1. Le biomolecole: Struttura e funzione delle proteine

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1 1. Le biomolecole: Struttura e funzione delle proteine Corso 240/350: Didattica di biochimica e biologia molecolare con laboratorio (2 CFU) 16 ore) Marco Scocchi ( BIO/10-11)

2 Le biomolecole Biomolecola: composto chimico che riveste un ruolo importante negli esseri viventi. Le biomolecole sono composte essenzialmente da carbonio (infatti si parla di scheletro carbonioso e idrogeno, cui sono spesso associati azoto, ossigeno, fosforo e zolfo. Monomeriche (vitamine, metaboliti, zuccheri semplici) o polimeriche (polisaccaridi, Proteine, DNA)

3 La gerarchia molecolare: dal più semplice al più complesso Precursori inorganici es CO 2 ; < 70 Daltons Metaboliti Es. piruvato; Daltons Unità costitutive Es. amminoacidi; Daltons Macromolecole Es. proteine; kdaltons L organismo Complessi sopramolecolari Es. ribosomi; kdaltons La cellula Organelli Es. mitocondri 1 Dalton = massa dell atomo di (1,67 x g)

4 Le proteine Macromolecole più abbondanti delle cellule - presenti in tutti i compartimenti cellulari (da pròteinos = primario, Mulder 1839) Tutte le proteine sono catene lineari costituite da unità monomeriche (20 amminoacidi) legate covalentemente. Si avvolgono spontaneamente formando strutture tridimensionali Contengono una vasta gamma di gruppi funzionali chimicamente reattivi. Interagiscono tra loro e con altre molecole biologiche. Funzioni: catalisi, difesa, struttura-sostegno, trasporto, immagazzinamento, movimento, segnale, regolazione, etc.

5 La struttura generale degli -amminoacidi Carbonio α Gruppo amminico Gruppo carbossilico Gruppo R ( o catena laterale) ll carbonio alfa degli amminoacidi è tetraedrico, lega 4 sostituenti differenti: un centro chirale: COO _ COO _ + 3 N L-alanina C C N 3 + D-alanina C 3 Configurazione assoluta L: presente nelle proteine C 3 Non presente nelle proteine ma presente in natura Triplice nomenclatura: Alanina, Ala, A

6 Gli amminoacidi hanno differenti stati di ionizzazione Gli amminoacidi in acqua sono ioni dipolari che possono agire da basi e da acidi Lo stato di ionizzazione cambia con il p Forma protonata Forma dipolare Forma deprotonata Ione dipolare (Zwitterione = ione ibrido) ha una doppia natura acido-base

7 Classificazione degli amminoacidi Si possono formare 5 gruppi in base alla polarità, la carica, dimensione e reattività chimica dei gruppi R : 1. Alifatici non polari - idrofobici 2. Aromatici - idrofobici 3. Polari non carichi - idrofilici 4. Carichi positivamente - idrofilici 5. Carichi negativamente - idrofilici

8 Valori di pk di gruppi ionizzabili delle proteine Sette aa hanno catene laterali ionizzabili

9 Gli amminoacidi si legano covalentemente a formare polimeri lineari (polipeptidi) Reazione di condensazione Catena principale 3 N + C 3 C COO - 3 N + C O C 2 COO - 3 N + C COO - 3 N + C 3 C O C Tripeptide O N C C N O C 2 C COO - 2 O 2 O Residuo amminoacidico Legami peptidici Corti polimeri(fino aa) = peptidi catene di più di residui= polipeptidi (proteine)

10 La gerarchia strutturale delle proteine L architettura delle proteine può essere concettualmente suddivisa in 4 livelli di organizzazione: Struttura primaria - sequenza amminoacidica della catena principale del polimero. Struttura secondaria - ripiegamento di segmenti di catena in strutture regolari con ripetizione periodica. Struttura terziaria - ripiegamento di singole catene in strutture tridimensionali ben definite e collocazione precisa nello spazio di tutti gli atomi che compongono la catena. Struttura quaternaria associazione di diverse catene polipeptidiche in strutture oligomeriche composte da subunità identiche o differenti

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12 La struttura primaria della proteine Anno 1953: F. Sanger determinò la sequenza degli aa dell insulina: ogni proteina ha una sua sequenza precisa (struttura primaria) che la distingue dalle altre. La sequenza di amminoacidi costituisce la struttura primaria 2 N C R 1 O C N C R 2 O C ( ) N C R n C O O N2-Gly-Leu-Ser-(----)-Gly-Glu-Leu-Gly-O 1 GLSDGEWQLV LNVWGKVEAD IPGGQEVLI RLFKGPETL EKFDKFKLK SEDEMKASED LKKGATVLT ALGGILKKKG EAEIKPLA QSATKKIP VKYLEFISEC IIQVLQSKP GDFGADAQGA MNKALELFRK DMASNYKELG ELG

13 Il legame peptidico Geometria dello scheletro covalente: il legame peptidico (legame ammidico) è planare. C - C=O - N - C si trovano tutti sullo stesso piano (in verde). Natura del legame: carattere di parziale doppio legame impedisce la rotazione attorno al legame stesso. Piano ammidico O C N - O C + N Strutture di risonanza 0,133 Il legame peptidico è meglio rappresentato da un ibrido delle due strutture limite. Lunghezza del legame C-N: 1,32 A intermedio tra legame singolo e doppio.

