Quaderni di Bioinformatica

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1 ARRAY E MICROARRAY QUALUNQUE TECNOLOGIA SUFFICIENTEMENTE AVANZATA E' INDISTINGUIBILE DALLA MAGIA Gian Franco Greppi Stefania Mura CNBS (Centro NanoBiotecnologie Sardegna) Laboratorio di bionanotecnologie Dipartimento di Scienze Zootecniche, Università di Sassari Storicamente le ricerche in genetica sono state focalizzate sullo studio di uno o pochi geni alla volta. Negli ultimi anni l'identificazione di un enorme numero di geni ha portato alla necessità di sviluppare nuove tecniche più adeguate ad un'analisi su larga scala. Due sono state le innovazioni sperimentali che hanno permesso l'analisi simultanea di decine di migliaia di geni. Una è l'utilizzo di supporti rigidi non porosi come il vetro, molto più adatti alla miniaturizzazione ed all'utilizzo di marcatori fluorescenti. L'altra è la sintesi ad alta densità spaziale di oligonucleotidi su vetrini sottilissimi con tecniche fotolitografiche. Si è giunti quindi, alla nascita di una nuova tecnologia di analisi comunemente chiamata microarray o DNA chip dopo un percorso che è partito negli anni 90 e di seguito brevemente richiamato. La conoscenza di varianti genetiche è da tempo un elemento nella diagnostica e nella la cura di pazienti in biomedicina. Per esempio, alcune varianti genetiche portano ad incompatibilità tra tessuti ed organi inficiando il successo di un trapianto. Ma variazioni nella sequenza genomica portano anche ad una diversa suscettibilità verso tutti i tipi di patologie, ad una differente età nella insorgenza e di gravità di molte malattie genetiche, e causano anche una diversa efficacia nella cura. Gli studi di associazione non coinvolgono l'analisi di genealogie di grandi famiglie ma confrontano la prevalenza di un particolare marcatore genetico, o di un gruppo di marcatori, in soggetti affetti e non affetti dalla patologia. Una prevalenza di un marcatore nel gruppo di pazienti affetti viene considerata evidenza di una associazione tra la malattia ed il marcatore. L'associazione non è un fenomeno specificatamente genetico; è una deduzione statistica di coesistenza di alleli e/o fenotipi. L'allele A è associato con la patologia P se i soggetti che presentano P hanno anche una frequenza dell'allele A significativamente maggiore di quella prevista dalle frequenze individuali di A e P nella popolazione. Marcatori molecolari Con il termine di marcatore molecolare si intende un qualsiasi carattere polimorfico mendeliano che può essere impiegato per seguire l'ereditarietà di un segmento cromosomico attraverso un albero genealogico. Per le analisi di associazione è necessaria la presenza di meiosi informative, ovvero casi in cui è definibile quando un gamete è o meno ricombinante. Per la maggior parte degli scopi l'eterozigosità media di un marcatore (la probabilità di un soggetto scelto a caso di essere eterozigote) è utilizzata come misura di informatività del marcatore stesso. I polimorfismi genetici sono variazioni nelle sequenze di DNA presenti in una popolazione con una frequenza maggiore dell'1% e costituiscono strumenti fondamentali per gli studi di genetica. Nei primi anni ottanta i polimorfismi genetici hanno formato, per la prima volta, un gruppo di marcatori sufficientemente numeroso ed adeguatamente distribuito lungo tutto il genoma da permettere ricerche di associazione in tutto il DNA genomico. I primi marcatori molecolari ad essere studiati furono gli RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphisms (polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione). Si tratta di una metodica complessa che può avere come scopo la formulazione di un consiglio genetico. Permette di studiare la trasmissione di un gene in seno a una famiglia quando non è nota la sua sequenza ma solo la sua localizzazione su di un cromosoma. La metodica si serve dell analisi delle sequenze non codificanti di DNA contigue al gene in esame e le utilizza come suoi markers indiretti. Prevede numerosi passaggi tra cui la digestione dell acido nucleico da parte di enzimi di restrizione, dell elettroforesi per la separazione dei frammenti così ottenuti e del southern blotting per il loro trasferimento su di un filtro di nitrocellulosa. Per potere individuare i siti di restrizione, la regione del genoma di interesse viene amplificata tramite PCR ed i prodotti vengono incubati con l'enzima. Eseguendo quindi un'elettroforesi su gel di agarosio si è in grado di determinare se il frammento amplificato è stato tagliato o meno, ovvero se la sequenza specifica riconosciuta dall'enzima è presente inalterata oppure no. Uno svantaggio di questo tipo di marcatori è dato dalla loro bassa informatività. Infatti gli RFLP presentano solo due alleli possibili: il sito di restrizione può essere intatto oppure no. L'impiego di questi marcatori per eseguire la mappa genetica di patologie è però poco attuabile in quanto troppo spesso delle meiosi chiave in una famiglia risultano non informative. Un'altra categoria di marcatori comprende i minisatelliti VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), detti anche ripetizioni a tandem a numero variabile. Hanno sequenze ripetute lunghe una decina di nucleotidi. Tali marcatori sono multiallelici e presentano un alto grado di eterozigosità. La maggior parte delle meiosi risulta informativa ma i VNTR presentano delle difficoltà relative alla genotipizzazione in quanto vista la loro lunghezza tali marcatori vengono amplificati con difficoltà in una reazione di PCR. Inoltre non sono uniformemente distribuiti lungo tutto il genoma. Un ulteriore tipo di marcatori sono i microsatelliti, detti anche ripetizioni a tandem 1

2 semplici. Sono ripetizioni lunghe da due a quattro nucleotidi. L'impiego di sequenze tri- o tetranucleotidiche sta gradualmente soppiantando l'utilizzo di quelle dinucleotidiche, troppo soggette ad uno slittamento della lettura dell'enzima durante la PCR. Come i precedenti, anche questi marcatori sono multiallelici dal momento che il numero di ripetizioni per ogni allele può variare. Tra i marcatori molecolari più utilizzati vi sono gli SNP. Come suggerisce il nome, i Single Nucleotide Polymorphisms (polimorfismi a singolo nucleotide) sono singole variazioni puntiformi del genoma. Tali polimorfismi includono i classici RFLP, ma anche altre variazioni di sequenza che non creano o sopprimono siti di restrizione. Può sembrare paradossale tornare all'impiego di polimorfismi biallelici dopo avere individuato dei marcatori pluriallelici, ma il grande vantaggio nell'utilizzare degli SNP è dato dall'elevato numero di polimorfismi che possono essere genotipizzati e dalla loro elevata densità lungo tutto il genoma. A giugno del 2004 nell'uomo è stata stimata una frequenza per gli SNP pari ad uno ogni 700pb. Un elevata densità rende possibile individuare uno o più marcatori in ogni gene e nelle sue immediate vicinanze. Per quanto concerne i cambi di base relativi agli SNP, si è osservato che le transizioni, ovvero cambi purina-purina (A vs G) o pirimidina-pirimidina (C vs T), si ritrovano con frequenza maggiore delle trasversioni, ovvero cambi purina-pirimidina e pirimidina-purina. Oltre all'elevato numero di SNP conosciuti, il fatto più importante è che oggi si ha una conoscenza precisa di dove sono situati all'interno del genoma. Il principale impiego di una mappa di SNP umana è dato dalla possibilità di discernere i contributi di diversi geni in patologie multigeniche complesse. Dato che siti di SNP sono presenti in tutto il genoma, confrontando lo schema e le frequenze di tali polimorfismi presenti in pazienti affetti con quelli di soggetti sani di controllo, è possibile identificare quali SNP sono associati a quali malattie. Gli studi relativi all'associazione tra SNP e malattie saranno più fruttuosi quando verranno risolti alcuni problemi ancora esistenti. Primo, sono poco conosciute le distribuzioni degli SNP all'interno di diverse popolazioni. Altro fattore importante è che non tutti gli SNP sono eguali, e sarà essenziale scoprire il più possibile riguardo al loro effetto da analisi computazionali prima di eseguire uno studio relativo al loro coinvolgimento eventuale in una patologia. Per esempio, ogni SNP può essere classificato in base alla sua presenza in una zona codificante o non. A loro volta quelli siti in zone codificanti possono essere divisi in base alla loro capacità di alterare o meno la proteina prodotta dal gene alterato. Alterazioni alla proteina poi possono essere suddivise in base alla loro capacità di modificare la struttura secondaria e terziara della proteina stessa. Gli SNP situati in zone non codificanti possono poi trovarsi in zone regolatrici. Molte patologie complesse possono essere causate da variazioni nella quantità, più che nella qualità del prodotto genico coinvolto. Vi sono numerosi approcci per l'identificazione di SNP, tra questi alcuni vengono anche impiegati per la genotipizzazione. I principali sono basati sul confronto di sequenze relative ad un determinato locus, provenienti da diversi cromosomi. Tra questi, il più semplice consiste nell'eseguire il sequenziamento diretto dei prodotti di PCR di regioni genomiche contenenti il gene di interesse in individui diversi. Su larga scala però tale approccio è molto costoso richiedendo lo studio di primer specifici; inoltre limitato a regioni di cui è nota la sequenza e, quando si presentano doppi picchi, come atteso negli eterozigoti, non è sempre facile discernere tra artefatti dovuti al sequenziamento e polimorfismi reali. Diversi approcci basati sul confronto di sequenze ottenute da frammenti clonati possono essere considerati per ottenere una mappa di SNP in un genoma. In questo caso qualsiasi picco doppio viene considerato artefatto. Il confronto tra dati di sequenze prodotte in diversi progetti di EST, specialmente se le librerie costruite sono state ottenute prelevando campioni da diversi individui, possono essere una buona fonte di SNP. Ad ogni modo il numero di SNP individuabili con questo approccio è limitato dalla pressione selettiva subita dalle sequenze codificanti del genoma. Inoltre, in rari casi, gli SNP individuati in questo modo potrebbero essere in realtà dovuti a modificazioni post-trascrizionali. Un approccio simile può essere applicato per i genomi in fase di sequenziamento completo. In questo caso il confronto tra cloni BAC sovrapponibili è una buona fonte di SNP. Lo svantaggio di tale approccio è dato dal fatto che l'individuazione degli SNP dipende dal numero di cloni BAC sovrapponibili presenti nella genoteca e provenienti da cromosomi diversi. Recentemente un nuovo approccio chiamato Reduced Representation Shot-gun (RRS) viene utilizzato per ottenere un elevato numero di SNP nell'uomo. In questo metodo, il DNA proveniente da diversi individui è mescolato e vengono prodotte delle librerie plasmidiche composte da sottoinsiemi di frammenti di restrizione purificati tramite elettroforesi su gel. Viene quindi realizzato un sequenziamento di tipo shotgun su tali librerie e le sequenze che risultano sovrapponibili vengono allineate andando ad evidenziare i polimorfismi. Quest'ultima fase ha beneficiato grandemente dello sviluppo di programmi come PHRED atti a stimare la qualità con cui viene definita una base ed altri programmi come POLYPHRED o POLYBAYES che impiegano questo indice di qualità per il rilevamento di polimorfismi. Il termine Microarray, definito anche biochips" (comunemente conosciuto come gene chip, DNA chip, o biochip) è un insieme di piccoli elementi, detti anche spots, sistemati su file orizzontali e colonne verticali; il termine è composto da " micro ", che in greco significa " piccolo " e dal francese " arayer ", che significa " sistemare, ed è sostanzialmente costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida come vetro, plastica, o chip di silicio formanti quindi un array. Come definito da Schena ed altri (Scienze 270, , 1995), un DNA microarray è "un allineamento ordinato degli acidi nucleici, di piccole molecole, che permette l'analisi parallela dei campioni biochimici complessi". Con il completamento del progetto genoma siamo entrati in possesso di un prezioso e ricco dizionario, con molti vocaboli ma pochissime definizioni. L obiettivo della postgenomica è stato quello di trovare le definizioni mancanti, utilizzare le informazioni di genomica strutturale per spiegare e analizzare i processi biologici su scala genomica, e assegnare la corretta funzione ai diversi geni. Gli array vengono utilizzati per esaminare il profilo d espressione di un gene o per identificare la presenza di un gene o di una breve sequenza in miscela di migliaia (spesso anche tutto il patrimonio genetico di un individuo umano o non). Un microarray è rappresentato da elementi microscopici su una superficie piana su cui è possibile immobilizzare sia acidi nucleici che proteine capaci quindi di riconoscere e legarsi con 2

