentazione Real-time Termociclizzatore Sorgente laser Detector

12 Strumentazione Real-time

13 Strumentazione Real-time Q F 3 Tubulin 5 Q H 3 GapdH 5 Q TX 3 β-actin 5 Q Cy5 3 Cyclophilin 5

14 ANALISI REAL-TIME PCR Dopo ogni rilevamento, i segnali di fluorescenza sono processati da un software e la cinetica di formazione dell amplificato è visualizzata graficamente come incremento dei segnali di fluorescenza in ordinata (ΔRn) per cicli di reazione in ascissa ΔRn = Rn + - Rn - Rn + = int. fluor. R/int. fluor. Q al mom. rilev. Rn - = int. fluor. R/int. fluor. Q prima dell amplif.

15 CICLO THRESHOLD Il ciclo threshold (CT) è il ciclo della reazione di amplificatione nel quale il segnale di fluorescenza supera il valore di threshold Il threshold rappresenta quel valore di fluorescenza pari a 10 volte la ds della fluorescenza registrata nei primi cicli di amplificazione (background) Thre sho ld Baseline Sam ple C T

16 CICLO THRESHOLD Il C t di 96 replicati dello stesso campione mostra valori di fluorescenza quasi identici perché è calcolato in fase esponenziale

17 CICLO THRESHOLD È strettamente correlato al numero di copie iniziali del target Un numero iniziale di copie pari al doppio anticipa il C t di un ciclo Un numero iniziale di copie pari a metà posticipa il C t di un ciclo Due campioni che possiedono q di target diverse di 1 log hanno un DC t di 3,3 Si mantiene lineare con log di numero di copie iniziali che superano i 6-8 ordini di grandezza Which one has the The least? most?

18 QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA: i campioni sono quantificati in modo assoluto Necessita di standard di cui si conosce la concentrazione assoluta (utilizzo di una curva standard) Per tutti gli unknowns devono essere saggiate identiche quantità di campioni RELATIVA: la quantificazione viene effettuata paragonando i Ct Necessita di controlli endogeni (non si utilizza una curva standard) Gli unknowns vengono quantificati paragonando il loro ΔC T con quello del controllo endogeno

19 QUANTITATIVA ASSOLUTA Il valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello di un gene espresso costitutivamente (b-actina, GAPDH, ATPs, b2 etc)

20 CICLO THRESHOLD Il C t è un indicatore del numero di copie iniziali

21 CURVA STANDARD Amplificando in parallelo ai campioni a conc. non nota (unknown) degli standard esterni (a conc. nota) a diverse diluizioni, è possibile costruire una retta di regressione (curva di taratura o curva standard) Conoscendo il valore di C t, la conc. degli UKN si può ricavare per interpolazione ponendo il C t in ordinata e la conc. iniziale in ascissa

22 CURVA STANDARD

23 CURVA STANDARD Il sistema consente di valutare l efficienza di amplificazione mediante l analisi di tre parametri: 1.Slope (s): indica il n di cicli che intercorrono tra due diluizioni dello standard che differiscono di 1 log (teorico -3,3) 2.Coeff. correlazione (R): esprime le correlazioni esistenti tra i diversi segmenti che compongono la retta di regressione (teorico 1) 3. Intercetta nell asse (y): definisce il n di cicli necessari per rilevare 1 copia di DNA target

24 STANDARD Virus: ac. nucleico estratto da diluizioni log di sosp. virale titolata su cellule (TCID 50 /50ml, PFU) Per DNA: plasmide contenente il target, la cui conc. è stata determinata allo spettrofotometro (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie Per RNA: plasmide trascritto in vitro; la conc. di RNA standard è determinata allo SF (ng/ml) ed eventualmente trasformata in numero di copie

25 QUANTITATIVA RELATIVA ΔC T Effettuata comparando i valori di Ct per determinare il cambiamento di espressione di un gene target in un campione rispetto ad un altro campione scelto come calibratore

26 QUANTITATIVA RELATIVA Per ogni esperimento in quantificazione relativa è necessario: TARGET La sequenza di DNA da analizzare. CALIBRATORE Il campione da usare come riferimento per l analisi comparativa CONTROLLO ENDOGENO Un gene espresso costitutivamente in tutti i campioni analizzati necessario per normalizzare i dati rispetto alla quantità di DNA caricato e a variazioni di efficienza della reazione

