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1 Linfomi non-hodgkin s: definizione Malattie neoplastiche con aspetti quanto mai eterogenei, con caratteristiche morfologiche, fenotipiche, genotipiche e talora funzionali corrispondenti ad uno o più degli stadi di maturazione e trasformazione delle cellule linfoidi. Possono originare da cellule B (85% dei casi) o da cellule T.

2 WHY did I develop lymphoma? AETIOLOGY of LYMPHOMA generally unknown Exceptions (risk factors): Immunodeficiency: HIV, post-tansplant, primary immunodeficiencies, (pesticides?) Previous dx of another lymphoid malignancy

3 PHYSICIAN s ANSWERS We do not know WHY you developed lymphoma BUT in many cases we know pretty well HOW your lymphoma developed

4 Is it useful to know HOW did my lymphoma develop? YES Because molecular markers may contribute to: Better diagnosis Prognostication Choice of therapy Molecular monitoring

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6 VDJ RECOMBINATION in bone marrow recombination-activating genes 1 and 2 (RAG-1 and RAG-2)

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8 B-CELL EVENTS in GERMINAL CENTRE MEMORY B-CELS SECONDARY B-CELL BLASTS PLASMACELLS STABLE CLASS SWITCHING FDC CENTROCYTES centrocytes centroblasts CENTROBLASTS DARK ZONE APICAL LIGHT ZONE BASAL LIGHT ZONE SOMATIC HYPERMUTATION ONGOING VIRGIN B-CELLS

9 SOMATIC HYPERMUTATION (SHM) of IgV GENES GERMINAL CENTER B CELLS Germline A T A A G C A C C T G G G A T A Somatically mutated T T A A C C C C C T G A G A T A

10 IgV SOMATIC HYPERMUTATION has the POTENTIAL to INCREASE AFFINITY of the BCR for ANTIGEN SOMATIC HYPERMUTATION

11 Patogenesi Molecolare dei Linfomi Non Hodgkin s Il linfoma si sviluppa per un alterato funzionamento dei meccanismi che regolano l espressione di protooncogeni e/o per perdita di geni onco-soppressori. I meccanismi che determinano tali alterazioni sono: Traslocazioni cromosomiche Delezioni geniche Amplificazioni geniche Ipermutazioni somatiche

12 MOLECULAR PATHWAYS in B-CELL LYMPHOMAGENESIS Mantle cell lymphoma VIRGIN B-CELLS BCL-1 MALT lymphoma API2/MLT MARGINAL ZONE GERMINAL CENTER Lymphoplasmacytoid lymphoma PAX-5 HHV-8 Primary effusion lymphoma PLASMA CELL MANTLE MEMORY B-CELS Follicular lymphoma BCL-2 p53 BCL-6? DLBCL c-myc p53 Burkitt lymphoma

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14 Virgin B-cells HISTOGENETIC MARKERS of B-NHL Germinal center B-cells Memory B-cells FDC IgV mutations BCL-6 mutations Plasmacells BCL-6 MUM-1 CD138

15 HISTOGENESIS of B-cell NHL Virgin B cells Centroblasts/ Centrocytes Memory B cells FDC Plasma cells Mantle cell lymphoma Follicular lymphoma Burkitt lymphoma DLBCL Immunocytoma MALT-lymphoma DLBCL

16 Traslocazioni cromosomiche (I) Rappresentano il più comune meccanismo di deregolazione e conseguente attivazione di un particolare proto-oncogene. Il proto-oncogene, bersaglio del riarrangiamento, mappa vicino ad uno dei punti di rottura. L espressione del proto-oncogene è alterata perché la traslocazione lo pone sotto il controllo di sequenze eterologhe che favoriscono l espressione dei geni delle immunoglobuline o di altri geni espressi durante l ontogenesi B ( promoter/enhancers sequences )

17 Traslocazioni cromosomiche (II) La conseguenza del riarrangiamento è un eccessiva produzione di una proteina normale, quella codificata da quel particolare oncogene. Salvo rare eccezioni, non vengono mai prodotte proteine di fusione Sul piano patogenetico la traslocazione è forse dovuta ad errori nei processi di: Ricombinazione somatica Mutazione ipersomatica