3 molecole complementari. La tecnologia permette di realizzare, pertanto, sia reazioni di ibridazione, quando si tratti di acidi nucleici, o reazioni immunitarie, quando si tratti di antigeni o anticorpi. Un microarray può essere considerato un potente mezzo diagnostico se presenta quattro caratteristiche standard ossia essere ordinato, microscopico, planare e specifico. Ordinato, significa che gli elementi analitici, detti anche molecole probe o chip o spot, devono essere disposti in modo ordinato e preciso lungo file orizzontali diritte ed incolonnati anche su file verticali perfettamente perpendicolari. I vari elementi devono essere, ovviamente, di grandezza uniforme e separati da spazi uniformi. E' assolutamente necessario che tali elementi siano disposti in maniera ordinata, sia su linnee orizzontali che verticali, perché questo ne facilita la produzione in automazione e, quindi a costi contenuti, ma, ancora più importante, ne facilita e accelera l'esame e l'interpretazione dei risultati. Ogni elemento deve essere uniforme per non rendere ambigua la lettura. Non è ammissibile la se pur minima sbavatura che rischierebbe di contaminare la lettura dell'elemento vicino. Elementi di forma diversa o di diversa densità, anche se contenenti lo stesso numero di molecole, darebbero luogo ad un segnale di diversa intensità, compromettendo la precisione del risultato. Inoltre, ovviamente ogni elemento deve avere una collocazione ben precisa, in base alle sequenze desiderate, di modo che, automaticamente, si sappia che il dato che la macchina legge corrisponda ad un unico e ben preciso probe o spot. La necessità d'assegnare una funzione a ciascuna delle migliaia di geni identificati grazie alla genomica ha reso indispensabile tecniche che permettano l'analisi simultanea di moltissimi campioni. I macro- e micro-array rispondono a questa esigenza. Le due tecnologie, identiche nel principio, differiscono nel numero di geni simultaneamente analizzabili (da qualche centinaia a qualche migliaia per i macro-array; da diverse migliaia a interi genomi per i micro-array) e nel tipo di supporto utilizzato (classiche membrane di nitrocellulosa o nylon per i macro-array; supporti o "chip" in vetro o altro materiale inerte per i micro-array). Corti frammenti di acidi nucleici ("oligonucleotidi" della lunghezza compresa fra poche decine e qualche centinaia di paia di basi) corrispondenti ad un particolare tratto della sequenza dei geni presenti in un particolare tipo di cellula vengono immobilizzati in maniera ordinata e sistematica in punti precisi (o "spot") del supporto prescelto. Il numero di geni rappresentati è quindi funzione della densità degli "spot" genici sul supporto come riportato nella immagine. La tecnologia dei microarray rappresenta un nuovo potente strumento di ricerca. Il suo sviluppo è stato possibile solo grazie all integrazione di diverse discipline, quali la biologia molecolare, la genetica, le più moderne nanotecnologie, la chimica degli acidi nucleici, i nuovi software, la robotica e l automazione. Esistono infiniti campi di applicazione per questa nuova tecnologia che spaziano dall analisi dell espressione genica, DNA ed RNA microarray, all analisi delle differenti proteine presenti in differenti tipi di campioni, protein microarray, fino ad arrivare alle applicazioni citologiche ed immunoistochimiche dei Tissue microarray. Classificandoli in base alla metodologia costruttiva, esistono tre tipi principali di microarray: microarray di cloni di DNA: microarray per uso specifico composti di oligonucleotidi oppure di cdna (ovvero DNA complementare a singola catena ottenuto per clonazione da un campione di mrna precedentemente isolato); microarray di oligonucleotidi prefabbricati: il posizionamento degli oligonucleotidi è fatto sfruttando l attrazione elettrostatica esercitata su di loro da parte di microelettrodi; microarray di oligonucleotidi sintetizzati in situ: microarray ad alta densità contenenti oligonucleotidi sintetizzati usando tecniche fotolitografiche o di tipo ink-jet. I microarray di cloni sono i più usati e possono analizzare RNA proveniente da due diversi campioni su un singolo chip; le limitazioni derivano dalla disponibilità di cloni e dalla qualità dei campioni di mrna. Le altre due classi sono anche note come array microindirizzabili e permettono l analisi dell espressione di un gran numero di geni contemporaneamente ma possono analizzare un solo campione per chip, con costi considerevoli. È possibile classificare i microarray, in base all uso che ne viene fatto, in tre categorie: 1. cdna microarray: per permettere l analisi su larga scala di un gran quantitativo di mrna come un indicatore dell espressione genetica; 2. microarray SNP ( Single Nucleotide Polymorphism ) e array di mutazione: per rilevare polimorfismi o mutazioni in una popolazione usando array SNP o array progettati per rilevare mutazioni conosciute. 3. microarray CHG ( Comparative Hybridization Genomic ): per osservare perdite o guadagni genomici, o un cambiamento nel numero di copie di un gene particolare coinvolto in una malattia. Per quanto riguarda il campo della genomica funzionale i DNA microarray consentono il monitoraggio simultaneo dell espressione di migliaia di geni, fornendo un preziosissimo ed innovativo strumento ai ricercatori. Prima di analizzare in dettaglio è opportuno 3

4 ritornare al lavoro di Schena e Davis che nel 1999 hanno tracciato una serie di 12 regole che devono sempre essere tenute presenti, quando si opera con i microarray per ottenere risultati corretti ed apprezzabili. Le riportiamo in sintesi: 1. Le analisi dei geni devono essere sempre eseguite in parallelo. La valutazione dell'attività dei geni non può essere mai fatta correttamente su supporti solidi ma non paralleli quali il nylon o la nitrocellulosa, che non hanno una superficie piana. Occorre poter operare su una superficie perfettamente piana come quella del vetro o di altro materiale che abbia le stesse caratteristiche. Infatti solo su una superficie perfettamente piana si possono allineare gli spots senza che si creino inaccettabili convergenze che renderebbero impossibile la lettura in automazione o comunque altererebbero i risultati. 2. Le tecnologie di preparazione devono sempre rendere possibile la miniaturizzazione e l'automazione. Tutti i metodi di produzione dei microarray, compresa la fotolitografia o le procedure a getto d'inchiostro, devono tendere a realizzare un prodotto che, comunque, rientri in questi canoni, affinché possa soddisfare la clientela. 3. Ciascun ciclo di analisi dei geni ha cinque fasi evolutive. Come i cicli della vita si ripetono in un divenire sempre identico per cui si ha prima la nascita, poi lo sviluppo, la crescita per finire con la morte, cosi, per l'analisi dei geni si deve procedere attraverso cinque tappe: impostare il quesito biologico, preparare il campione, eseguire la reazione biochimica, raccogliere i risultati, analizzarli per arrivare alla risposta finale. 4. La manipolazione del sistema biologico deve aderire esattamente al quesito biologico. Qualsiasi problema si affronti, sia che riguardi batteri, lieviti, organismi geneticamente modificati, piante, animali bisogna sempre stare molto attenti alle influenze dell'ambiente, alla temperatura, ai trattamenti che si fanno e quindi a tutte le tecnologie che si applicano per evitare che si creino artefatti. Per esempio quando si lavora con le piante bisogna tener presente non solo che la temperatura sia quella giusta, ma anche l'influenza dell'intensità luminosa e la concentrazione del CO 2. Con qualsiasi tipo di cellula in coltura, il terreno di crescita, il volume o il tipo di recipiente, l'agitazione e tanti altri fattori possono influenzare l'espressione genica in modo anomalo compromettendo così il risultato finale dell'esperimento. 5. Il campione biochimico deve riflettere esattamente l'esemplare biologico. Bisogna fare in modo che l'isolamento, la purificazione l'amplificazione, la marcatura e qualsiasi altro metodo o tecnologia si applichi non alterino il campione che si desidera analizzare. Tener presente che, specialmente le molecole di RNA, sono suscettibili a rapidi cambiamenti fino alla totale denaturazione da parte di ribonucleasi frequentemente presenti in alcuni ambienti. Anche la marcatura è una fase che può creare problemi se non si sceglie un tipo di tecnica che sicuramente poi dia la esatta misura del campione. 6. Una presentazione parallela deve sempre essere associata a campioni precisi e correttamente dosati. Quindi non solo i probes vanno disposti in piano e su linee parallele per rendere possibile la corretta misurazione dei targets, ma anche essere omogenei e correttamente legati al substrato, altrimenti non vanno usati. 7. Il sistema di lettura deve poter acquisire dati precisi dal posizionamento dei campioni in parallelo. Sia che si tratti di scanners che di imagers la lettura degli spots divenuti fluorescenti si deve poter svolgere in maniera corretta. Quindi bisogna scegliere apparecchi con una buona sorgente luminosa, un 'ottica senza difetti e così per tutti i componenti del sistema di lettura che deve essere in grado di ridurre al minimo sia il rumore di fondo che tutte le eventuali interferenze che possano alterare in qualche modo il segnale. 8. I dati che provengono dal sistema di lettura devono essere manipolati ed elaborati con precise modalità. Occorre poter operare con un potente apparecchio di bioinformatica, completato da un ottimo software, per arrivare a risultati che siano lo specchio del campione biologico sotto esame. Devono essere apparecchi in grado di fornire non solo una serie di numeri corrispondenti all'intensità della fluorescenza dei singoli spots ma anche un'immagine grafica dell'insieme. Solo così si riesce ad avere un quadro completo dell'identità dei targets e delle sequenze depositate ed interpretare correttamente il valore anche di segnali molto deboli. 9. La comparazione dei risultati di due o più esperimenti deve essere sempre soggetta alle limitazioni del caso. Almeno fino a quando non si potrà disporre di standard di riferimento, certamente i dati di analisi genica che si riescono a raccogliere sul singolo vetrino sono certamente più attendibili. I dati ottenibili su vetrini di diversa fabbricazione o l'uso di colori fluorescenti diversi o tecniche diverse possono dare risultati che talvolta non sono facilmente comparabili. 10. Le conclusioni concernenti le relazioni fra i geni (spesso si tratta di grandi numeri) possono essere tratte solo se in un singolo esperimento si prendono in esame tutte le variabili e si arrivi ad una elaborazione statistica adeguata dei risultati. Questo significa che conclusioni riguardanti un determinato processo e concernenti un certo organismo o sistema possono essere significative solo se, nello stesso esperimento, o meglio con un unico vetrino, si prendono in esame contemporaneamente tutti i geni di quel genoma che concernono quel processo. Quindi anche un microarray con geni, pur fornendo un enorme quantità di dati, può risultare insufficiente se si vuole approfondire un sistema alla cui attuazione concorrono circa geni. 11. L'impostazione analitica deve sempre comprendere tutti gli elementi e le variabili intrinseche ed estrinseche del sistema. Le analisi eseguite con i microarray non devono mai restare in un contesto interpretativo isolato, ma vanno sempre inquadrate in una visione globale del sistema che deve comprendere anche i dati molecolari, biochimici, chimici, fisici, enzimatici nonché le proprietà strutturali sia del gene che i suoi prodotti. Quindi per ogni organismo che interessi, le valutazioni con i microarray possono essere valutate meglio in un contesto globale di altre informazioni che comprendano anche i rapporti gene-gene e proteine-proteine derivate. 4