27 Quantitativa relativa: analisi dei dati Normalizzare il target con un controllo endogeno (r) espresso costitutivamente (ΔC T ) Comparare ciascun ΔC T così ottenuto con il ΔC T di un calibratore (cb) (ΔΔC T ) 2 -(ΔCT,r- ΔCT,cb) = 2 ΔΔCT Il valore così ottenuto permette di determinare la Concentrazione relativa del target

28 Step per il calcolo del 2- DDCT 1. Normalizzazione con un controllo endogeno (HK) Ct gene interesse Ct HK = ΔCt 2. Normalizzazione con il calibratore ΔCt Campione ΔCt Calibratore = ΔΔCt 3. Applicare la formula 2 -ΔΔCt

29 ESEMPIO Di quanto varia l espressione dell IL-10 tra Liver e Brain? 1. ΔCt Brain = 18 ΔCt Liver = ΔCt campione ΔCt calibratore = = ΔΔCT = 2 6 = 64 L IL-10 è 64 volte più espressa nel Liver rispetto al Brain!

30 Chimiche Real-time PCR Tutte le chimiche fanno uso di fluorocromi che emettono fluorescenza se eccitati da una luce a determinata λ Coloranti intercalanti " SYBR green " Etido bromuro Sonde specifiche ad ibridizzazione " TaqMan (sonde di ibridazione con idrolisi) " FRET " Molecular beacons (sonde di ibridazione senza idrolisi) " Scorpion (sonde incorporate nei primers)

31 COLORANTI INTERCALANTI EtBr emette fluorescenza 25 volte più intensa se legato a dsdna SYBR Green emette fluorescenza 200 volte più intensa se legato a dsdna

32 SYBR GREEN: principio Utilizza una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA

33 SYBR GREEN L intercalante emette una bassa fluorescenza quando non è legato a dsdna Durante l estensione SYBR Green si lega a dsdna: il segnale aumenta Durante la denaturazione SYBR Green torna in soluzione: il segnale dimunisce

34 SYBR Green E un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni. DENATURAZIONE Non viene rilevata fluorescenza Primer SYBR Green ANNEALING L intensità della fluorescenza comincia ad aumentare Luce emessa ALLUNGAMENTO L intensità della fluorescenza continua ad aumentare e diventa massima al termine della fase di allungamento Polimerasi L AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E REGISTRATO A 530 nm

35 SYBR GREEN Primers d. NTPs Intercalation Dyes Thermal Stable DNA Polymerase Add Master Mix and Sample Reaction Tube 3 λ Taq ID Denaturation Annealing

36 SYBR GREEN Extension 3 5 ID ID Taq 5 Taq ID ID λ λ λ ID ID ID ID 5 Taq 5 Extension Continued Apply Excitation Wavelength Taq λ ID λ ID 5 3 Repeat

37 SVANTAGGI Specificità è data solo dai primers La molecola fluorescente si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers È necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici VANTAGGI Metodica semplice Possono essere utilizzati primers in uso in qualitativa Non costosa

38 Curva di melting alla fine della reazione Misurazione della fluorescenza durante il progressivo aumento T > Tm target Alla T alla quale i filamenti di DNA si separano, il segnale precipita Il modo più semplice di programmare una curva di melting consiste nell aumentare gradatamente la temperatura (0.5 C per ciclo)

39 SYBR GREEN Due modi per analizzare la curva di melting la diminuzione della fluorescenza con l aumentare della temperatura il tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo

40 Diminuzione della fluorescenza con l aumentare della temperatura SYBR GREEN

41 Tasso di dimuzione della fluorescenza nel tempo SYBR GREEN aspecific o specifico

42 SONDE DI IBRIDAZIONE Sonde di ibridazione con idrolisi TaqMan Sonde di ibridazione senza idrolisi Molecular Beacons Dual oligo FRET probes Sonde incorporate nei primers Amplifluor Scorpions

43 TAQMAN PROBES Il sistema TaqMan è costituito da 2 primers + 1 sonda (probe) Sfrutta l attività 5-3 esonucleasica di alcune polimerasi (Taq, Tth, Tfl) Il probe è costituito da un oligonucleotide marcato con fluorocromi alle estremità 5 e 3 Fluorocromo 5 REPORTER Fluorocromo 3 QUENCHER Quando la sonda non è ibridata, Q assorbe la fluorescenza di R ed il sistema è silente

44 TAQMAN PROBES Principio di Forster del trasferimento dell energia R Q Q R

45 TAQMAN PROBES Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase R Probe 5 3 Q Add Master Mix and Sample Reaction Tube 3 Taq 5 3 λ R Q Denaturation Annealing