18 Traslocazioni cromosomiche (III) Si distinguono in: Omotipiche: il proto-oncogene è fisiologicamente espresso dalle cellule di quel tessuto e viene solo sovraespresso dal tessuto tumorale Eterotipiche: il proto-oncogene non è fisiologicamente espresso dalle cellule di quel tessuto e viene ectopicamente espresso a causa della traslocazione Ciascuna è caratteristicamente correlata ad uno specifico sottotipo istologico di linfoma Non sono da sole sufficienti ad indurre la malattia

19 DIAGNOSI MOLECOLARE del L. MANTELLARE Linfoma mantellare CELLULE B VERGINI BCL-1 ZONA MARGINALE CENTRO GERMINATIVO PLASMACELLULA MANTELLO CELLULA B MEMORIA

20 Linfoma mantellare La cellula linfomatosa ha un fenotipo simile a quello espresso dalle cellule del follicolo o del mantello. Un altra somiglianza consiste nella mancanza di mutazioni del gene che codifica per la regione variabile delle immunoglobuline Il 65% circa dei pazienti presenta la traslocazione t(11;14)(q13;q32)

21 ANALISI MEDIANTE FISH del RIARRANGIAMENTO di BCL1 in LINFOMA MANTELLARE Centro per lo Studio e la Cura delle Malattie del Sangue Novara

22 t(11;14)(q13;q32) Giustappone il gene che codifica per l elemento J delle catene pesanti delle immunoglobuline, mappato in 14q32, al gene bcl-1, mappato in 11q13. Nella maggioranza dei casi (30-55%) il punto di rottura cade nel Major Translocation Cluster (MTC), ma nel 10-20% dei pazienti il punto di rottura è più distale Bcl-1 non è il gene sovra-espresso a causa della traslocazione. Infatti quest ultima determina un aumentata espressione del gene che codifica per la ciclina D1, situato 120kb a valle di Bcl-1.

23 Ciclina D1 (I) Non è normalmente espressa da linfociti e cellule mieloidi, ma costantemente espressa dalle cellule del mantello Il ruolo importante della ciclina D1 nella patogenesi del linfoma è dimostrato dal fatto che la sua espressione è aumentata anche nei pazienti con traslocazioni varianti o con trascritti aberranti che prolungano l emivita della molecola

24 Ciclina D1 (II) La sua sovra-espressione causa un accorciamento della fase G1 ed una minor dipendenza da fattori di crescita esterni. Una volta sovra-espressa favorisce la crescita tumorale agendo in due modi: Aumentando la fosforilazione e bloccando l azione anti-proliferativa di Rb-1, o direttamente o indirettamente previa formazione di complessi con le kinasi ciclina dipendenti 4 e 6 Associandosi ad alterazioni del gene p27 Kip1

25 Ciclina D1 (III) Se la sua espressione è aumentata la cellula assume un fenotipo sempre più aggressivo, determinato anche dallo sviluppo di mutazioni a carico di TP53 e da delezioni a carico di p16 INK4a e p15 INK4b, geni che inibiscono le kinasi ciclina dipendenti

26 CYCLIN-DEPENDENT KINASES (CDK) Composte da: Subunità catalitica + Ciclina Le subunità catalitiche sono attive solo quando complessate con le cicline Le cicline e le subunità CDK formano complessi 1:1 che producono l oloenzima CDK Si conoscono almeno 9 CDK (1-9) e 15 cicline (A-T) Ciclina D1/CDK4 fosforila RB1 abrogandone l azione oncosoppressoria

27 MOLECULAR PATHOGENESIS OF FOLLICULAR LYMPHOMA MARGINAL ZONE VIRGIN B CELLS GERMINAL CENTER PLASMA CELL MANTLE MEMORY B CELL Follicular lymphoma BCL-2 p53 p15 p16 Aberrant hypermutation BCL-6? Diffuse large B cell lymphoma Hematology Unit DMS & IRCAD Novara

28 Linfoma Follicolare La composizione cellulare è simile a quella del follicolo secondario. Le cellule esprimono CD10 e mostrano mutazioni già presenti o in via di sviluppo nei geni che codificano per la regione variabile delle immunoglobuline. Nell 80% dei pazienti si osserva la traslocazione t(14;18)(q32;q21), nel 20% dei pazienti si dimostra invece il riarrangiamento della banda 3q27.