5 12. L'analisi parallela di un organismo si può considerare completa solo quando in un contesto quadridimensionale sono assemblate tutte le variabili del sistema. Un quadro completo dell'espressione genica di un determinato organismo, si può dire di averlo solo se si conoscono tutte le variabili di ogni gene, in ogni cellula, in ogni fase della vita. Questo significa che l'attività genica cambia continuamente e quindi va sempre studiata come un film in movimento. Applicazioni della tecnologia microarray La tecnologia dei DNA microarray è ancora agli esordi, e sta tutt oggi crescendo. Le applicazioni di tale tecnologia sono comunque molteplici, dallo studio dei geni coinvolti nell insorgenza del cancro e di numerose patologie, alla caratterizzazione di pattern metabolici. Gli array sono un importante strumento anche per l identificazione e la caratterizzazione di nuovi geni. I DNA chips sono stati utilizzati nella diagnosi e nella prognosi delle malattie e nel design di nuovi farmaci [21, 22]. Le applicazioni in campo umano sono innumerevoli soprattutto grazie al fatto che l intero genoma è stato sequenziato. Una grande limitazione di questa tecnologia, oltre al costo ancora troppo elevato, è infatti la necessità di disporre di sequenze geniche conosciute. Questo pone un enorme freno all utilizzo e all applicazione di tali tecnologie in campo veterinario ed alimentare. Infatti il genoma degli animali di interesse zootecnico è ancora per lo più sconosciuto. Campi di utilizzo dei DNA microarray nella ricerca di base e applicata [19]. RICERCA APPLICATA FUNZIONE DEI GENI pathway metabolici analisi di mutazioni DIAGNOSI DI PATOLOGIE prognosi e diagnosi classificazione dellle patologie strategie di trattamento RICERCA DI NUOVI FARMACI identificazione e validazione del target ottimizzazione dell'efficacia meccanismo d'azione CARATTERIZZAZIONE DI SISTEMI COMPLESSI organi e patologie specifiche risposta allo stress invecchiamento VALUTAZIONE DELLA TOSSICITA' tossici e farmaci cibo ambiente A differenza degli array oligonucleotidici ad alta densità, il basso costo e l alta flessibilità degli gli array a cdna rendono tale tecnologia molto più adatta alle istituzioni accademiche e alle applicazioni pratiche della tecnologia. È infatti possibile produrre array home made contenenti un limitato numero di geni di interesse al fine di effettuare studi molto mirati ed approfonditi, eliminando anche tutti gli irrisolti problemi di gestione dei dati degli array ad alta densità. Conclusione: Le analisi con i microarray impiegano una miriade di tecnologie e metodi diversi ma sempre bisogna capire bene di che cosa si tratti (What), del perché (Why) e come (How) l'obiettivo possa essere raggiunto nel modo migliore. Storia dei DNA microarray La prima intuizione di tale nuovo metodo di analisi si deve a Mark Schena dell Università di Stanford, che ne ha fatto cenno ad Amsterdam nel 1994 nel corso del quarto Congresso Internazionale di Biologia Molecolare delle Piante, ma la prima pubblicazione riguardante questa nuova tecnica è dell'anno seguente (Schena et al. 1995). Presso l'università di Stanford, che ha una lunga tradizione negli studi sugli acidi nucleici, e presso i contigui Laboratori dell Università di Davis, sono state infatti affrontate le prime problematiche su come fissare sui vetrini microscopiche linee di sequenze di geni delle piante e su come studiarne l'espressione utilizzando campioni di mrna isolati dalle cellule e coniugati ad un enzima per poter evidenziare poi l'avvenuta reazione con la comparsa di fluorescenza di intensità variabile e quindi misurabile. Quindi i microarray, come i microprocessori, sono nati nella Silicon Valley. Parallelismo, miniaturizzazione ed automazione sono tre aspetti che mettono in luce una certa similarità fra le due tecnologie. In realtà possiamo iniziare la storia dei microarray con il primo semplice esempio di array, denominato dot blot per arrivare allo sviluppo dei microarray ad alta densità [1]. L'origine di tale nuova tecnologia va fatta risalire agli esperimenti di Southern che, nel 1975, dimostrò come fosse possibile fissare il DNA ad un supporto solido ed attrarre, in modo specifico, una catena complementare sempre di DNA. Tale processo, poi largamente utilizzato per scopi diagnostici, è noto come Southern blotting". Le tecniche standard di laboratorio per il rilevamento di specifiche sequenze nucleotidiche utilizzano una sonda (probe) di DNA, costituita da un piccolo frammento di acido nucleico marcato con un isotopo radioattivo o una sostanza fluorescente. La sonda, rappresentante la sequenza complementare a quella del gene da individuare, viene posta in contatto con un supporto solido (ad esempio, un gel od un filtro poroso) sulla cui superficie sono ancorati acidi nucleici provenienti da un dato genoma. Grazie alla peculiarità degli acidi nucleici di riconoscere le sequenze ad essi complementari, la sonda può legarsi in maniera selettiva al frammento ancorato ad essa complementare così che, semplicemente misurando la presenza e la quantità di marcatore legato al supporto solido, è possibile quantificare se e quanto è stato espresso un determinato gene (Southern et al, 1975). 5

6 I principi fondamentali dei test di ligazione miniaturizzati di spot paralleli erano già stati descritti da più di un decennio. Roger Ekins e colleghi avevano descritto le ragioni per cui i saggi effettuati utilizzando i microspot erano più sensibili di qualsiasi altro test di ligazione [2-4]. Inizialmente l elevata sensibilità e l enorme potenziale delle tecnologie basate sui microspot sono stati dimostrati utilizzando sistemi miniaturizzati per i test immunologici. Tuttavia l interesse della tecnologia degli spot si è presto concentrata sulla creazione dei DNA chips. La possibilità di eseguire centinaia di reazioni di ligazione in parallelo in un unico esperimento corrisponde, infatti, alla necessità nella ricerca biologica di un approccio a livello genomico più ampio. Il sogno della sequenza completa del DNA umano (o genoma) nacque praticamente il giorno seguente al quale Sanger scoprì come leggere il DNA. Fu poi Fodor, che nel 1991, fabbricò i primi microarray, combinando il metodo fotolitografico, usato per i semiconduttori, per realizzarne i primi fissando degli oligonucleotidi su superfici di vetro. Avendo intuito l'importanza commerciale che tale tecnologia avrebbe potuto avere, fondò l'affymetrix che ha avuto il merito di mettere sul mercato i GeneChip, che sono stati i primi vetrini con DNA utilizzabili per tests genetici. Nel 2002 questo sogno divenne parzialmente realtà. Il genoma umano fu dichiarato completamente letto fra squilli di tromba e grandi clamori. Più in piccolo, sotto i titoli, si leggeva che, in fin dei conti, ci si era limitati a leggere il 98% della sequenza eucromatinica, ma tanto bastava. Tutte le regioni del DNA altamente ripetitive, quali per esempio i telomeri (le code dei cromosomi) e i contromeri (il nodo centrale dei cromosomi), non erano assolutamente stati letti. Ciò era dovuto a difficoltà tecniche, queste regioni sono infatti composte essenzialmente da un infinità di ripetizioni di una piccola sequenza di DNA e contengono pochissimi geni. Spesa totale, circa due miliardi di euro. Molto a prima vista ma, in fin dei conti, con quei soldi oggigiorno ci si comprano un paio di aerei da caccia militari ultimo modello, o un decimo di traforo alpino per i treni ad alta velocità. Soldi ben spesi dopo tutto. Non si sa se gabbati dalle loro stesse parole o semplicemente naif, i ricercatori erano attesi al varco da una brutta sorpresa. Leggere il DNA significa ottenere la sequenza, non riuscire a capirci qualcosa. Ciò che portò un professore dell onorevolissimo MIT a commentare abbiamo speso due miliardi per un libro che non sappiamo leggere. Si fece quindi un serio sforzo per cercare di interpretare quell immensa massa di dati (quasi 3,2 miliardi di lettere) che era stata generata dal sequenziamento del genoma umano. Oggigiorno questo sforzo è ben lungi dall essere terminato ma importantissimi passi avanti furono celermente compiuti. Alla fine del 2002 si conosceva in effetti la sequenza di qualche gene. Un analisi di tutte queste sequenze permise allora di identificare quelli che potevano essere considerati come i caratteri comuni a tutti, o almeno molti, geni. Identificati questi caratteri, furono creati dei programmi informatici (chiamati ab initio) capaci di passare in rassegna l intero DNA alla ricerca di altri geni. Iniziò allora il valzer delle cifre. Il genoma umano contiene le ultime stime dicono meno di geni. Si era cominciato con più di molti altri geni furono in seguito identificati grazie al sequenziamento di RNA. Infine, quando altri genomi furono sequenziati, un confronto fra questi e quello umano permise l identificazione di numerose regioni del DNA che erano rimaste invariate nonostante il lungo tempo evolutivo che le separava. Molte di queste regioni corrispondevano a geni. Una prima breccia nella comprensione del DNA era stata aperta. Badate bene, si era unicamente riusciti ad identificare i geni. La funzione di questi ultimi restava (e in parte resta ancora oggigiorno) ancora un mistero. Une seconda breccia sarebbe potuta essere aperta se l espressione temporale e spaziale dei geni fosse stata conosciuta. Per esempio un gene che si esprime a livello del cervello embrionale, probabilmente avrà un ruolo nella formazione di quest organo durante lo sviluppo precoce. Fu allora che qualcuno ebbe un idea geniale. Un gene, per essere utilizzato dalla cellula, deve essere fotocopiato in RNA, il quale sarà in seguito tradotto in proteine. Questa tecnica permette di misurare unicamente l espressione di un gene alla volta, senza garantire per altro una quantificazione precisa dell espressione del gene studiato (analisi unicamente qualitativa). Riuscire a misurare la quantità di RNA significava riuscire a quantificare l utilizzo di un dato gene. Una tale tecnica già esisteva con il nome di Northern Blot. Questa tecnica applicata per la prima volta da Ed Southern nel 1975, ha aperto di fatto la strada alla possibilità di analizzare i profili di espressione genica di un intero organismo. Tuttavia, l applicazione su larga scala di questa metodologia si è avuta solo di recente grazie all utilizzo di supporti solidi non porosi, come il vetro, e alla messa a punto di tecniche fotolitografiche per la sintesi di frammenti oligonucleotidici ad alta densità spaziale. In particolare, i protocolli sviluppati dal gruppo di Pat Brown a Stanford, hanno permesso di ancorare automaticamente migliaia di catene di cdna su vetrini da microscopio e, grazie alla loro ibridazione con campioni di mrna marcati selettivamente con molecole fluorescenti, di studiare il profilo di espressione di colture cellulari in stati fisiologici diversi (Brown e Botstein, 1999). Parallelamente, sono state messe a punto tecniche di mascheramento fotolitografico, normalmente utilizzate nell industria dei semiconduttori, per la produzione di microarray capaci di sonde oligonucleotidiche su una superficie di un pollice quadrato (Lipshutz et al, 1999). 6

7 L idea geniale fu di cercare misurare in un sol colpo l espressione di tutti i geni conosciuti. Si sapeva da mezzo secolo che il DNA è una doppia elica. Le due eliche, se separate si riassociano spontaneamente riformando sempre le coppie A-T, G-C. Le due eliche, se separate anche molte volte, si riassociano sempre nella stessa posizione. Quest associazione necessità la presenza delle coppie sopracitate (A-T. G-C) e, nelle giuste condizioni di temperatura, avverrà solo se le due sequenze sono perfettamente complementari. Una corta sequenza di DNA, può dunque essere utilizzata come sonda capace di cercare sequenze a lei complementari. Sebbene non si riuscisse a sintetizzare lunghe catene di DNA senza una matrice (una copia già fatta) era possibile sintetizzare brevi sequenze unicamente per via chimica. L idea fu dunque questa. Sintetizzare migliaia di copie di un frammento di un gene su uno spazio piccolissimo, poi immediatamente a fianco di queste sintetizzare migliaia di copie di un altro gene, fino a produrre un fascio di sonde per ogni gene dell organismo. Se la sequenza è abbastanza lunga (20-25 lettere) la probabilità che un altro frammento di DNA sia identico è abbastanza bassa. Ad esempio se utilizzassi nel mezzo del cammin di nostra (25 lettere spazi esclusi) ognuno di voi saprebbe di che opera letteraria stiamo parlando, senza necessariamente doverla citare per intero. Tornando all RNA simili sonde furono sintetizzate in griglie finissime. In ogni quadratino della griglia fu inserita una diversa sonda capace di catturare tutti i frammenti di DNA corrispondenti a un dato gene. L insieme della griglia (contenente circa posizioni) è quindi capace di leggere, in un sol colpo, l intera espressione genica delle cellule studiate. Come detto l espressione dei geni necessita la trascrizione dei geni in RNA. Avrete magari notato che, quando si parlava delle proprietà di riassociazione delle due eliche, si faceva riferimento al DNA. Perché il sistema sopra proposto funzioni, vi è dunque la necessità di trasformare tutto l RNA di una cellula in DNA. Come al solito la biologia, quando messa alle strette, si permise un piccolo furto. Esisteva in effetti una proteina virale in grado di copiare l RNA in DNA. Siccome normalmente accade il contrario (il DNA è fotocopiato in RNA) si battezzò questo meccanismo retrocopia. I virus che possiedono questa proteina sono detti retrovirus, il cui rappresentante più celebre è senz altro il virus dell HIV. Riassumiamo quindi la situazione: il sequenziamento del DNA umano aveva messo a disposizioni immense quantità di dati non interpretabili. Le sequenze geniche furono trovate grazie a programmi informatici (lavoro ancora in corso). Misurare l espressione di tutti i geni poneva però un serio problema. - I geni sono molti. Problema risolto grazie alla griglia finissima. Le sonde capaci di leggere oltre geni possono ora raccolte in un centimetro quadrato. - L RNA pone dei problemi di manipolazione sperimentale. Problema aggirato grazie alla retrocopia dell RNA in DNA. Restava da aggirare il problema della quantificazione dell RNA retrocopiato. Ci si risolse a marcare con dei prodotti fluorescenti il DNA retrocopiato. Ecco dunque la procedura sperimentale. Produrre il microarray (il vetrino contenente le sonde). Allo stesso tempo estrarre l RNA dalle cellule studiate (ad esempio le cellule muscolari). Retrocopiare l RNA estratto in DNA, approfittare del passaggio per marcare il DNA così prodotto con dei prodotti fluorescenti. Porre l estratto di RNA retrocopiato sul microarray e portare il tutto alle giuste condizioni di temperatura. Ogni RNA si assocerà quindi alla sua sonda (e se tutto va bene solo alla sua sonda). Misurare la fluorescenza in ogni quadratino della griglia. La quantità di fluorescenza è proporzionale al numero di RNA che si sono associati alle sonde. Confrontare i dati così prodotti con quelli di altri esperimenti per determinare i geni specifici di ogni tessuto. Si noti che la quantificazione della fluorescenza è estremamente precisa, un valore numerico può quindi essere associato ad ogni quantità di fluorescenza (misura quantitativa). Abbiamo detto che la totalità dell informazione genetica è chiamata genoma. Per analogia, la totalità dell informazione della trascrizione dei geni (RNA in un dato momento, in un dato tessuto) fu chiamata trascrittoma. Questa è dunque la definizione finale di microarray: Una tecnica capace di misurare in un sol colpo l intero trascrittoma. Non sempre le migliori idee le hanno le università, non fu il caso dei microarray. Fu un industria privata, Affymetrix, ad avere per prima l idea e, logicamente, a ricoprirla di brevetti. La piccola cronaca poi ci rivela che una sbadataggine aziendale fece in modo che i brevetti sui microarray non fossero mai depositati in Islanda, paese in cui nacque Nimblegen, unica ditta oggi in grado di portare un po di concorrenza sul mercato. I microarray trovarono immediatamente numerosissime applicazioni. Oggigiorno sono utilizzati non solo per lo studio dell espressione dei geni nei differenti tessuti ma anche per analizzare la risposta a diversi tipi di stress o la malignità di un tumore (il sistema che permette la migliore valutazione della probabilità di metastasi). Una seconda serie di applicazioni derivò da una peculiarità della tecnologia. Come detto la sonda (nelle buone condizioni) è capace di associarsi alla sequenza complementare solo se la complementarietà è perfetta. Ora esistono numerose differenze genetiche fra 7