46 TAQMAN PROBES Q R R Q R 3 Taq 5 3 R 5 Extension Step 1. Strand Displacement 3 Q Taq Cleavage Taq Taq R λ R 5 3. Polymerization Complete 4. Detection

47 TAQMAN PROBES Vantaggi Il sistema TaqMan produce un robusto segnale cumulativo Chimica più utilizzata in real-time Mix precostituite per molti saggi TaqMan Svantaggi Il quencher emette fluorescenza Elevato background Specificità alta, ma inferiore rispetto a beacon

48 TAQMAN PROBES Disegno di primers e probe º Amplicone di bp (+ facile denaturazione) º Tm probe = C (10 C > Tm primers) º Tm primers = C º No G all estremità 5 del probe

49 TAQMAN PROBES Effetto della lunghezza dell amplicone sull efficienza di reazione Stessa sonda, stesso DNA-target, stessa [ ] di DNA TC = 19.4 TC = 20.9 Primers studiati per RealTime PCR: I primers amplificano un segmento di 79 basi del transgene TSWV-N Primers utilizzati in PCR tradizionale: I primers amplificano un segmento di 273 basi del transgene TSWV-N

50 File termico Poiché l idrolisi della sonda avviene solo se questa è ibridata al target, l estensione dovrebbe avvenire a T compatibili con la Tm della sonda Molti sistemi TaqMan utilizzano due soli step: 1. denaturazione a 94 C 2. annealing/extension a 60 C

51 SONDE MINOR GROOVE BINDER (MGB) Aumento della stabilita termodinamica Riduzione della lunghezza della sonda (12-18 basi) Incremento della specificita snps diidrociclopirroloindolocarbossilato tripeptide, CDPI3

52 PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) VARIAZIONE NEL GENE DELLA PROTEINA DEL CAPSIDE

53 PARVOVIRUS DEL CANE TIPO 2 (CPV-2) DISEGNO DI PRIMERS E SONDE MGB Test 2a/2b CPVa/b-For Test 2b/2c CPVb/c For CPVa/b-Rev CPVb/c Rev CPVa-Pb (marcata con VIC) (marcata con FAM) CPVb1-Pb (marcata con FAM) (marcata con VIC) CPVb2-Pb CPVc-Pb 4062A G 4064T A

54 MOLECULAR BEACONS Possiedono una struttura stem and loop Il loop è costituito da una regione complementare alla sequenza target Lo stem è costituito da due braccia complementari tra di loro, marcate rispettivamente con reporter e quencher

55 MOLECULAR BEACONS Lungh. braccia = 4-7 bp Tm loop = C Tm braccia =2-5 C<Tm loop Tm primers=58-60 C

56 MOLECULAR BEACONS In soluzione il beacon assume una forma a forcina (hairpin), a causa della elevata complementarietà tra le basi delle braccia QUENCING Quando è ibridato al target, il beacon assume conformazione lineare FLUORESCENZA

57 MOLECULAR BEACONS Primers d. NTPs Thermal Stable DNA Polymerase Molecular Beacon Add Master Mix and Sample Reaction Tube R Q 3 Taq 5 3 Annealing 5 R Q 5 3 Denaturation

58 MOLECULAR BEACONS λ Q R Detection Taq 5 3 Taq 3 Q R 5 Molecular Beacon 5 3 R Q Extension Step 1. Strand Displacement 2. Polymerization Complete Probe Silent

59 MOLECULAR BEACONS Vantaggi Alta specificità (1 nt) Basso background Svantaggi I beacon non producono un robusto segnale cumulativo Difficoltà nel disegno del beacon

60 FRET PROBES Utilizzano due sonde diverse che ibridizzano al target in modo che l estremità 5 della prima sia vicina alla estremità 3 della seconda (ibridazione testa-coda) La prima sonda reca alla estremità 5 un fluoroforo (donatore) la cui emissione è silente, ma capace di eccitare il fluoroforo presente alla estremità 3 dell altra sonda Solo l emissione del secondo fluoroforo è captata dal detector

61 Sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano al DNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sono però due sonde ognuna marcata con un solo fluorocromo (accettore e donatore) Quando le sonde non sono legate alle sequenze target il segnale fluorescente proveniente dall'accettore non è rilevato donatore accettore Durante lo step di annealing PCR, entrambe le sonde FRET ibridizzano alle sequenze target: ciò avvicina il fluoroforo donatore all'accettore permettendo il trasferimento di energia tra i due fluorofori e la produzione di un segnale fluorescente da parte dell'accettore che viene rilevato

62 R FRET PROBES 3 l D R bases D R Taq Detection Extension Step 1. Strand Displacement System Silent Taq 2. Polymerization Complete System Silent

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E possibile scegliere selettivamente cosa amplificare (specificità)

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). End point PCR vs quantitative Real-Time PCR PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando

Dettagli

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA

Dettagli

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di

Dettagli

Real Time PCR. La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico.