14 La rotazione attorno al carbonio alfa Con la perdita di rotazione attorno al legame peptidico gli unici punti di flessibilità lungo lo scheletro del polimero sono le rotazioni attorno al carbonio α (legami singoli) Carbonio- Legami che permettono la rotazione lungo lo scheletro della proteina

15 La struttura secondaria: l elica Le catene proteiche si ripiegano a formare strutture regolari con ripetizione periodica della conformazione Scheletro peptidico Legami della struttura secondaria Legami intracatena tra i gruppi C=O di ogni residuo peptidico ed gruppi N- del quarto aa lungo la catena. Paralleli all asse dell elica. Le catene laterali sporgono verso l esterno dell elica minimizzando l ingombro sterico.

16 La conformazione (foglietto ) E la conformazione in cui la catena polipeptidica è la più estesa possibile. Lo scheletro della catena procede a zig-zag. Distanza assiale tra amminoacidi 3,5 Å. Due o più catene polipeptidiche si dispongono l una a fianco dell altra a formare strutture definite foglietti β. Stabilizzata da legami tra due catene adiacenti (intercatena).

17 La struttura terziaria delle proteine Descrive il ripiegamento nello spazio tridimensionale di una singola catena polipeptidica e definisce l esatta posizione nello spazio di tutti gli atomi. La linea di divisione tra struttura secondaria e terziaria non è netta. La struttura terziaria tiene conto delle interazioni a lungo raggio esistenti tra residui aa lontani tra loro nella sequenza lineare e la disposizione dei ponti S-S. I segmenti delle catene polipeptidiche che devono interagire sono mantenuti da diversi tipi di interazioni deboli. In base alla struttura terziaria le proteine possono essere classificate in: Proteine fibrose Proteine globulari Proteine di membrana

18 Le biomolecole hanno una caratteristica Architettura tridimensionale Esempio: Citocromo c, una proteina che trasferisce elettroni Legami covalenti : determinano la sequenza lineare Interazioni non covalenti: determinano il ripiegamento spaziale

19 Le forze chimiche deboli sono responsabili della struttura complessiva delle proteine Forze chimiche deboli (interazioni non covalenti) e loro energie di legame (energia di dissociazione del legame) Interazioni ioniche: 20 kj/mole (in acqua) Legami idrogeno: kj/mole Interazioni di van der Waals: kj/mole Interazioni idrofobiche: <40 kj/mole Energia di dissociazione del legame: energia necessaria per rompere un legame 19

20 Principali interazioni a lungo raggio nelle proteine (globulari) Quasi tutte le proteine hanno parti in α- elica o in conformazione-β. Il loro ripiegamento è complesso e privo di simmetria. Generalmente le catene laterali dei residui apolari si raggruppano all interno della struttura, le catene laterali dei residui polari restano sulla superficie. Gruppi CO e N non impegnati in legami hanno preferanza per l acqua. In genere non vi è spazio libero all interno della struttura - interazioni di van del Waals ed idrofobiche la stabilizzano - tratti con struttura secondaria regolare ( -eliche / -foglietti) si associano. I tratti di congiunzione (ripiegamenti e loop) sono brevi e generalmente sulla superficie della struttura.

21 Proteine fibrose - -cheratina Sono proteine allungate o filamentose che giocano un ruolo chiave nei tessuti degli animali (es. componenti pelle, tessuti connettivi, capelli, unghie, corna, zoccoli e strati esterni della pelle etc.), spesso all esterno delle cellule, formano fibre insolubili in acqua. -cheratina.

22 Le fibre di collagene sono basate su una inusuale molecola elicoidale Il collagene. Principale componente fibroso della pelle delle ossa, dei tendini, e delle cartilagini. Proteina più abbondante. La subunità base del collagene: elica sinistrorsa (no α-elica, no legami ) Tipica sequenza tripeptidica ripetuta Gly-X-Pro (o idrossi-pro) lunga anche 1000 residui. Tre eliche attorcigliate tra loro formano una tripla elica con andamento destrorso (tropocollagene). Le triple eliche di collagene formano fibrille resistenti formate da gruppi di molecole di tropocollagene impilate e unite da legami crociati che aumentano la resistenza.

23 Come si realizza la struttura tridimensionale delle proteine? L esperimento di Anfinsen, con la Ribonucleasi A: dimostra la relazione tra sequenza e conformazione di una proteina 1. La struttura della ribonucleasi A veniva distrutta dal trattamento con urea 8M e β- mercaptoetanolo (2ME) 2. La proteina assumeva una La proteina è denaturata con in guanidinio idrocloruro o urea 5. Tracce di 2ME aiutavano a riordinare i ponti S-S conformazione casuale priva di attività. 3. Allontanando per dialisi il riducente e l urea, la ribonucleasi riacquistava la sua attività. 4. Se l enzima veniva ossidato in presenza di urea si otteneva una proteina inattiva con struttura alterata Ci sono >100 modi per riordinare 8 Cys in 4 ponti S-S

24 La sequenza di una proteina determina la sua struttura tridimensionale L informazione necessaria per specificare la conformazione tridimensionale della proteina è contenuta nella sequenza amminoacidica Cosi il ripiegamento delle proteine è un processo spontaneo che non richiede l assistenza di fattori esterni Il processo di rinaturazione è favorito dalla riduzione di energia libera che accompagna alla formazione di una forma stabile (nativa) della proteina

25 Conclusioni Ogni proteina ha una sua struttura tridimensionale dalla quale dipende la sua funzione La strutture tridimensionale dipende dalla sequenza amminoacidica della proteina Le molteplici strutture sono costruite da pochi comuni motivi strutturali (alfa eliche, conformazioni beta) Le principali classi strutturali sono: le proteine fibrose e quelle globulari. La conformazione nativa è stabilizzata da interazioni deboli quali interazioni idrofobiche e legami. La struttura tridimensionale può essere alterata (denaturata) da trattamenti che distruggono le interazioni deboli. Ciò provoca la perdita della funzione dimostrando che esiste una relazione tra struttura e funzione