8 individui (gemelli esclusi) è quindi verosimile che alcune lettere del DNA (nucleotidi) siano differenti fra due individui. In questo caso nessuna fluorescenza dovrebbe essere osservabile nel quadratino della griglia portante le sonde per un dato gene, anche se questo gene è trascritto (a causa della mutazione). Visto che questi cambiamenti affliggono generalmente solo una lettera (nucleotide) vengono detti Sigle Nucleotide Polymorphsm o SNP. L idea fu la seguente: fabbricare per ogni posizione del DNA quattro sonde identiche in tutto, tranne che per la posizione studiata in cui rispettivamente si inseriscono le quattro lettere del DNA (A, T, G, C). Questo procedimento viene ripetuto per ogni posizione del DNA (3,2 miliardi in totale!). Se questa volta, al posto dell RNA, associamo alle sonde del DNA precedentemente frammentato e marcato con i colori fluorescenti, ci aspetteremo di osservare per ogni gruppo di quattro sonde un segnale fluorescente proveniente da una o al massimo due sonde. Se l intero procedimento viene fatto sull intero genoma è possibile risequenziare l intero DNA di un individuo semplicemente leggendo quale sonda (per gruppi di quattro) offre il miglior segnale. Il sistema non è ovviamente perfetto. Gli SNP microarray (single nucleotide polymorphisms SNPs) sono particolari DNA microarray che sono usati per identificare i così detti tratti ipervariabili, ovvero quelle sequenze che variano da individuo ad individuo nell ambito della stessa specie o in sotto popolazioni isolate geograficamente o socialmente Arrays di oligonucleotide corti sono usati per identificare il polimorfismo di un singolo oligo nucleotide, che si pensano responsabili della variazione genetica e della suscettibilità individuale a manifestare determinate malattie. Se per esempio una regione è estremamente variabile non si osserverà alcun segnale per nessuna della quattro sonde (perché altri SNP sono troppo vicini). Inoltre il metodo non è perfetto, una cospicua percentuale della SNP non è visibile con questo approccio. Infine il DNA si è rivelato più plastico del previsto con larghe regioni del genoma che possono essere duplicate o perse. Queste variazioni del DNA di larga scala non sono ovviamente visibili con questo tipo di microarray (altri microarray sono per altro stati prodotti per mettere in evidenza queste variazioni). Anno Evento 1987 Assegnato brevetto su sequenziamento tramite ibridizzazione (SBH) R.Drmanac, Università di Belgrado Argonne National Laboratory HySeq Diversi gruppi pubblicano reports sull SBH E.Southern, Oxford University (Oxford Gene Technolgy) A.Mirzabekov, Engelhard Institute, Mosca Argonne National Laboratory S.Fodor, Affymetrix W.Bains, Bath University 1989 Assegnato brevetto europeo a Southern Oligonucleotidi arrays as a testing platform 1993 Assegnato brevetto negli US sull SHB alla HySeq HySeq accusa Affimetrix per una violazione del brevetto non stiamo sequenziando, ma cercando mutazioni 1998 Procedimenti legali tra Southern e diverse compagnie produttrici di chip. (Affimetrix, HySeq, Hoffman-La Roche, Abbot, etc.) 1998 Brevetto US alla Incyte (Synteni) sulla tecnologia di printing di Microarray con densità superiore a 100 polinucleotidi per centimetro quadrato Affimetrix ed Incute (ed altri) si accusano a vicenda di violazione di brevetti Genoma umano intero su uno microarray La battaglia dei brevetti sui gene chip [5] Attualmente sono disponibili dei microarray per il genoma umano e quello dei principali organismi modello, animali e vegetali. Moltissime tecniche derivate hanno a loro volta visto la luce (whole genome tiling path array, CHIP on Chip, ecc.). L uso di microarray per lo studio del profilo d espressione genetica è stato pubblicato per la prima volta nel 1995 (Science) e il primo genoma eucariotico completato con analisi di microarray fu quello del Saccharomyces cerevisiae nel 1997 (Science). I primi articoli riguardanti la nuova tecnologia denominata DNA-microarray, in grado di consentire il monitoraggio quantitativo dell espressione di centinaia di geni simultaneamente, furono pubblicati a metà degli anni novanta da un team di studiosi di diverse discipline della Stanford University [6]. La biologia molecolare, che fino ad allora aveva adottato un approccio riduzionista, ricomincia ora a considerare ogni singolo gene come parte di un sistema più complesso di espressione, che grazie alla nuova tecnologia può essere valutato nella sua interezza. Il rapido progresso nel sequenziamento dell intero genoma [7, 8], e l aumentata importanza degli studi d espressione, accoppiati alle nuove tecnologie di sintesi in vitro di oligonucleotidi, hanno permesso di generare con elevata efficienza migliaia di sonde oligonucleotidiche. Le nuove tendenze tecnologiche nel campo della microfluidica e delle nanotecnologie, i nuovi sistemi di rilevamento e il perfezionamento nella tecnologia dei computer e nella bioinformatica, sono state rapidamente integrate nella tecnologia dei sistemi basati sulla tecnologia microarray. Tutto questo ha portato negli ultimi anni ad un enorme potenziamento di tutte le tecnologie basate sugli array. L industria elettronica, in cui i microchip in silicio sono stati il soggetto ideale per la miniaturizzazione, ha negli ultimi anni ideato strumenti micro fabbricati che possono realizzare un insieme di funzioni come per esempio preparazione del campione, purificazione, separazioni 8

9 TITOLARI NUMERO DI BREVETTI Università della California 1018 Governo degli Stati Uniti 926 Sanofi Aventis 587 GlaxoSmithKlein 580 Incyte 517 Bayer 426 Chiron 420 Genentech 401 Amgen 396 Human Genome Sciences 388 Wyeth 371 Merck 365 Applera 360 Università del Texas 358 Novartis 347 Johns Hopkins University 331 Pfizer 289 Massachussetts General Hospital 287 Novo Nordisk 257 Harvard University 255 Stanford University 231 Lilly 217 Affymetrix 207 Cornell University 202 Salk Institute 192 Columbia University 186 University del Wisconsin 185 Massachussetts Institute of technology 184 permettono l uso di un minor quantitativo di reagenti e la bassa capacità termica del silicio riduce il tempo necessario per la stabilizzazione delle temperature. Il risultato è che il tempo richiesto per realizzare l amplificazione del campione con la PCR è ridotto da ore a minuti. L inconveniente è che, non essendo possibile pulire lo strumento, esso è monouso. Progetto Lab-on-chip monolitico della STMicroelectronics. La necessità di manipolare fluidi che si muovono in canali stretti (microfluidica) ha aperto nuove aree di ricerca, ha sviluppato nuovi metodi di fabbricazione per i sistemi fluidici, ha portato alla costruzione di complessi sistemi microfluidici e allo studio del moto di fluidi in canali di piccole dimensioni. Inoltre l introduzione di tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di microsistemi chimici e biochimici, ha incrementato esponenzialmente il numero di applicazioni in tale settore. Particolarmente interessante è la tecnologia MEMS (la sigla MEMS sta per Micro Electro-Mechanical Systems) che applica sullo stesso wafer tecniche di lavorazione usate nella fabbricazione di circuiti integrati per costruire strumenti microscopici elettro-meccanici, come per esempio sensori. La tecnologia MEMS permette di applicare la stessa economia dovuta all integrazione su piccola scala della lavorazione dei wafer di silicio alla fabbricazione di strumenti meccanici. Per esempio i sensori prodotti usando le tecnologie convenzionali sono costruiti uno per volta, mentre usando la tecnologia MEMS, lo stesso sensore è realizzato in centinaia o migliaia di copie, con prestazioni costanti e basso costo unitario. Una delle applicazioni della tecnologia MEMS con fluidi in movimento è stata la realizzazione di uno strumento in grado di realizzare la Polymerase Chain Reaction (PCR) ottenendo uno strumento contenente canali in silicio per i reagenti e il campione, elementi riscaldanti per modificare le temperature durante il ciclo di amplificazione e sensori per il controllo della temperatura. Le piccole dimensioni dei canali Inoltre sono in fase di studio progetti monolitici che consentono, oltre all amplificazione, anche il riconoscimento delle sequenze di DNA. Una più recente tecnica, che potrebbe rivelarsi assai promettente, adotta un approccio del tutto diverso per identificare le singole basi che compongono la molecola di DNA. Questa metodica, chiamata sequenziamento mediante nanopori, sfrutta le differenze fisiche esistenti fra le quattro basi che compongono il DNA, per produrre un segnale diverso. Come l elettroforesi, questa tecnica trascina le molecole di DNA verso una carica positiva. Per raggiungerla, le molecole devono attraversare una membrana transitando per un poro con un diametro inferiore a 1,5 nanometri, per cui riescono a passare solo le molecole di DNA a filamento singolo. Quando il filamento transita attraverso il poro, i nucleotidi bloccano temporaneamente il passaggio, alterando la conduttanza elettrica della membrana misurata in picoampere. Le differenze fisiche fra le quattro basi generano blocchi di durata e grado diversi. Questa tecnologia dovrebbe portare ad una notevole riduzione dei costi e a leggere un intero genoma umano in non più di 20 ore. Negli ultimi anni, la tecnologia dei microarray, messa a punto per studiare gli acidi nucleici, si è andata espandendo per analizzare meglio il proteoma delle cellule e le interazioni che avvengono fra le diverse proteine e fra queste e l'ambiente esterno, che sono molto importanti nel determinismo delle malattie e le cui conoscenze certamente faciliteranno la messa a punto di nuovi farmaci. Le proteine sono considerate le più importanti strutture cellulari per il continuo ed intenso lavoro che svolgono sia in stato di benessere che in corso di malattia. Abbiamo visto che, fino a qualche anno fa si credeva che ogni gene codificasse un solo tipo di mrna e quindi, almeno teoricamente, una sola proteina ed attraverso di essa, impartisse istruzioni alle strutture cellulari e quindi al metabolismo. Oggi sappiamo invece che la realtà è molto più complessa perché ogni gene, con le varianti, può codificare fra 3 e 20 proteine. Quindi per capire come i geni funzionano bisogna arrivare alle proteine che essi esprimono e capire anche come le varie 9

