Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano giugno 2009

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1 Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di giugno 2009 DNA umano 1

2 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine di identificare un individuo a partire da una traccia biologica. 2

3 Come quelli del RIS di Parma! 3

4 Brevi cenni storici Kary Banks Mullis è un biochimico statunitense Premio Nobel per la Chimica nel 1993, Mullis è divenuto una leggenda per la scoperta della PCR. Una tecnica che permette l amplificazione in vitro di frammenti di DNA, con innumerevoli applicazioni in campo biologico, medico, agrario, e nelle investigazioni scientifiche. 4

5 Obiettivo dell esperimento Studiare alcuni marcatori polimorfici del DNA umano. 5

6 Marcatori in esame D1S80: Si trova sul cromosoma 1 È caratterizzato dalla ripetizione di 16 bp. Sono stati identificati 29 differenti alleli (ciò porta alla presenza di 435 possibili combinazioni alleliche). 6

7 SequenzaY GATA A7.2 E presente solo sul cromosoma Y umano E caratterizzata dalla ripetizione di 4 bp. Sono stati identificati 5 differenti alleli (15 possibili combinazioni alleliche). 7

8 SequenzaHAM Frammento del gene dell amelogenina, proteina con un ruolo nella formazione dello smalto dentale. Questo marcatore permette di determinare il sesso dell individuo. 8

9 POSSIBILI FONTI DNA 9

10 PROTOCOLLO Estrazione e purificazione del DNA Amplificazione del DNA tramite PCR Preparazione del gel d agarosio per l analisi dei prodotti di amplificazione Elettroforesi su gel di agarosio Osservazioni 10

11 Estrazione e purificazione DNA Ottenere una soluzione salina costituita da acqua, 0,9% di NaCl e saliva del candidato. Le cellule da cui estrarre il DNA si depositano sul fondo della provetta per centrifugazione del campione. Aggiungere resina Chelex 10% e incubare a 99 C per 10 minuti. Centrifugare il campione: il DNA purificato si trova nel surnatante. 11

12 Amplificazione del DNA Composizione della master mix: Coppia di primer (forward e reverse) specifici per ogni marcatore Taq DNA polimerasi Nucleotidi trifosfato (dntps) MgCl 2 Soluzione tampone specifica + DNA stampo purificato 12

13 PCR 13

14 Un tipico ciclo di PCR Denaturazione al calore (94-95 C) del DNA stampo che deve essere copiato Appaiamento (annealing) di coppie di primer (50-65 C) Estensione da parte della DNA polimerasi termoresistente a partire dai primer (72 C). 94 C 94 C 72 C 72 C 1 ciclo C 2 ciclo C 14

15 Elettroforesi su gel di agarosio L elettroforesi su gel di agarosio e un metodo semplice e veloce che permette di separare, e quindi identificare, frammenti di DNA in base al loro peso molecolare. I frammenti migrano, nel campo elettrico che attraversa il gel, dal polo negativo a quello positivo, in funzione delle cariche elettriche negative conferitegli dai gruppi fosfato. La velocita di migrazione è influenzata: 1) dalle dimensioni dei frammenti 2) dalla percentuale dell agarosio nel gel 3) dal voltaggio applicato 15

16 Particolare del caricamento dei pozzetti Vaschetta per elettroforesi su gel 16

17 Risultati 17

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20 Osservazioni Nel gruppo c è un solo individuo di sesso maschile: marcatore Y e due frammenti per il marcatore HAM. Presenza di più alternative per D1S80 all interno del gruppo. Messa a punto del metodo: definizione della temperatura di annealing dei primers e concentrazione di MgCl 2. Difficoltà nella preparazione della Master Mix per la PCR. Risultati venuti parzialmente, difficoltà nell amplificazione D1S80. 20

21 BACKSTAGE 21

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26 Bibliografia //nestor.med.unibo.it; biowww.net; users.unimi.it; ; parma.repubblica.it; xoomer.virgilio.it; medgen.univr.it; Testi a cura di Giulia Barbieri, Valeria De Vito, Deborah Druidi, Giulia Gabrielli, Angelica Martoccia, Elisa Neri, Andrea Vittorio, Irene Zaghi. Elaborazione grafica a cura di Andrea Vittorio. Si ringrazia lo staff LLC ed, in particolare, la dott.ssa MARIA CHIARA PASCERINI per la pazienza e la cortesia con le quali ci hanno seguito durante il corso. 26