Real Time PCR. La PCR Real Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico. eal Time PC La PC eal Time è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico. Gli strumenti per PC eal Time, oltre a fungere da termociclatori,

Dettagli

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita

Dettagli

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction

PCR - Polymerase Chain Reaction PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA,

Dettagli

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a)

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2.

Dettagli

ABI-7700 User Bulletin #5

ABI-7700 User Bulletin #5 ABI-7700 User Bulletin #5 1. halogen tungsten lamp 2b. emission filters 3. intensifier 5. ccd detector 350,000 pixels 2a. excitation filters 4. sample plate www.biorad.com 3 Real-time qpcr - La fluorescenza

Dettagli

Metodiche Molecolari

Metodiche Molecolari Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare

Dettagli

PCR LIMITI. PCR Quantitativa

PCR LIMITI. PCR Quantitativa PCR QUANTITATIVA PCR LIMITI -Falsi Positivi -Analisi Qualitativa NUOVE PROSPETTIVE PCR Quantitativa PCR QUANTITATIVA Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando

Dettagli

Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine

Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine Training Course 2010 Stem Cell Differentiation Napoli, 9-12 Novembre Analisi dei marcatori molecolari della pluripotenza e del differenziamento delle cellule embrionali staminali (ES) murine Cristina D

Dettagli

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine Università degli Studi del Piemonte Orientale A. Avogadro CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE ALIMENTARE Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi

Dettagli

Real Time PCR: Principi e Chimiche Fluorogeniche

Real Time PCR: Principi e Chimiche Fluorogeniche Real Time PCR: Principi e Chimiche Fluorogeniche M. Favarato Medicina di Laboratorio UOS Biologia Molecolare - Ulss13 Mirano Cenni Storici Prima dell avvento della PCR l analisi molecolare si avvaleva

Dettagli

Metodica fu ideata nel 1983

Metodica fu ideata nel 1983 Metodica fu ideata nel 1983 PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi

Dettagli

Metodi di analisi mutazionale

Metodi di analisi mutazionale Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,

Dettagli

Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler. Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino

Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler. Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino Note Tecniche al LightCycler Selezione di sonde di ibridazione per LightCycler Olfert Landt e Andreas Nitsche, TIB MOLBIOL, Berlino 1. Introduzione Scopo di questa nota La detezione di amplicon specifici

Dettagli

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine)

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) Isolamento e purificazione di DNA e RNA -Rompere la membrana cellulare -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) -Separare gli acidi nucleici tra loro -Rompere la membrana

Dettagli

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Moria del pero (Candidatus Phytoplasma pyri) Fitoplasmi: Microrganismi

Dettagli

Controllo ufficiale degli OGM nel settore agroalimentare

Controllo ufficiale degli OGM nel settore agroalimentare Controllo ufficiale degli OGM nel settore agroalimentare Ugo Marchesi Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e Toscana Centro di Referenza Nazionale per la ricerca di OGM ugo.marchesi@izslt.it ORGANISMI

Dettagli

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi

Dettagli

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA CLM Biotecnologie per l Alimentazione CLM in Biotecnologie Sanitarie Corso di Chimica e certificazione degli alimenti DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA VIRUS ENTERICI virus escreti tramite

Dettagli

T V A. Il processo analitico è costituito da tre fasi distinte: a) Estrazione - arricchimento b) Retrotrascrizione c) Amplificazione Real Time TM

T V A. Il processo analitico è costituito da tre fasi distinte: a) Estrazione - arricchimento b) Retrotrascrizione c) Amplificazione Real Time TM genedia DIVISIONE BIOMOLECOLARE DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DI RNA HCV MEDIANTE HPA (HIGH PERFORMANCE AMPLIFICATION) T V A L HPA è un protocollo d amplificazione che coniuga le conoscenze acquisite con

Dettagli

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte PCR Prof.ssa Flavia Frabetti PCR o reazione di polimerizzazione a catena Fine anni 80 Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte Permette di estrarre