10 proteine interagiscono fra di loro. Ne deriva che se è stato molto importante studiare a fondo il genoma è ancora più importante studiare il proteoma, ossia lo sconfinato mondo delle proteine che è molto più complesso, anche perché non statico ma continuamente mutevole in un contesto di reti dinamiche per la continua serie di interazioni che avvengono fra di loro per effetto sia dei processi metabolici sia come risposta agli stimoli ambientali. A differenza del genoma che è costituito da un numero fisso di geni, il livello a cui le proteine cellulari operano è molto dinamico perché le proteine, direttamente sottoposte a tutti gli stimoli dell'ambiente vanno incontro a continue variazioni di adattamento e risposta. Ecco perché è molto difficile determinarne accuratamente l'esatto numero o le quantità presenti nelle cellule viventi. Inoltre le varie famiglie di proteine sono estremamente diverse fra loro sia per le dimensioni delle molecole, sia per la struttura, che per le caratteristiche chimiche e le funzioni. Comunque i microarray con proteine, oltre che in campo terapeutico, possono trovare sempre più ampia applicazione in campo diagnostico specialmente per le malattie infettive di origine virale. Infatti attualmente i metodi più largamente usati per individuare agenti patogeni virali in campioni biologici, sono quelli che si basano sull'immunoenzimatica eseguita in piastrine o su la PCR. Ma i primi hanno una sensibilità che oscilla fra il 70 e 90% ed i secondi hanno un costo elevato che ne limita la diffusione su larga scala specialmente in nazioni del terzo mondo che poi sarebbero quelle che ne avrebbero più necessità. Per la preparazione di microarray dedicati specificamente, le proteine da usare come probe, che qualcuno preferisce chiamare " protein chip " o semplicemente " chip ", possono essere derivate da estratti cellulari oppure sintetizzate mettendo insieme dei peptidi sintetici. Le proteine possono anche essere prodotte in colture di batteri, lieviti, cellule ingegnerizzate di insetti. Tali proteine ricombinanti, sono poi purificate con tecniche diverse e possono diventare un ottimo materiale da immobilizzare sui vetrini come molecole di cattura. I metodi per fissare le proteine sui supporti sono fondamentalmente simili a quelli utilizzati per gli acidi nucleici. Come vedremo, però, produrre microarray con le proteine offre qualche difficoltà in più. Infatti, come primo inconveniente c'è il problema che le proteine sono molto meno stabili degli acidi nucleici perché vanno incontro spesso a processi di ossidazione e di denaturazione. Poi le proteine, quando sono rimosse dal loro ambiente naturale, modificano la loro struttura nativa e quindi anche la forma, talvolta esponendo all'esterno aminoacidi diversi da quelli della forma nativa. Ne deriva che, quando le si va a far reagire, questi aminoacidi esterni, che costituiscono gli epitopi più esposti, possono pregiudicare il risultato della reazione. Sono stati studiati diversi tipi di microarray per le proteine che Dev Kambhampati, nella sua monografia (2004), suddivide così: Array con anticorpi: Sono stati utilizzati sia anticorpi policlonali che monoclonali per titolare proteine specifiche in campioni biologici. Si possono considerare dei test immunologici in miniatura. Array con antigeni: E' l'inverso del precedente, perché in questo caso è fissato un antigene sul supporto per titolare il corrispondente anticorpo presente nel campione biologico. Array funzionali: Proteine purificate sono fissate sul supporto per legare altre proteine o DNA o interagire con altre piccole molecole. Array di cattura: Molecole non proteiche ma capaci di legarsi alle proteine sono ancorate alla fase solida. Esempio il Ciphergen Protein Chip. Array in sospensione: E un caso particolare che utilizza come fase solida delle microparticelle fornite di qualcosa di simile ad un codice a barre. La tecnologia dei DNA microarray Un tipico esperimento che utilizzi i microarray comprende cinque fasi principali: 1-deposizione degli oligonucleotidi sonda sul supporto rigido; 2-preparazione del materiale genetico da analizzare (compresa la marcatura con molecole fluorescenti); 3- ibridazione dei campioni fluorescenti sul microarray; 4. lettura dei valori di fluorescenza, effettuata tramite apposito scanner; 5. analisi statistica ed elaborazione dei dati ricavati dalle immagini prodotte. I microarray rappresentano un sistema di analisi in parallelo, che velocizza considerevolmente l'esplorazione genomica: permettono, infatti, di esaminare contemporaneamente l'espressione di migliaia di geni o un ampio numero di polimorfismi genetici. Un altro vantaggio è dato dai costi relativamente contenuti se rapportati al numero di geni o polimorfismi analizzabili per esperimento. 10

11 I microarray a DNA possono essere definiti come un insieme miniaturizzato e ordinato di frammenti di acidi nucleici derivati da singoli geni e fissati in posizioni prestabilite su un supporto solido, rendendo possibile l analisi simultanea tramite ibridazione specifica di centinaia di geni [9]. In questi esperimenti, la complementarità delle sequenze porta alla ibridizzazione di due molecole di acidi nucleici a singolo filamento, una delle quali è immobilizzata su una matrice solida [10]. La scelta di quali geni debbano essere rappresentati può variare dalla totalità (interi genomi su un unico vetrino) allo specifico (particolari pathway metabolici, etc.). Esistono di fatto due tecnologie per la produzione di microarrays: la prima denominata a spotting e la seconda detta in situ. Nella tecnologia spotting, le sonde da ancorare al supporto solido, normalmente un vetrino da microscopia, sono sintetizzate a parte e quindi depositate sul supporto. Tali sonde possono essere costituite da molecole di cdna lunghe alcune migliaia di paia di basi le cui sequenze possono essere ricavate da banche dati genomiche (GenBank, dbest o UniGene) o da librerie proprietarie costituite da cdna non ancora completamente sequenziato. Nello studio dell espressione di organismi eucarioti, le sequenze delle sonde sono normalmente ricavate dalle cosiddette Express Sequence Tags (EST), ovvero dalle porzioni codificanti identificate dai singoli progetti genoma. Tali banche dati contengono, assieme alle sequenze, anche tutta una serie di informazioni bibliografiche necessarie, oltre che per la scelta delle porzioni di DNA da depositare sulla matrice, anche per la successiva valutazione dei profili di espressione. Nel caso dei lieviti o di organismi procarioti le sonde sono generate per amplificazione diretta, con primers specifici, del DNA genomico. Selezionate le sequenze da studiare, il cdna relativo viene prodotto mediante PCR ottenendo così sonde della dimensione da 600 a 2400 bps. Più recentemente, le sonde che vengono depositate sono rappresentate non tanto da frammenti di materiale genomico ottenuto via PCR, quanto piuttosto da sequenze sintetiche di oligonucleotidi lunghe paia di basi. Una volta prodotte, le sonde vengono depositate sul supporto solido, in genere costituito da un vetrino. La deposizione è effettuata da sistemi robotizzati che mediante l utilizzo di pennini prelevano le sonde direttamente dalle piastre utilizzate per la PCR e le depositano sul vetrino formando spots di circa µm di diametro, distanziati l uno dall altro µm. Durante la deposizione, il sistema di controllo del robot registra automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione ed alla completa identificazione di ciascun punto della matrice (identità del cdna, coordinate sul supporto, ecc.). Una volta sul vetrino, il probe viene legato covalentemente ai gruppi amminici del supporto attraverso una reazione innescata dall irraggiamento con luce ultravioletta, mentre il cdna in eccesso viene rimosso con semplici lavaggi dell array. Infine, il cdna sul supporto viene reso a catena singola attraverso una denaturazione termica o chimica. L altra tecnica utilizzata per la produzione di microarrays è quella detta in situ che, sviluppata da Affimetrix, è frutto dell interazione di due tecnologie particolari, la fotolitografia e la sintesi diretta in fase solida di oligonucleotidi. La sintesi delle sonde avviene direttamente sulla superficie del supporto solido. In particolare, il supporto costituito da un wafer di silicio viene funzionalizzato con piccole sequenze di oligonucleotidi (oligo-starter). Questi oligo hanno la caratteristica di avere il gruppo reattivo protetto da gruppi fotosensibili e quindi, grazie ad una maschera fotolitografica, è possibile indirizzare la luce in specifiche posizioni dell array e liberare i siti necessari per la sintesi della sequenza. Una volta deprotetti selettivamente i siti reattivi, è sufficiente incubare la superficie con desossiribonucleotidi protetti per allungare la catena in fase di sintesi. Ripetendo il ciclo di deprotezione grazie all applicazione di maschere fotolitografiche diverse e di incubazione è quindi possibile aggiungere nucleotidi diversi in posizioni diverse e sintetizzare tutte le sonde necessarie per l analisi di un dato genoma. Sono state sviluppate due differenti tecnologie per effettuare l analisi dell espressione genica [6, 11]: gli array a oligonucleotidi e gli array a cdna. Negli array a cdna, i frammenti di acido nucleico sono spottati con un sistema automatizzato, utilizzando un protocollo messo a punto inizialmente da un team dell Università di Stanford (http://cmgm.stanford.edu/pbrown/mguide/). Il protocollo per produrre questo tipo di microarray è stato inizialmente sviluppato dal Prof. Pat Brown e colleghi dell'università di Stanford. La costruzione di questo tipo di microarray consiste nel depositare determinati cloni di DNA o oligonucleotidi in precise zone della superficie di un vetrino per microscopia secondo una griglia prestabilita. Il cdna utilizzato per lo spot è generalmente derivato da un amplificazione tramite PCR di librerie a cdna. La tecnologia degli oligo-microarray consiste invece nel sintetizzare direttamente i nucleotidi sulla superficie del vetrino [12]. Esistono due differenti tecnologie per la sintesi degli oligonucleotidi, la tecnologia fotolitografica, che consente la sintesi di corti nucleotidi di basi (Affimetrix, [13] e la tecnologia inkjet (Agilent Technologies, che consente la sintesi di oligonucleotidi più lunghi, 60 basi [14]. Entrambe queste tecnologie sono state inizialmente sviluppate per l industria dei computer e in seguito adattate alla fabbricazione dei microarray. Esiste inoltre un terzo tipo di array, costituito dallo spot di oligonucleotidi presintetizzati, solitamente tali frammenti sono più lunghi, circa 70 nucleotidi [15]. La lunghezza ottimale della sonda oligonucleotidica fissata al vetrino è tutt oggi oggetto di dibattito. È importante considerare che all aumentare della lunghezza della sonda aumenta la specificità della reazione, mentre al suo 11

12 diminuire aumenta la sensibilità. È necessario effettuare diverse prove ad ogni esperimento al fine di determinare il giusto equilibrio tra le due variabili. In entrambe le tipologie di array gli acidi nucleici sono disposti ordinatamente utilizzando un sistema automatizzato x-y-z estremamente preciso, in migliaia di spot dal diametro di circa 100 m in un area di pochi centimetri quadrati. Il maggior vantaggio di array così densi, consiste nella richiesta di piccolissimi volumi per l ibridazione e quindi di pochissimo materiale di partenza per l analisi. I primi array contenevano meno di un centinaio di geni [6], ma si è presto passati ad array con migliaia di geni [16, 17]. Oggi Affimetrix è in grado di posizionare su un singolo array un numero di sonde pari o superiore al numero totale di geni presenti nel genoma umano e si propone entro pochi anni di creare array con circa spot (il genoma umano è costituito da circa geni!)[13] Rappresentazione schematica delle due differenti tecnologie. microarray, a cdna e oligonucleotidiche. [Gibson, 2002 #17] Lo studio dell espressione genica tramite microarray è basata sul principio dell ibridazione competitiva di popolazioni di cdna differentemente marcate. Marcatori fluorescenti, solitamente Cy3 e Cy5, sono utilizzati per distinguere pool di DNA retrotrascritti da differenti campioni. Tali sonde sono posate sui microarray e sono quindi sottoposte ad una reazioni di ligazione secondo i protocolli utilizzati per i Southern Blot. I microarray sfruttano una tecnica di ibridazione inversa, consiste cioè nel fissare tutti i probe su un supporto e nel marcare invece l'acido nucleico target. È una tecnica che è stata sviluppata negli anni '90, oggi permette l'analisi dell'espressione genica monitorando in una sola volta gli RNA prodotti da migliaia di geni. Per studiare gli mrna, essi vengono prima estratti dalle cellule, convertiti in cdna, con l uso di un enzima chiamato transcriptasi inversa e allo stesso momento marcati con una sonda fluorescente. Quando si fa avvenire l'ibridazione fra la sonda presente sulla matrice e il cdna target, quest'ultimo rimarrà legato alla sonda e può essere identificato semplicemente rilevando la posizione dove è rimasto legato. Il segmento di DNA legato al supporto solido è noto come probe. Migliaia di probe sono usati contemporaneamente in un array. Questa tecnologia è nata da una tecnica più semplice nota come Southern blotting, dove frammenti di DNA attaccati ad un substrato sono testati da sonde geniche aventi sequenze conosciute. I microarray possono essere fabbricati usando diverse tecnologie, come la stampa di micro solchi, con un particolare microspillo appuntito su una lastrina di vetro dove verrà attaccata covalentemente la sonda (probe) di materiale genetico ottenuta per clonazione sfruttando la tecnica PCR; usando maschere preformate da ditte specializzate come ad esempio da Greiner Bio-One. La sintesi in situ di oligonucleotidi presenta un certo numero di vantaggi rispetto a quella precedentemente vista. I prodotti di questa sintesi hanno caratteristiche di omogeneità e alta qualità su tutte le celle che compongono l array su cui vengono sintetizzati, con varie metodologie, oligonucleotidi diversi. Esistono differenti metodi di posizionamento delle sonde sulla superficie dell array. Il metodo più conosciuto combina tecniche fotolitografiche usate nell industria dei semiconduttori a tecniche di sintesi in fase solida, per ibridare direttamente su un wafer di quarzo le sonde oligonucleotidiche di lunghezza desiderata (di solito 25 nucleotidi). Questo tipo di tecnologia è derivata direttamente dagli studi fatti da Foder che ha usato tecniche di fotolitografia per la sintesi chimica in situ di materiale biochimico direttamente su silicio. La fabbricazione ad esempio del Gene Chip Affimetrix parte da un wafer di quarzo di pochi centimetri quadrati. Poiché il quarzo è un materiale idrossilato naturalmente, esso fornisce un eccellente substrato per l attacco di elementi chimici. Su di esso sono quindi posizionate molecole di collegamento sintetiche (molecole linker ) modificate con gruppi di protezione rimovibili fotochimicamente che serviranno successivamente per posizionare le sonde sull array. La distanza fra queste molecole linker determina la densità di riempimento delle sonde. Con questo metodo è possibile costruire array con più di 500 mila locazioni (o celle) per le sonde contenute in 1.28 cm 2. Ciascuna di queste locazioni contiene milioni di molecole identiche di DNA (diverse per ciascuna locazione). La parte critica di questo processo è il processo di allineamento della maschera con il wafer prima di ciascun passo di sintesi. Per assicurare che questo passo sia accuratamente completato, le tracce di cromo presenti sul wafer e sulla maschera devono essere 12