29 t(14;18)(q32;q21) Chromosome 14 Chromosome 18 q p Immunoglobulin heavy chain (IgH) q p BCL-2 breakpoints ex.1 ex.2 ex.3 5 3

30 t(14;18)(q32;q21) Giustappone il gene che codifica per l elemento J delle catene pesanti delle immunoglobuline, mappato in 14q32, al gene Bcl-2 Determina un aumentata espressione della proteina Bcl-2

31 Punti di rottura in Bcl-2 Nel 70% dei casi a livello dell estremità 3 non tradotta del gene, in vicinanza al terzo esone. Questa regione è chiamata Major breakpoint region (MBR) Nel 5-20% dei casi 20kb a valle di Bcl-2, in una regione chiamata minor cluster region (MCR) In una piccola frazione di pazienti il punto di rottura cade a livello dell estremità 5 del gene, in una regione chiamata variant cluster region (VCR)

32 Patogenesi della traslocazione Studi iniziali avevano individuato nucleotidi random a livello dei punti di rottura della traslocazione e ciò aveva fatto supporre che il riarrangiamento fosse dovuto ad errori nel processo di ricombinazione dei geni delle immunoglobuline Più recentemente però l applicazione delle metodiche di sequenziamento genico ha permesso di escludere la presenza di siti necessari all attivazione della ricombinasi a livello dei punti di rottura

33 Chr. 18 Chr. 14 BCL-2 IgH ex.1 ex.2 ex.3 5 J 3 H S μ E μ C μ + up-regolazione trascrizionale di BCL-2

34 Bcl-2 (I) E una proteina a sede mitocondriale, ma si trova anche a livello della membrana nucleare e citoplasmatica Induce un blocco della morte cellulare programmata per: Inibizione delle caspasi, attivate da un aumentata espressione di FAS (CD20) Blocco dell azione pro-apoptotica svolta dalle molecole BAX e BAD Interazione con la proteina BH3

35 Bcl-2 (II) Principale meccanismo d azione: blocca la distruzione della membrana mitocondriale da parte del sistema BAX/BAD e perciò impedisce la fuoriuscita di citocromo C dal mitocondrio e la successiva attivazione delle caspasi Bloccando l apoptosi determina l immortalizzazione della cellula.

36 Il BCL-2 è un componente integrale della membrana di: Mitocondri Nucleo Reticolo endoplasmatico BCL2

37 Importanza del blocco dell apoptosi Permette alla cellula di sopravvivere in ambienti ostili (es.: poveri di citochine o in O 2 ) Permette di sopravvivere a distanza dal microambiente Elimina condizioni pro-apoptotiche, causate dall attivazioni di particolari proto-oncogeni

38 Ruolo di Bcl-2 nella patogenesi del Linfoma (I) Controverso: Il 35-50% dei soggetti sani di solito in età avanzata, studiati con RT PCR ad elevata sensibilità, presenta la t(14;18) Riarrangiamenti non neoplastici possono svilupparsi dieci mesi dopo la terapia in soggetti precedentemente affetti da linfoma. Si ritiene che essi siano dovuti ad una ricostituzione dell immunità

39 Ruolo di Bcl-2 nella patogenesi del Linfoma (II) L aumentata espressione non è da sola sufficiente a causare il linfoma, ma probabilmente ne favorisce solo lo sviluppo perché il blocco dell apoptosi permette alla cellula di acquisire di ulteriori alterazioni geniche

40 Ruolo di Bcl-2 nella patogenesi del Linfoma (III) Necessità di monitorare i soggetti sani con traslocazione 14;18 per dimostrare una possibile correlazione con: Un particolare fenotipo Età avanzata Presenza di cloni minori

41 Significato prognostico del riarrangiamento (I) Il punto di rottura in MCR dà la miglior risposta terapeutica (98% di remissione complete e 96% di remissione libera da malattia a tre anni), mentre un punto di rottura in MBR o una configurazione germline di Bcl-2 si associano ad un inferiore risposta Complessivamente una risposta completa con negativizzazione del dato molecolare si ottiene in un terzo dei pazienti