Dettagli

eaction A very efficient method for IN VITRO REPLICATION of DNA

eaction A very efficient method for IN VITRO REPLICATION of DNA 1 olymerase hain What is it? eaction A very efficient method for IN VITRO REPLICATION of DNA What is for? Synthesis of several million copies of a specific DNA sequence within a few hours 2 PCR INGREDIENTS

Dettagli

La tecnica Real-Time PCR nelle analisi alimentari: Sicurezza e prevenzione delle frodi

La tecnica Real-Time PCR nelle analisi alimentari: Sicurezza e prevenzione delle frodi La tecnica Real-Time PCR nelle analisi alimentari: Sicurezza e prevenzione delle frodi -Dr. Matteo D Andrea- -Product Specialist PCR, R-Biopharm Italia- Scandali alimentari: Sempre maggiore attenzione

Dettagli

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 corso di genomica aula 8 orario : Martedì ore 14.00-16.00 Giovedì ore 13.00-15.00 Esami 31- gennaio 2012 7- febbraio 2012 28 - febbraio 2012 D. Frezza Esercitazione II

Dettagli

Divisione Biomolecolare

Divisione Biomolecolare S.R.L. Divisione Biomolecolare REAL TIME GENEDIA SRL: VIA LOMBARDA, 169/A 55013 LAMMARI (LU) TEL./FAX 0583962672 EMAIL: info@genedia.it LAB. RICERCA E SVILUPPO: TRAV. PIETRAVALLE,11 80100 NAPOLI TEL./FAX

Dettagli

Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale

Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale Prof.ssa Tiziana Pepe Evoluzioni della tecnica PCR Biotecnologie applicate all ispezione degli alimenti di origine animale Dip. di Medicina Veterinaria e Produzioni animali tiziana.pepe@unina.it Nested

Dettagli

PCR. Polymerase Chain Reaction

PCR. Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction PCR o Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) o Introdotta da Kary B. Mullis alla metà degli anni 80 ha rivoluzionato la genetica

Dettagli

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici

Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici "Focus su sicurezza d'uso e nutrizionale degli alimenti" 21-22 Novembre 2005 Applicazione dei metodi rapidi alla microbiologia alimentare: Real Time PCR per la determinazione dei virus enterici Simona

Dettagli

Metodi di analisi di OGM

Metodi di analisi di OGM Metodi di analisi di OGM Roberta Onori Istituto Superiore di Sanità Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi Alimentari Quadro normativo Attività Pre-marketing Indag ini sulla esposizione

Dettagli

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica

Dettagli

Dott.ssa Maria Antonietta Lozzi Dipartimento di sanità Pubblica e Malattie Infettive Sapienza Università di Roma

Dott.ssa Maria Antonietta Lozzi Dipartimento di sanità Pubblica e Malattie Infettive Sapienza Università di Roma DAGLI ESORDI DELLA MEDICINA MOLECOLARE ALL EVOLUZIONE DELL AUTOMAZIONE Dott.ssa Maria Antonietta Lozzi Dipartimento di sanità Pubblica e Malattie Infettive Sapienza Università di Roma La scoperta che il

Dettagli

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni

Dettagli

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA

Dettagli

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Prof.ssa Flavia Frabetti aa. 2010-11 Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA) Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio Amplificazione o clonaggio

Dettagli

ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE ANALISI DI SEQUENZA.

ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE ANALISI DI SEQUENZA. ANALISI DI MUTAZIONI PUNTIFORMI NON NOTE Margherita Vinciguerra U.O. Ematologia II Laboratorio per lo Studio e la Diagnosi Molecolare Prenatale di Talassemia A.O. V. Cervello, Palermo. Analisi di sequenza

Dettagli

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Il trasferimento energetico di risonanza di fluorescenza (FRET) è una interazione dipendente dalla distanza tra gli stati elettronici eccitati di due molecole

Dettagli

Determinazione dei microrganismi negli alimen1 Argomen( e obbie(vi

Determinazione dei microrganismi negli alimen1 Argomen( e obbie(vi Determinazione dei microrganismi negli alimen1 Argomen( e obbie(vi Necessità e problema0che nella determinazione dei microrganismi negli alimen0 Metodologie alterna0ve Principi - vantaggi e svantaggi applicazioni

Dettagli

La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli:

La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: La possibilita di conoscere i geni deriva dalla capacita di manipolarli: -isolare un gene (enzimi di restrizione) -clonaggio (amplificazione) vettori -sequenziamento -funzione Il gene o la sequenza