13 perfettamente allineate. Una volta che le locazioni sono state attivate, una soluzione contenente un singolo tipo di desossinucleotidi è gettata sulla superficie del wafer e i nucleotidi si attaccano ai linker attivati con un accoppiamento chimico, dando inizio al processo di sintesi. Il processo è efficiente anche se talvolta l aggancio non è perfetto. In tal caso le sonde con il nucleotide mancante vengono opportunamente incappucciate per bloccarne la crescita. Nel passo successivo di sintesi, un altra maschera è posizionata sopra il wafer per permettere un ulteriore ciclo di deprotezione e accoppiamento. Il processo è ripetuto fino a che le sonde non raggiungono la lunghezza voluta. Sono stati creati opportuni algoritmi che permettono di minimizzare il numero di maschere utilizzate coordinando la crescita delle sonde nelle diverse locazioni, individuando situazioni in cui più maschere possono essere utilizzate nello stesso tempo. Una volta completata la sintesi, i wafer sono tagliati; in funzione del numero di locazioni delle sonde per array, da un singolo wafer, è possibile produrre tra 49 e 400 array. I risultanti singoli array sono quindi inseriti in apposite cartucce in cui può circolare la matrice biologica da analizzare, opportunamente marcata, si tratta sostanzialmente di un sistema chiuso. Esistono anche strategie non proprietarie che consentono il posizionamento del clone nell'esatta locazione sul vetrino da un robot. Il supporto dell array, che inizialmente era costituito da membrane di nylon o nitrocellulosa, è realizzato quasi esclusivamente con vetrini da microscopio. L utilizzo del vetro presenta i seguenti vantaggi: - i campioni di DNA possono essere legati covalentemente sulla sua superficie opportunamente trattata (con poly-l-lisina); -è un materiale duraturo che sopporta alte temperature; -è un materiale non poroso e quindi il volume di ibridazione può essere minimizzato consentendo un miglior ancoraggio delle sonde e una minore diffusione del DNA depositato; -come conseguenza della sua bassa fluorescenza intrinseca, esso non da contributi significativi al rumore di fondo durante la rivelazione. CHIMICA DELLE SUPERFICI I primi tentativi di fissare biomolecole su membrane di nylon o cellulosa, eseguiti nel trascorso decennio, puntando all'adsorbimento elettrostatico, hanno portato a risultati molto scadenti. Lo stesso è successo utilizzando superfici a base di poliacrilamide. I primi risultati accettabili si sono avuti ricoprendo le superfici con del destrano carbossilmodificato, trattamenti chimici delle superfici più usati per gli acidi nucleici sono a base di organosilani: sono composti che contengono atomi di silicio che si sono dimostrati molto validi per legare molecole organiche a superfici di vetro. Le molecole utilizzate per fissare alle superfici gli acidi nucleici sono state utilizzate con discreto successo anche per le proteine. La qualità delle superfici ha un' importanza enorme nella produzione di microarray che possano essere usati per eseguire delle analisi ed ottenere risultati riproducibili. Infatti le superfici dei vetrini che si adoperano giocano un ruolo importantissimo nel determinare non solo come le molecole probe ci si attaccano ma anche per far si che le reazioni che ci si svolgono, possano evolvere senza problemi o inconvenienti. Riteniamo pertanto utile elencare le qualità essenziali che microarray ideali dovrebbero avere per poter operare bene: Dimensione. L'ampiezza delle superfici operative dipendono ovviamente dalle dimensioni del supporto. Come già abbiamo accennato, ora si preferisce operare su vetrini porta oggetto le cui dimensioni ottimali sono in larghezza, lunghezza e spessore ,94 mm. Tale dimensione standard facilita sia l'automazione della produzione che tutte le fasi operative di utilizzazione che si concludono con la lettura dei risultati. Liscia. La superficie di lettura deve essere omogenea e liscia. Non sono accettabili irregolarità in eccesso o in difetto superiori ai 10 micron. Infatti se la superficie non è omogenea il diametro e la fissazione dei probes o spots non può risultare uniforme né si riesce ad ottener una regolarità delle distanze fra un probe e quelli vicini. Irregolarità della superficie possono creare problemi anche in fase di lettura perché alcuni lettori hanno una profondità focale che non supera i micron Planare. Tutta la superficie di mm deve essere assolutamente in piano. Dislivelli superiori a 10 micron, per le stesse ragioni riferite in precedenza compromettono sia la produzione che la corretta utilizzazione dei microarray. A riguardo bisogna anche curare il confezionamento degli stessi facendo in modo che vengano evitate manovre che possano determinare alterazioni da torsione. Occorre rendersi conto che lo stesso numero di molecole se disposte su un vetrino che non sia perfettamente in piano o non sia liscio producono un segnale di intensità variabile. Uniforme. L'uniformità dipende dalla regolarità sia atomica che molecolare del trattamento utilizzato per rendere la superficie reattiva. Una superficie si può considerare uniforme se le eventuali variazioni di densità dello strato reattivo non risultino superiori o inferiori del 25% Lo strato. reattivo è costituito da un monostrato, di solito di organosilani, che sono molecole che stabiliscono un legame covalente con il supporto che, in genere è vetro. Su questo strato poi va creato un film di acrilamide, polilisina, o nitrocellulosa che sono molecole capaci di legare i singoli elementi analitici. Nel complesso, quindi, l'uniformità della superficie è molto importante per poter avere microarray affidabili perché capaci di generare segnali che non varino d'intensità per ragioni che nulla hanno a che fare con la specificità della reazione. Stabile. La produzione va curata in modo da ottenere prodotti che, nel periodo di validità che, secondo i tipi può essere variabile, decadano meno del 10%. Devono essere prodotti molto stabili, considerando anche che le tecniche di utilizzazione possono essere diversissime e che alcune utilizzano anche temperature elevate. 13

14 Inerte. Premesso che il tipo di vetro che si sceglie deve essere perfettamente trasparente, anche i trattamenti a cui lo si sottopone per poterci fissare poi sopra le molecole dello spot, non devono compromettere tale trasparenza più di un certo livello standard. Inoltre il tutto non deve presentare fluorescenza anomala né avere effetto deviante sulla luce. Efficiente. La capacità di legame, che va misurata empiricamente da caso a caso, deve essere tale da rendere possibile la più bassa concentrazione possibile dei reagenti sia perché sono, di solito, molto cari sia perché così si ottiene la massima efficienza. Per esempio vediamo che, quando si adoperano oligonucleotidi quali molecole spot, la concentrazione ottimale è di 30 µm, e da tale concentrazione non è consigliabile derogare, in eccesso o in difetto, più del 30%. È evidente che questa tecnica richiede apparecchiature robotiche molto sofisticate. Il nucleo dell'apparecchiatura è costituito da una "gruppo scrivente" che preleva uno o più campioni di cdna mediante l'utilizzo di pennini e li trasferisce su vetrini per microscopio, il movimento è ovviamente controllato da un computer. Durante la deposizione il sistema di controllo del robot registra automaticamente tutte le informazioni necessarie alla caratterizzazione ed alla completa identificazione di ciascun punto della matrice. Una volta che la sonda è sul vetrino si effettua il processing, il passaggio cioè in cui la sonda viene legata covalentemente al supporto attraverso una reazione innescata dall'irraggiamento con luce ultravioletta o incubando il vetrino a 80 C per 2 h. Infine il cdna viene reso a singola catena attraverso una denaturazione termica o chimica. Con questa tecnica però era possibile creare solo microarray a bassa densità (ovvero con poche sonde per mm quadrati). I DNA microarray possono essere usati per rivelare RNA che può essere o non essere tradotto in proteine. Questa analisi viene denominata "analisi dell espressione" o profilo d'espressione. Con la tecnologia dei microarray si possono avere decine di migliaia di risultati in pochissimo tempo. Per questo motivo questa tecnologia ha permesso notevoli accelerazioni in diversi campi di investigazione biochimico e biotecnologico. In questo caso gli oligonucleotidi sono sintetizzati in sito, questa tecnica è stata utilizzata per la prima volta dall'affymetrix, che ne detiene il brevetto. La tecnica per la produzione di questi chip è detta fotolitografia, con la quale è possibile sintetizzare molte migliaia di differenti oligonucleotidi sulla superficie di un vetrino. Anche se questa tecnica di sintesi è molto accurata, la massima lunghezza degli oligonucleotidi che è possibile raggiungere è di 25 nucleotidi, ma oligonucleotidi di queste dimensioni non sono sufficienti a dare specificità al microarray, per questo servono almeno 3 oligonucleotidi che legano un gene, e altri 3 oligonucleotidi che presentano un mismatch che serviranno da controllo negativo. Per cui le analisi di un singolo gene richiedono lo studio di sei spot che devono avere come risultato: i tre oligonucleotidi corretti, positivi, mentre i tre oligonucleotidi con il mismatch, negativi. Inoltre ogni volta bisogna fare un chip per il controllo e uno del soggetto da analizzare, perché non si può effettuare un'ibridazione per competizione. Sui microarray a bassa densità solitamente si usavano marcatori radioattivi, questo tipo di marcatori però non permettono una risoluzione sufficientemente elevata per i chip ad alta densità, con i quali è necessario utilizzare marcatori fluorescenti. La distribuzione degli spots è indubbiamente una delle fasi più delicate della produzione dei microarray per cui il controllo di qualità è una fase molto importante del processo. Le varie compagnie commerciali hanno risolto i problemi in vario modo, sfruttando l esperienza accumulata negli ultimi anni. Ma, malgrado l uso di robot, sempre più sofisticati, si ha un coefficiente di variabilità degli spots che oscilla fra lo 0 ed il 22% ed un C.V. medio del 6,8%. Quando si esegue un esperimento con microarray, e più esattamente, quando si utilizzano le macchine che fanno lo spots printing, ovvero si depositano sui vetrini le goccioline o spots dei probes, possono sorgere diversi problemi. Occasionalmente la morfologia degli spots può risultare decisamente alterata nel senso che si verificano delle sbavature perché il gocciolatore o pin è difettoso e lo si può constatare osservandolo al microscopio. Molti ricercatori hanno osservato una alterata morfologia degli spots per disturbi di tensione che si possono verificare sulle superfici dei vetrini specialmente quando si adoperano tamponi a base di fosfati. Se si fa uso di tamponi a base di SSC, tali inconvenienti non si verificano. Altro aspetto della tecnologia che bisogna curare per avere degli spots omogenei, è un adeguato volume di campione presente nei pozzetti in cui il pin va a pescare prima di depositare sui vetrini le goccioline o spots. Un altro inconveniente che, talvolta si può verificare è che il DNA non si fissi bene sul vetrino per cui durante la fase di ibridazione, venga lavato via. Dopo aver eseguito la distribuzione degli spots, un controllo molto semplice lo si può fare alitando sul vetrino in modo da formare sulla superficie un sottile strato di vapore. Gli spots dove il DNA si è legato appaiono più chiari. Altri preferiscono controllare il vetrino sotto il microscopio. Ma un metodo tecnicamente più corretto per valutare il lavoro fatto, che è da molti adottato, è quello di colorare qualche vetrino con un colore fluorescente. Il più usato per tale genere di controllo è il SybrGold della Molecular Probes. Dopo il lavaggio si fa il controllo con uno scanner al laser che permette di valutare sia la morfologia che la quantità di DNA degli spots. Il vantaggio di usare il SybrGold è dato dal fatto che, essendo un colorante non molto invasivo, i vetrini si possono riusare. Cameretta di ibridazione per vetrini di microarray. 14