42 Lopez-Guillermo et al, Blood 1999;93;3081

43 Significato prognostico del riarrangiamento (II) Qual è l impatto della negativizzazione molecolare sulla sopravvivenza libera da malattia? Nessuno se la t(14;18) scompare a breve distanza dalla fine della chemioterapia (entro sei mesi), ma importante se la scomparsa persiste dopo il primo anno dalla fine della chemioterapia

44 Significato prognostico del riarrangiamento (III) Qual è il significato della frequente dissociazione tra dato molecolare e dato clinico? Da definire Pazienti in RC con dato molecolare positivo Pazienti in recidiva clinica ma con dato molecolare negativo

45 Linfoma Follicolare t(14;18) negativo Incidenza: 15% Suddivisi in: 30% Bcl % Bcl-2, Bcl-6+

46 Linfoma follicolare a grandi cellule Due tipi istologici: 3a, con prevalenza di centroblasti ma centrociti ancora presenti 3b, con presenza pressochè esclusiva di centroblasti t(14;18) osservata nel 73% dei casi 3a versus 13% dei casi 3b CD10 espresso dal 100% dei pazienti 3a ma solo dal 50% dei pazienti 3b Bcl-6 espresso nel 44% dei casi 3b

47 Linfoma follicolare a grandi cellule 3B Entità biologica e clinica eterogenea La maggior parte delle cellule sono centroblasti, mancano i centrociti In nessun caso si osserva un aumentata espressione sia di Bcl-2 che di Bcl-6. Si distinguono tre diversi sottotipi biologici: Con t(14;18) e Bcl-2 positivo, derivato dalle forme indolenti Con anomalie cromosomiche diverse Bcl-6 positivo più simile al linfoma centroblastico diffuso

48 Linfoma follicolare a grandi cellule 3B Bcl-6 positivo Crescita follicolare con componente monocitoide Cellula linfomatosa CD5-, CD10-, CD20+, Bcl-2-, Bcl-6+ Mutazioni intraclonali a livello del primo introne di Bcl-6 indicanti un origine del linfoma dal CG Esordio più frequentemente in stadio III-IV con masse linfomatose Prognosi favorevole

49 TRASFORMAZIONE del LINFOMA FOLLICOLARE BCL-6 L. Diffuso a grandi cellule de novo BCL-2 p53, p16, p15 BCL-6 Mut Centro per lo Studio e la Cura delle Malattie del Sangue Novara L. follicolare L. Diffuso a grandi cellule trasformato

50 Linfoma diffuso a grandi cellule (I) Il 30-45% dei pazienti mostra una traslocazione bilanciata a carico della banda 3q27, che contiene il proto-oncogene Bcl-6, definito promiscuo perché si riarrangia con numerosi partners. Il punto di rottura in Bcl-6 è a livello della regione 5 non codificante ad attività regolatoria del gene. Pertanto, tutte le traslocazioni pongono la porzione codificante di Bcl-6 sotto l azione di promoter/enhancers sequences derivate dall altro cromosoma.

51 Linfoma diffuso a grandi cellule (II) Il 73% circa dei pazienti mostra mutazioni puntiformi a carico della stessa regione di BCL-6 Si tratta di mutazioni somatiche bialleliche che avvengono indipendentemente dal riarrangiamento della banda 3q27. La mutazione di BCL-6 è considerata un marcatore del transito attraverso il CG.

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53 BCL-6 E lungo 26kb ed è formato da 10 esoni Codifica per un repressore nucleare sequenzaspecifico della trascrizione. A livello dell estremità amino-terminale contiene una regione che lega N- CoR e SMRT, repressori trascrizionali La proteina BCL-6 viene degradata non solo per fosforilazione ma anche per acetilazione

54 Funzioni di BCL-6 Essenziale per lo sviluppo del CG e per la maturazione della cellula CD4+. La sua mancanza determina una risposta infiammatoria di tipo Th2 (con produzione di IL-4, IL10, stimolatori della produzione anticorpale) con infiltrati multiorgano costituiti da eosinofili e cellule B IgE positive Regola l espressione di geni importanti per l attivazione e differenziazione dei linfociti, per la risposta infiammatoria e per il ciclo cellulare

55 BCL-6: possibile ruolo patogenetico nel linfoma diffuso a grandi cellule Il legame tra il ligante del CD40 e il promotore di BCL-6 riducono l espressione di BCL-6 e favoriscono la normale differenzazione del linfocita B transitato nel CG. Le traslocazioni cromosomiche che sostituiscono la sequenza 5 regolatoria di BCL-6 altererebbero questo meccanismo. Azione anti-apoptotica?