Dettagli

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando

Dettagli

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN)

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN) e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme Massimo Degan, CRO Aviano (PN) perchè è importante verificare l RNA La verifica della qualità dell RNA nei saggi diagnostico-molecolari

Dettagli

Dott.ssa Quintarelli Concetta

Dott.ssa Quintarelli Concetta Dott.ssa Quintarelli Concetta Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Pre-PCR Accetazione Post-PCR Refertazione Area PCR GUANTI MONOUSO PUNTALI CON FILTRO CESTELLO PER GHIACCIO TUBINI PCR Materiale

Dettagli

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3 Criteri di identificazione Tradizionale (fenotipo) Tecniche di biologia molecolare Il livello di risoluzione

Dettagli

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo enzimatico estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene Sometime a good idea comes to yow when you

Dettagli

Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4

Metodi: CEN/TC275/WG6/TAG4 Determinazione di HAV e Norovirus in molluschi bivalvi mediante Real time PCR Elisabetta Suffredini Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Ancona

Dettagli

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune:

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune: III giorno: 1) Estrazione del DNA genomico da campioni SECCHI e da coltura liquida 2) Preparazione del gel di agarosio 3) Corsa del DNA genomico in gel di agarosio e sua visualizzazione 4) PCR del DNA

Dettagli

Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica virale

Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica virale Real-Time PCR nella diagnosi virologica Diagnosi virologica e determinazione del carico virale Università di Bologna Dipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale Sezione di Microbiologia

Dettagli

Ibridizzazione in situ

Ibridizzazione in situ ANALISI DELL RNA Northen blot E un metodo simile a quello di traferimento e di ibridizzazione del DNA (Southern blot) e si usa per sondare molecole di RNA. Gli mrna sono molecole brevi, in genere meno

Dettagli

Analisi molecolare dei geni

Analisi molecolare dei geni Analisi molecolare dei geni Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari Ogni

Dettagli

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare Quantificazione di legionella pneumophila mediante metodo biomolecolare Laboratorio di Epidemiologia Genetica e Genomica di Sanità Pubblica Istituto di Igiene LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 011 INT rev. 2 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MAIS EVENTO DAS1507

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 011 INT rev. 2 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MAIS EVENTO DAS1507 BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag 2

Dettagli

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction)

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction) REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI ( PCR =Polymerase Chain Reaction) Verso la metà degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantità

Dettagli

Corso di aggiornamento

Corso di aggiornamento I n t r o d u z i o n e a l l e t e c n i c h e d i bi o l o g i a m o l e c o l a r e e l o r o a p p l i c a z i o n i ne l L a b o r a t o r i o C l i n i c o Corso di aggiornamento Milano - Sabato

Dettagli

L analisi di SNP mediante AB7900

L analisi di SNP mediante AB7900 QUALITA DELL ASSISTENZA: LE TECNICHE ISTOLOGICHE: DALLA FORMAZIONE DI BASE ALLA SPECIALIZZAZIONE NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA L analisi di SNP mediante AB7900 Emanuele Porcu Laboratorio di Genetica

Dettagli

ANNESSO I al CONTRATTO N... "FORNITURA E MANUTENZIONE DI STRUMENTI PER LA REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION - 2 LOTTI"

ANNESSO I al CONTRATTO N... FORNITURA E MANUTENZIONE DI STRUMENTI PER LA REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION - 2 LOTTI Ref. Ares(2014)2178516-01/07/2014 COMMISSIONE EUROPEA CENTRO COMUNE DI RICERCA Istituto per la Salute e la Tutela del Consumatore Unità di Biologia Molecolare e Genomica ANNESSO I al CONTRATTO N... "FORNITURA

Dettagli

DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA.

DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA. DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA. Ogni regione italiana vanta una quantità notevole di prodotti agroalimentari ed animali tipici e caratteristici.

Dettagli

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

Dettagli

Protocollo Crime Scene Investigation

Protocollo Crime Scene Investigation Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!