15 Quando si deve valutare l attività dei geni, si possono, a tal fine, inserire più geni per ogni singolo spot e poi, decodificando l espressione con metodi matematici, capire se il processo di distribuzione è stato realizzato con una variabilità accettabile (Khan et al. 2003). Una volta che il microarray è stato costruito o comprato e il campione di acidi nucleici da analizzare è stato isolato si fa avvenire la reazione di ibridazione, che permette la formazione degli eteroduplex. Per ottenere dei buoni microarray è essenziale difenderli dall'umidità (se l'ambiente è secco la soluzione evapora, se invece è umido si deposita dell'acqua) e dalla polvere (ogni spot è grande circa 50 micron, un granello di polvere e più grande di 50 micron, per cui può coprire vari spot), per questo motivo esistono delle camere apposite per l'ibridazione dei microarray che vengono sigillate. Dopo l'ibridazione il microarray viene lavato per rimuovere il cdna che non si è legato. Generalmente il Dna fluorescente dei campioni sperimentali è mescolato con un Dna di un soggetto di controllo marcato con un colorante fluorescente diverso. Per i microarray si usano solitamente Cy3 (che emette una lunghezza d'onda nel campo del rosso) e Cy5 (che emette nel campo del verde). In questo modo se la quantità di RNA espressa da un gene nelle cellule di interesse è aumentata (up regolata) rispetto a quella del campione di riferimento, lo spot che ne risulta sarà del colore del primo fluorescente. Viceversa se l'espressione del gene è diminuita (down regolata) rispetto al campione di riferimento lo spot sarà colorato dal secondo fluorescente. La fluorescenza è rilevata poi grazie ad uno scanner a laser, grazie al quale si acquisisce un'immagine per ogni fluoroforo. Poi vengono usati dei software appositi per convertire i segnali in una gamma di colori dipendente dalla loro intensità. Il segnale rilevato dallo scanner viene poi sottoposto ad altri algoritmi di filtrazione e di pulizia e convertito in valori numerici. Il principale problema dei microarray e la mancanza di standardizzazione, che causa difficoltà nel confronto di dati; inoltre, se oggi con questa tecnica è possibile analizzare i livelli di espressione di un singolo gene ottenendo degli ottimi risultati, la combinazione dello studio di molte migliaia di geni risulta molto complicato e può portare spesso a dei falsi positivi, questo accade anche a causa del fatto che alcuni cdna possono cross-ibridare altre sonde (che avrebbero dovuto rilevare altri geni). Un altro problema è presentato dai fluorofori, che nonostante siano molto simili fra loro presentano delle differenze problematiche. Esiste una diversa efficienza di fluorescenza tra Cy3 e Cy5 che deve essere standardizzata dai software di rilevazione, inoltre poiché Cy3 è più piccolo di Cy5, c'è un diverso livello di incorporazione del due fluorofori, in quanto la polimerasi presenta più difficoltà a inserire il nucleotide marcato con Cy5 a causa dell'ingombro sterico; come se non bastasse Cy5 si presenta più labile di Cy3, quindi una prima scansione di Cy3 con il laser potrebbe ridurre la fluorescenza di Cy5. Per ovviare a tutte questa problematiche e per creare un minimo di standardizzazione si effettua il dye swap: consiste nel effettuare un secondo microarray scambiando l'uso dei fluorofori. Se nel primo microarray Cy3 è stato usato per marcare il cdna sperimentale, nel secondo microarray si userà Cy3 per marcare il cdna del soggetto di controllo, e viceversa per Cy5. I vetrini sono quindi lavati per eliminare le ibridazioni aspecifiche e sono letti con uno scanner laser confocale, in grado di rivelare entrambi i segnali fluorescenti, differenziandoli, producendo un immagine a 16-bit TIFF per ogni canale. Processori di analisi dell immagine sono quindi utilizzati per evidenziare ed analizzare i diversi spot. Gli esperimenti effettuati con la tecnologia microarray generano un enorme quantità di dati, tale da richiedere lo sviluppo di appositi software per l acquisizione, lo studio e la valutazione dei dati. Nella figura (a) si possono osservare alcuni esempi, cerchiati in azzurro, di riconoscimento grossolanamente scorretto. Nella figura (b) tali errori sono stati corretti manualmente (il cerchio con barra verticale indica che il software considera lo spot assente). Di seguito vengono riportati alcuni esempi, volti alla comprensione delle difficoltà che possono presentarsi nell ambito della lettura delle immagini. Una volta completata l ibridazione il microchip viene levato e successivamente eccitato con un laser affinché i marcatori fluorescenti emettano un segnale luminoso. Uno scanner legge l array illuminando ciascuno spot e misurando la fluorescenza emessa per ciascun colore separatamente, in modo da fornire una misura della quantità relativa di mrna prodotto da ciascun gene nei due tipi di cellula. L intensità degli spot verdi misura la quantità di cdna contrassegnato con Cy3, mentre quella degli spot rossi misura la quantità relativa di cdna contrassegnato con Cy5. 15

16 Queste misure forniscono informazioni sul livello relativo d espressione di ciascun gene nelle due cellule. Le due immagini monocromatiche (rossa e verde) vengono poi sovrapposte in modo da fornire una visione d insieme, Così il rosso corrisponde ad un gene molto attivo nella cellula malata e inattivo in quella sana, il nero ad un gene inattivo in entrambe le cellule, il giallo ad un gene ugualmente attivo nei due tipi di cellula, ed infine il verde ad un gene attivo nella cellula sana e inattivo in quella malata. E necessario che queste misure vengano aggiustate per considerare un disturbo di fondo causato ad esempio dall alta concentrazione di sale e detergente durante l ibridazione o la contaminazione del target o da altri problemi che si possono presentare nell esecuzione dell esperimento. L ibridazione del target alle sonde determina una reazione chimica che viene catturata in un immagine digitale da uno scanner laser. Il passo successivo è quello di tradurre l intensità del segnale luminoso emesso da ciascun gene, in un coefficiente numerico. S intuisce pertanto l importanza della qualità dell immagine ai fini di un accurata interpretazione dei dati. I passi principali delle immagini prodotte sono: grigliatura (gridding) estrazione di intensità segmentazione La grigliatura ritrova nell immagine la posizione degli spot che corrispondono alle sonde. Essendo nota la posizione degli spot nel microarray, questa operazione non risulta particolarmente complessa, sebbene si renda necessaria la stima di alcuni parametri per tener conto ad esempio di shift (o rotazioni) del microarray nell immagine o di piccole traslazioni degli spot. L estrazione di intensità calcola invece l intensità della fluorescenza rossa e verde, l intensità del beckground ed alcune misure di qualità. La segmentazione consiste infine nel separare il segnale emesso dai marcatori fluorescenti (foreground) rispetto al disturbo di fondo (background), in modo da isolare le quantità di interesse. Può succedere che questa correzione abbia l effetto indesiderato di introdurre valori negativi (ciò accade quando l intensità del background è più forte rispetto a quella di foreground). In tal caso questi spot vengono trascurati oppure il loro segnale è sostituito con un valore arbitrariamente piccolo e positivo. L enorme numero di geni analizzati dai microarray è il punto più forte, ma anche più debole della metodica. Infatti sono possibili moltissimi errori (importanza di avere campioni replicati), e il trattamento dell informazione non è banale! Si pensi ad esempio alle sorgenti di variazione dell espressione genica. Alcune variazioni osservate sono dovute alla risposta differente a condizioni genetiche e ambientali differenti (es. cellule malate vs cellule sane): variazione questa che possiamo considerare interessante. Al fine di rendere comparabili i risultati ottenuti su array diversi o anche all interno dello stesso array, è necessaria la rimozione di alcune distorsioni sistematiche introdotte nella fase di preparazione dell array stesso, di esecuzione dell esperimento, nonché nel processo d ibridizzazione e nella scansione con il laser. La procedura di normalizzazione si riferisce proprio al trattamento statistico dei dati finalizzato alla rimozione di tali effetti distorsivi e i più noti sono: dye-effect (o effetto colore); print-tip (o deposito irregolare); array-effect (o effetto intensità). Ad esempio, un diffuso problema nell interpretazione dei dati derivanti da microarray, noto come dye-effect, è la diversa intensità di fluorescenza dei due marcatori Cy3 (verde) e Cy5 (rosso), cosicché l emissione di fluorescenza del verde è sistematicamente meno intensa di quella del rosso. Il modo più immediato per rimuovere questo tipo di distorsione, sarebbe quello di ripetere due volte l esperimento scambiando l assegnazione dei marcatori tra i due target, cosa che però renderebbe la tecnica ancora più dispendiosa. Un altra fonte di distorsione, nota come print-tip, è dovuta alla diversa quantità di materiale genetico (probe) depositata sul vetrino a causa delle microscopiche differenze della conformazione delle puntine del robot che stampa l array. Infine, il terzo tipo di alterazione, l array-effect può derivare da differenze di intensità tra un array e l altro legate a diverse condizioni di preparazione (usura delle puntine, qualità di conservazione e quantità dei reagenti), estrazione (differenti quantità di mrna usate per creare il target o quantità di marcatore fluorescente), ibridizzazione (cross-ibridation) e scansione (bilanciamenti dei laser, diversi parametri di scansione). 16