56 Niu, Hematol Oncol 2002;20:155

57 BCL-6 positività e caratteri clinici Elevati valori di LDH e grosse masse linfomatose Significato prognostico irrilevante per quanto riguarda la percentuale di remissione completa e la sopravvivenza globale, ma migliore sopravvivenza libera da malattia a 5 anni per i pazienti con mutazione di BCL-6 ed elevati livelli di RNA messaggero

58 PROGNOSTIC IMPACT of DFS BCL-6 MUTATIONS % pts Median follow-up 73 months months 85% 48% p=.05 A subset of BCL-6 mutations associated with DLBCL cause deregulated BCL-6 transcription Deregulating mutations are not found in normal GC B-cells Pasqualucci et al., Blood 2003 BCL6 unmutated BCL6 mutated Vitolo U, Leukemia 2002;16:268 Artiga et al., Am J Pathol 2002;160:1371

59 Linfoma di Burkitt Hanno come bersaglio il gene c-myc, mappato a livello della banda 8q24. La proteina codificata dal gene viene sovraespressa per: Mutazioni insorte nella sequenza regolatoria del gene posta all estremità 5 Mutazioni missense che interferiscono con la fosforilazione del gene Traslocazioni cromosomiche

60 Linfoma di Burkitt: traslocazioni cromosomiche t(8;14): Nelle forme endemiche il punto di rottura sul cromosoma 8 si trova kb a monte di c- MYC che viene giustapposto all elemento J H Nelle forme sporadiche il punto di rottura si trova all estremità 5 del gene c-myc, che viene giustapposto a C H t(2;8) e t(8;22):il punto di rottura è 300kb a valle di c-myc che si fonde testa-coda con i geni per le catene leggere delle immunoglobuline

61 Proteina c-myc Proteina nucleare ad espressione ubiquitaria Fattore trascrizionale La sua espressione aumenta quando la cellula passa da uno stato di quiescenza ad uno stato di attiva proliferazione

62 Linfoma anaplastico Nel 40-60% dei pazienti con linfoma T o null si osserva la traslocazione t(2;5)(p23;q35) La traslocazione fonde il gene ALK, mappato in 2p23, con il gene NPM, mappato in 5q35 E l unico riarrangiamento che nei linfomi non-hodgkin s dà origine ad una proteina di fusione

63 Gene ALK Codifica per una proteina recettoriale transmembrana, con ligando sconosciuto ad attività tirosin kinasica. In condizioni fisiologiche una volta avvenuto il legame con il ligando si verifica la dimerizzazione della proteina e lo sviluppo dell attività kinasica

64 Gene NPM Codifica per una fosfoproteina nucleolare, che trasporta proteine dal citoplasma al nucleolo A livello della porzione carbossi-terminale contiene due siti di segnale per la localizzazione nucleare

65 Proteina chimerica NPM-ALK Formata dalla porzione di NPM, necessaria alla formazione di oligomeri e dalla porzione di ALK necessaria all attività kinasica Quindi la proteina chimerica è in grado di formare dimeri con se stessa e con moleclole NPM. La formazione di dimeri causa l attivazione dell attività kinasica di ALK senza necessità che si verifichi il legame con il ligando La tecnica più semplice per evidenziare la proteina è quella immuno-istochimica, che dimostra la proteina non solo nel citoplasma ma anche nel nucleo

66 Altre proteine formate da ALK Sono conseguenti alle traslocazioni: t(1;2)(q25;p23) t(2;3)(p23;q21) inv(2)(p23q35) Tutte formano dimeri per azione del gene partner di ALK,con conseguente sviluppo dell attività kinasica di quest ultimo L immunoistochimica ne dimostra l esclusiva localizzazioine citoplasmatica mancando le regioni per la localizzazione nucleare fornite da NPM.

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68 Stein et al, Blood 2000;96:3681