Dettagli

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS

Dettagli

Tecniche di sequenziamento del DNA

Tecniche di sequenziamento del DNA Tecniche di sequenziamento del DNA -Metodo di Maxam e Gilbert (della degradazione chimica del DNA) -Metodo di Sanger (a terminazione di catena) Metodo di Maxam-Gilbert Questo metodo, basato sulla degradazione

Dettagli

Dott. Stefano De Martin ARPA Friuli Venezia Giulia RGQ Dipartimento di Pordenone L accreditamento dei laboratori per la sicurezza alimentare

Dott. Stefano De Martin ARPA Friuli Venezia Giulia RGQ Dipartimento di Pordenone L accreditamento dei laboratori per la sicurezza alimentare Valutazione dell incertezza di misura: esperienza di un laboratorio accreditato per gli OGM ARPA Friuli Venezia Giulia RGQ Dipartimento di Pordenone L accreditamento dei laboratori per la sicurezza alimentare

Dettagli

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Guida reagenti

Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System. Guida reagenti Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guida reagenti Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System Guida reagenti Copyright 2006, 2010 Applied Biosystems. All rights reserved. Information

Dettagli

SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A. 2014-2015 Corso di Laboratorio di Biofotonica

SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A. 2014-2015 Corso di Laboratorio di Biofotonica SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A. 2014-2015 Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria

Dettagli

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)

Dettagli

INTRODUZIONE ALLA BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICA (a cura del Responsabile Scientifico del Congresso: Dott. Paolo Lanzafame)

INTRODUZIONE ALLA BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICA (a cura del Responsabile Scientifico del Congresso: Dott. Paolo Lanzafame) INTRODUZIONE ALLA BIOLOGIA MOLECOLARE CLINICA (a cura del Responsabile Scientifico del Congresso: Dott. Paolo Lanzafame) La Biologia Molecolare Clinica è il settore disciplinare afferente alla Medicina

Dettagli

IL TEST DI CITOTOSSICITÀ

IL TEST DI CITOTOSSICITÀ IL TEST DI CITOTOSSICITÀ Questo test permette di valutare in vitro la capacità di un agente di inibire la crescita cellulare. La riduzione nel numero delle colonie può derivare sia dal blocco della proliferazione

Dettagli

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

SEQUENZIAMENTO DEL DNA SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 003 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): TERMINATORE NOS

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 003 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): TERMINATORE NOS BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 Redatto: U.Marchesi Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.amaddeo BIOTECNOLOGIE

Dettagli

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche I T A L B I O F O R M A i n c o l l a b o r a z i o n e c o n O R D I N E N A Z I O N A L E D E I B I O L O G I o r g a n i z z a i l c o r s o d i a g g i o r n a m e n t o BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione

Dettagli

Analisi quantitativa in biologia molecolare

Analisi quantitativa in biologia molecolare 170 Rassegna Analisi quantitativa in biologia molecolare O. Valentini, B. Milanesi Laboratori di Patologia Clinica Azienda Ospedaliera di Desenzano del Garda (BS) Riassunto La quantificazione di specifiche

Dettagli

Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto

Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto Aula Magna Villa Sironi Gallarate 16 ottobre Dott. Carmelo Lupo Coordinatore Tecnico Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica PERCHÉ K-RAS

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 017 INT rev. 1 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR LECTINA

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 POS VIR 017 INT rev. 1 del 19/06/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR LECTINA BIOTECNOLOGIE pag 1 di 11 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag 2

Dettagli

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

Dettagli

PCR. Polymerase Chain Reaction

PCR. Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction PCR o Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) o Introdotta da Kary B. Mullis alla metà degli anni 80 ha rivoluzionato la genetica

Dettagli

La tecnologia Seegene per la diagnosi delle Malattie Sessualmente Trasmesse in Real Time PCR

La tecnologia Seegene per la diagnosi delle Malattie Sessualmente Trasmesse in Real Time PCR La diagnostica molecolare delle malattie sessualmente trasmesse (non HIV): nuovi percorsi di appropriatezza analitica e clinica. La tecnologia Seegene per la diagnosi delle Malattie Sessualmente Trasmesse

Dettagli

ANALISI POST-GENOMICHE TRASCRITTOMA: CONTENUTO DI RNA DI UNA CELLULA.

ANALISI POST-GENOMICHE TRASCRITTOMA: CONTENUTO DI RNA DI UNA CELLULA. TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA RT-PCR REAL TIME PCR NORTHERN BLOTTING ANALISI POST-GENOMICHE Conoscere la sequenza genomica di un organismo non è che l inizio di una serie di esperimenti

Dettagli

ATI POZZALI FRATELLI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI

ATI POZZALI FRATELLI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI SCHEDE TECNICHE INTERVENTI CONCLUSI ATI POZZALI FRATELLI - POZZALI FRATELLI Srl Casaletto Ceredano CR - STELLA BIANCA Spa Ossago Lodigiano LO - MOLINO BRESCIANO Snc Azzano Mella BS - CRAM-BIOLAB Srl Brescia