17 Ai problemi sopra esposti si cerca di dare soluzione mediante il processo di normalizzazione. La normalizzazione prevede che si calcolino fattori di standardizzazione per ciascuno dei tre effetti sopra menzionati. Si tratta di sottrarre al segnale una (i) media generale di array, la (ii) differenza tra le medie degli spot stampati da ciascun print-tip e la media generale, ed infine la (iii) differenza tra la media delle intensità con fluorescenza rossa e verde. Altre variazioni sono introdotte per errore durante la preparazione dei campioni, la realizzazione degli array, il processamento degli array (labeling, ibridizzazione, scannerizzazione) trattasi quindi una variazione oscura che deve essere eliminata attraverso il processo di normalizzazione Soluzione : trovare un insieme di geni invarianti cioè tali che: 1) i loro valori di espressione rimangano costanti su tutti gli array 2) i loro valori di espressioni ricoprano l intero spettro di intensità del segnale osservato. (NB: Il fattore di normalizzazione necessario per aggiustare le intensità basse non necessariamente è uguale a quello utilizzato ad intensità elevate). 3) i rapporti di normalizzazione tra questi geni siano rappresentativi dei rapporti di normalizzazione per tutti i geni. Geni di controllo: geni sintetici a concentrazioni note (3?) Geni housekeeping: geni che sono assunti (in partenza) essere invarianti tra array differenti (1? e 2?) Geni osservati: geni che vengono osservati, secondo qualche metrica, come poco variabili lungo gli array. Tutti i geni: è ragionevole aspettarsi che siano molto pochi i geni che variano a causa di una diversa risposta a condizioni di interesse differenti (più è piccolo il numero di geni che varia, e maggiormente siamo soddisfatti). Quasi tutti i geni dell array possono essere utilizzati per la normalizzazione quando si può ragionevolmente assumere che solo una piccola porzione di essi vari significativamente la propria espressione da un campione all altro, oppure che esista simmetria nei livelli di espressione dei geni sovra e sotto espressi. In pratica è però molto difficile trovare un gruppo di spot con un segnale costante su cui trarre un fattore di correzione. Si preferisce quindi, quando il numero di geni differenzialmente espressi è limitato rispetto al numero totale dei geni indagati, usare tutti gli spot dell array nel processo di normalizzazione dei dati. Il secondo approccio si basa sull assunto che da proporzione di geni differenzialmente espressi sia un altra e quindi suggerisce l uso della restante porzione (housekeeping genes) che si crede abbia un livello di espressione costante nelle due condizioni. Questa piccola porzione di geni però, oltre ad essere difficilmente identificabile, spesso risulta poco rappresentativa rispetto ai geni di interesse essendo costituita per lo più da geni con alto livello di espressione. Il terzo approccio necessita dell appoggio del laboratorio e prevede di realizzare un microarray per un solo campione di mrna (prelevato da un unica cellula) diviso in due porzioni uguali, ciascuna marcata con colori differenti. Trattandosi dello stesso campione di materiale genetico, in seguito all ibridizzazione si dovrebbe avere la stessa intensità degli spot per il rosso e per il verde: eventuali differenze possono essere usate come fattore di normalizzazione. Un altro trattamento dei dati preliminare all analisi è la cosiddetta filtrazione. Essa è finalizzata alla riduzione della variabilità e della dimensionalità dei dati Il primo obiettivo viene raggiunto rimuovendo quei geni le cui misure non sono sufficientemente accurate, il secondo con l imitazione dei geni che prevedono un livello di espressione molto piccolo o negativo (prima o dopo la normalizzazione). In pratica, tutti gli spot la cui differenza tra l intensità di foreground e quella di background non supera un valore soglia di 1.4 fold (una misura dell intensità luminosa) vengono eliminati o sostituiti con un valore piccolo arbitrario. Questa procedura è giustificata dall evidenza empirica che livelli di espressione più piccoli di 1.4 fold sono solitamente frutto di errori di misura. Si noti che qualsiasi operazione di filtrazione introduce arbitrarietà nella scelta delle soglie che determinano se un valore è troppo grande o troppo piccolo oppure se la variabilità delle misure è troppo elevata. L acquisizione dei dati è solo la parte iniziale della procedura. La parte più complicata è l elaborazione della enorme quantità di dati generati da questi esperimenti, necessaria per rispondere ai quesiti biologici di partenza. I dati più significativi devono essere poi verificati con altri sistemi (Northern, real time RT-PCR). Selezione dei geni target. Un potenziale problema per la tecnologia dei cdna microarray è la cross reattività legata ad omologie di sequenza, in particolar modo quando si analizzano famiglie geniche. Generalmente le regioni non tradotte in 3 rappresentano un target ideale per due principali ragioni: (1) tali regioni sono sottoposte ad una minor pressione selettiva e presentano generalmente una maggiore variabilità, e (2) l ibridizzazione risente meno dei fenomeni di terminazione precoce della retro trascrizione. Un'altra possibilità consiste nell aggiungere alla soluzione di ibridazione piccoli oligonucleotidi che rappresentano sequenze altamente ripetute al fine di bloccare le potenziali regioni di crossibridizzazione. Concentrazione del DNA. La concentrazione del DNA varia nei singoli esperimenti e dipende in parte dal livello di espressione del gene target. La concentrazione ottimale generalmente varia tra 0.1 e 0.5 g/ l. Vetrini e printing. Sono presenti in commercio diversi tipi di vetrino. Per alcune ragioni esiste una corrispondenza tra tipo di vetrino e protocollo per microarray. Durante la deposizione, l evaporazione dei campioni di DNA può causare seri problemi a causa della variazione della quantità di DNA, soprattutto se si utilizzano piccoli volumi (20 l). Una possibile soluzione consiste nell utilizzare per il printing un buffer composto al 50% da dimetil sulfossido (DMSO). La concentrazione del DNA, il buffer per il printing e il tipo di vetrino devono essere ottimizzati prima di procedere con la deposizione. 17

18 Materiale di partenza. L integrità e la purezza dell RNA sono due dei fattori che maggiormente determinano la riproducibilità dell esperimento. Spesso un RNA di scarsa qualità è dato da un errato trattamento del materiale di partenza. In generale è importante mantenere sempre i campioni in ghiaccio, congelarli appena possibile in azoto liquido e non scongelarli fino al momento dell uso. Campioni con acidi nucleici La preparazione dei campioni con acidi nucleici utilizza procedure diverse, che variano secondo i casi. Sono tutte abbastanza complesse per cui preferiamo tabularle cosi come sono riferite da Schena (2002). Criteri Trascrizione Inversa RNA Polimerasi Procedura Eberwine TSA Dendrimeri Tipo indiretta Diretta diret. o indiretto diretta indiretta Template -DNA RNA DNA doppia elica e promotore DNA doppia elica e promotore RNA o DNA con piccola molecola di legame RNA o DNA in dendrimeri Prodotto T3 o T7 nucleotide T7 RNA polim nucleotide nucleotide nucleotide oligonucleotide nucleotide Reattivo oligonucleotide Modificato modificato o anticorpo coniugato TSA modificato modificato modificato o dendrimero fluorescente modificato Interazione Ibridazione Ibridazione o piccolo Ibridazione piccolo anticorpo Ibridazione anticorpo Amplificazione Nessuna Tipo di amplificazione Nulla nulla, enzim o passiva passiva aumento quantità RNA enzimatica passiva Colore fluorescente Cianina Cianina qualsiasi Cianina Cianina BIODIP Alexa Alexa Processo Nulla fino a 3 ore nulla ma l'amplificazione del RNA diversi giorni 3 ore 3 ore Metodi di marcatura. La marcatura fluorescente degli acidi nucleici è un altra variabile che influenza la riproducibilità. Vernon et. al. hanno testato la riproducibilità di tre diversi metodi di marcatura e hanno evidenziato come i risultati più riproducibili erano ottenuti effettuando un RT-PCR con 1 g di mrna utilizzando il sistema SMART (Clontech Laboratories) [18]. Sviluppo di un protocollo di ibridizzazione. Le procedure di ibridizzazione sono legate alla riproducibilità del metodo, è quindi importante ottimizzare tutti i parametri di ibridizzazione, tra cui la concentrazione del campione, forza ionica, temperatura. Non è possibile fornire un protocollo universale, ma è necessario procedere all ottimizzazione di tutti i parametri per ogni singolo esperimento. Scanning dei vetrini. Dopo il lavaggio finale i vetrini devono essere immediatamente scannerizzati per il canale Cy5 e poi per il Cy3 (Cy5 è più sensibile alla fotodegradazione), inoltre è importante effettuare una calibrazione dello scanner per il fuoco e il segnale. Riteniamo utile completare quanto riferito nella su esposta tabella con qualche altro dato che può risultare utile per interpretarl Trascrizione inversa. E' stato il metodo utilizzato nei primi esperimenti con i microarray. Da questo metodo base sono poi derivate numerose varianti. usando sia RNA cellulari, che sono molto più facili da ottenere, che mrna. Sono state anche utilizzati diversi tipi di trascriptasi inverse e diversi metodi di purificazione dei campioni. Il principale vantaggio di questo metodo è dato dalla coniugazione diretta che elimina i trattamenti da fare dopo l'ibridazione, che sono sempre ardui e richiedono molto tempo per essere espletati. Lo svantaggio maggiore è data dal fatto che si ottiene un segnale molto meno evidente di quello che si ha con l'approccio indiretto che si giova dell' effetto dell' amplificazione. La trascriptasi inversa è usata per incorporare la biotina o il dinitrofenolo al cdna, che poi viene ibridizzato su un microarray ed incubato con un anticorpo coniugato alla perossidasi. Il chip, così composto, è trattato con acqua ossigenata per cui la perossidasi ossida il segnale fluorescente della tiramide. Ne deriva un segnale fluorescente molto intenso, fino a 100 volte. E' un segnale, però, che ha un'emivita molto breve. RNA polimerasi. Questo, oltre alle trascriptasi inverse è un altro gruppo di enzimi largamente usati per preparare campioni per microarray. Si tratta di una famiglia di enzimi estratti da virus batterici (T3 e T7), che catalizzano la sintesi del RNA partendo da un DNA a doppia elica, grazie all'azione di promotori specifici. Si tratta di un processo robusto e ad alta resa che da la possibilità di produrre quantità notevoli di RNA, che poi può essere diviso facilmente in piccoli frammenti a livello di oligonucleotidi con possibilità di amplificazione del segnale anche di 100 volte. Bisogna solo stare molto attenti ad evitare l'azione delle ribonucleasi che attaccano facilmente le molecole di RNA. Si consiglia quindi di operare in stanze molto ben pulite, utilizzare guanti di gomma sintetica e, ovviamente, essere certi che reattivi e tamponi siano assolutamente privi di ribonucleasi. 18

19 Procedura Eberwine. Si tratta di un metodo molto ingegnoso che si basa sull'uso della RNA polimerasi da T7, che converte mrna in cdna con amplificazione, che per ogni procedura è di circa 100 volte e che, alla fine, può arrivare fino a volte rispetto al materiale di partenza. Pertanto questo è il metodo preferito quando si devono risolvere particolari problemi biologici che non si possono risolvere con altri metodi. Lo svantaggio di questo metodo è che è piuttosto arduo e lungo. Infatti occorrono 2-3 giorni per completarlo e poi si attua attraverso manipolazioni durante le quali non si riesce a seguire cosa stia succedendo, per cui, se ci sono interferenze da reagenti inattivi o da contaminazioni da ribonucleasi, lo si capisce solo alla fine, di fronte a risultati inattesi. TARGET targets sono i campioni da fare interagire. Anche questi devono essere in qualche modo preparati. Per quanto riguarda gli acidi nucleici, spesso occorre fare in modo che il segnale venga amplificato. In tutti i casi, sia per gli acidi nucleici come per le proteine poi è necessario legarli ad una molecola rivelatrice che, per lo più, finora è stato un colore fluorescente. Amplificazione del segnale da tiramide (TSA) La tiramide, in questa procedura, ha la funzione di potenziare il segnale di varie sostanze fluorescenti, come la fluoresceina, la cianina 3 o la cianina 5, per cui si possono realizzare reazioni che portano alla formazione di colori diversi. Dendrimeri. Il termine dendrimero deriva dalle parole greche dendron e meros che significano rispettivamente albero e parte. Infatti sono costituiti da ordinati grovigli di monomeri di oligonucleotidi che ricordano la chioma di alberi e che si formano, per processi di sintesi progressivi, anellandosi gli uni agli altri attraverso cicli progressivi che possono arrivare a formare anche molecole di DNA aventi un PM di e contenenti basi. Le singole molecole fluorescenti attaccate alle numerose estremità sporgenti o braccia del polimero determinano la comparsa di un segnale fluorescente molto intenso. Un polimero con 300 molecole di colore produce un segnale 300 volte più intenso. Ne deriva che polimeri aventi un diametro di 0,2 micron si vedono anche ad occhio nudo. Nel complesso è una tecnica che, anche se non facile da eseguire, presenta molti vantaggi. Riferimenti 1. Heller, M.J., DNA microarray technology: Devices, Systems and Applications. Annual Reviews of Biomedics Engeneering, : p Ekins, R.P., Multi-analyte immunoassay. J.Pharm.Biomed. Anal., : p Ekins, R.P. and et.al., Multispot, multianalyte,immunoassay. Ann.Biol.Clin., : p Ekins, R.P. and F. Chu, Multianalyte microspot immunoassay. The microanalytical "compact disk "of the future. Ann.Biol.Clin., : p Gabig, M. and W. Grzegorz, An introduction to DNA chips: principles, technology, applications and analysis. Acta Biochimica Polonica, (3): p Schena, M., et al., Quantitative monitoring of gene expression patterns with complementary DNA microarray. Science, : p Lander, E.S. and et.al., Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, : p Venter, J.C. and et.al., The sequence of the human genome. Science, : p Arcellana-Panlilio, M. and S.M. Robbins, Cutting edge tecnology. Global gene expression profiling using DNA microarrays. Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol., : p Southern, E., K. Mir, and M. Shchepinov, Molecular interactions on microarrays. Nature Genetics, : p Lockart, D.J., et al., Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays. Nature Biotechnology, : p Lipshutz, R.J., et al., High density syntetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics, : p Haase, B. Applications of affimetrix microarrays in cancer and genotyping. in Understanding the genome: Scientific progress in microarray technology Genova, Italy. 14. Cifuentes, F. Characterization and properties of oligonucleotide microarrays produced using inkjet technology. in Understanding the genome: Scientific progress in microarray technology Genova, Italy. 15. Schubler, P. New platforms for DNA microarrays: 70mer oligonucleotide probes offer excellent sensitivity and specificity. in Understanding the genome: Scientific progress in microarray technology Genova, Italy. 16. DeRisi, J., et al., Use of a cdna microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nature Genetics, : p Schena, M., et al., Parallel human genome analysis: microarray-based monitoring of 1000 genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, : p Vernon, S.D., et al., Reproducibility of alternative probe synthesis approaches for gene expression profilig with arrays. J. Mol.Diag., : p Li, X., et al., DNA microarrays: their use and misuse. Microcirculation, : p Firestein, G.S. and D.S. Pisetsky, DNA microarray: Boundless technology or bound by technology? Guidelines for studies using microarray technology. Arthritis & Rheumatology, (4): p

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