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag

Dettagli

PCR. Polymerase Chain Reaction

PCR. Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction PCR o Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) o Introdotta da Kary B. Mullis alla metà degli anni 80 ha rivoluzionato la genetica

Dettagli

Preparazione dei campioni da inviare per il sequenziamento

Preparazione dei campioni da inviare per il sequenziamento Preparazione dei campioni da inviare per il sequenziamento PCR preparativa Buffer 10x dntp 2mM Taq polimerasi Oligonucleotidi up e down 100 ng/ul Volume finale 2 ul/campione 2 ul/campione 0,5 U/campione

Dettagli

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE Il doppio strand della molecola di DNA può denaturarsi dando due singoli strand ad alte temperature (>90 C). Due strand di DNA complementari possono accoppiarsi dando

Dettagli

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica: DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 22 POS VIR 061 INT rev. 4 del 02/02/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): SOIA ROUNDUP READY/LECTINA

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 22 POS VIR 061 INT rev. 4 del 02/02/2009 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): SOIA ROUNDUP READY/LECTINA BIOTECNOLOGIE pag 1 di Redatto: U.Marchesi Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.amaddeo BIOTECNOLOGIE pag di

Dettagli

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono

Dettagli

Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip

Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip mazzei@di.unipi.it (materiale parzialmente tratto da: http://nestor.med.unibo.it/shared_files/seminari/sartini_21-10-2004.ppt) Biosensori ad affinità basati

Dettagli

1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive

1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive . Biotecnologie 1 Congresso NEWMICRO e diagnostica molecolare nella diagnosi delle malattie infettive. «Rotor Gene Q una sola piattaforma. per Real Time e High Resolution Melt». Sala. 19/21 Gennaio 2011

Dettagli

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici In questa lezione darò qualche breve cenno sui metodi di sequenziamento del DNA e specialmente quelli con marcatura fluorescente che attualmente vengono effettuati

Dettagli

QUESITI E RISPOSTE. Aggiornato al 19/09/2013

QUESITI E RISPOSTE. Aggiornato al 19/09/2013 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA LOMBARDIA E DELL'EMILIA ROMAGNA (ENTE SANITARIO DI DIRITTO PUBBLICO) ------------------------------------- BRESCIA Via Bianchi,/9 25124 BRESCIA Tel. 030-22901

Dettagli

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo C.R.A. Consiglio per la Ricerca in Agricoltura Centro di ricerca per la genomica Fiorenzuola d Arda (Piacenza) SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo Tutor: Dott. Gianni TACCONI Studente:

Dettagli

La PCR e le sue applicazioni. La PCR di base L RT-PCR Applicazioni mediche e forensi

La PCR e le sue applicazioni. La PCR di base L RT-PCR Applicazioni mediche e forensi La PCR e le sue applicazioni La PCR di base L RT-PCR Applicazioni mediche e forensi Polymerase Chain Reaction e sue applicazioni La polymerase chain reaction o PCR è una tecnica relativamente recente che

Dettagli

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 SEDE LEGALE: Via Helsinki 21, 00144 Roma Tel. 06 97998273; Fax 06 52246148 e-mail: orgabiohuman@fastwebnet.it

Dettagli

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Biologia molecolare clinica Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Le tecniche di biologia molecolare negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori di diagnostica clinica dove

Dettagli

IL TEST HPV: ASPETTI TECNICI

IL TEST HPV: ASPETTI TECNICI IL TEST HPV: ASPETTI TECNICI I. Maestri Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica Sezione di Anatomia Patologica Università degli Studi di Ferrara Ferrara, 13 ottobre 2006 I Papillomavirus (HPV)

Dettagli

immagine Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello Materiale Didattico

immagine Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello Materiale Didattico Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello

Dettagli

Test per il rilevamento o la quantificazione tramite PCR in real-time di Legionella spp. e Legionella pneumophila nei campioni di acqua

Test per il rilevamento o la quantificazione tramite PCR in real-time di Legionella spp. e Legionella pneumophila nei campioni di acqua iq-check Screen Legionella spp. Kit Codice #: 357-8104 iq-check Quanti Legionella spp. Kit Codice #: 357-8102 iq-check Screen L. pneumophila Kit Codice #: 357-8105 iq-check Quanti L. pneumophila Kit Codice

Dettagli

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno).

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Programma: Giorno 1Preparazione di DNA genomico da foglie 2 - Controllo qualità DNA

Dettagli