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1 Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova Dipartimento di PEDIATRIA SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN MEDICINA DELLO SVILUPPO E SCIENZE DELLA PROGRAMMAZIONE INDIRIZZO: EMATOONCOLOGIA, IMMUNOLOGIA E GENETICA XXIV CICLO RILEVANZA BIOLOGICA E PRE-CLINICA DEL RECETTORE TIROSIN CHINASICO ALK NEL RABDOMIOSARCOMA Direttore della Scuola : Ch.mo Prof. Giuseppe Basso Coordinatore d indirizzo: Ch.mo Prof. Giuseppe Basso Supervisore: Prof. Angelo Rosolen Dottorando: D.ssa Marica Peron

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3 SOMMARIO RIASSUNTO 1 SUMMARY 3 1.INTRODUZIONE Il Rabdomiosarcoma Caratterizzazione isto-patologica Alterazioni cromosomiche ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) Struttura di ALK Funzione di ALK Espressione di ALK nei tumori Proteine di fusione Mutazioni di ALK SCOPO DELLA TESI 22 3.MATERIALI E METODI Colture cellulari Reagenti ed anticorpi Saggio di citotossicità con MTT Immunoblotting Immunoprecipitazione Analisi dei cicli cellulari mediante citometria a flusso Saggi di invasività e migrazione Saggio Wound Healing PCR, Polymerase Chain Reaction RT-qPCR RISULTATI Espressione di ALK nelle linee cellulari di RMS Attivazione di ALK Ruolo di ALK nel RMS Inibizione di ALK Discussione 49 BIBLIOGRAFIA 55

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5 RIASSUNTO Il rabdomiosarcoma (RMS) è il più comune sarcoma pediatrico dei tessuti molli che si sviluppa come conseguenza dell alterazione dei pathways che controllano la crescita e la differenziazione dei precursori del tessuto muscolare striato. Il RMS presenta due principali sottotipi istologici: il rabdomiosarcoma alveolare (ARMS) ed embrionale (ERMS). Il RMS alveolare è associato ad una più spiccata tendenza alla disseminazione, necessita di un regime terapeutico più aggressivo e presenta una prognosi sfavorevole. Comprende circa il 20% dei casi ed è caratterizzato da traslocazioni cromosomiche specifiche, t(2;13)(q35;q14) e t(1;13)(p36;q14), le quali danno origine alle proteine di fusione PAX3/FKHR e PAX7/FKHR, rispettivamente. A differenza degli ARMS, i RMS embrionali costituiscono l 80% dei casi, sono più frequenti nei bambini più piccoli, sono associati a perdita di eterozigosi al locus 11p15.5, ma hanno una prognosi migliore. Attualmente, l analisi di alterazioni genetiche è usata per una corretta e rapida diagnosi dei RMS, anche se non sono ancora stati trovati fattori e biomarkers prognostici che possano essere utilizzati per incrementare la sopravvivenza dei pazienti. Recentemente è stata descritta l espressione delle chinasi ALK nei RMS, ma il suo ruolo rimane sconosciuto. ALK è un recettore tirosin-chinasico (RTK) descritto come proteina di fusione costitutivamente attiva NPM-ALK nei linfomi anaplastici (ALCL) e come proteina di membrana è espressa nei neuroni del sistema nervoso centrale e periferico durante lo sviluppo embrionale. Recentemente ALK è stato descritto anche in diversi tumori maligni, come nel glioblastoma e nel neuroblastoma frequentemente associato ad aberrazioni geniche quali amplificazioni o mutazioni puntiformi. ALK è costituito da una regione extracellulare in cui si legano i substrati, un dominio trans-membrana e un dominio chinasico catalitico. Come per altri RTK, l attivazione di ALK necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente, in cui i domini chinasici si fosforilano a vicenda e attivano vie di segnale critiche per la proliferazione e sopravvivenza cellulare, come MAPK ERK1/2 e PI3K AKT. I fattori di crescita che determinano la dimerizzazione e l attivazione di ALK sono ancora sconosciuti, anche se recentemente sono stati proposti pleiotropina (PTN) e midkine (MK) come possibili ligandi. 1

6 In questo studio, abbiamo valutato la rilevanza biologica e pre-clinica di ALK nei RMS, dal momento che è stato descritto per la prima volta in linee cellulari di RMS, ma la sua funzione non è mai stata studiata. L espressione di ALK è stata valutata in 9 linee cellulari di RMS, 4 ERMS e 5 ARMS, mediante Real Time PCR e western blotting, osservando che ALK è maggiormente espresso nelle linee di RMS alveolare che esprimono l oncogene PAX-FKHR. Tuttavia, ALK risulta inattivo nelle cellule di RMS, a differenza di NPM-ALK negli ALCL o di EML4- ALK in NSCLC, e per la sua attivazione necessita di una dimerizzazione ligandodipendente. I risultati ottenuti nel nostro laboratorio indicano però che PTN e MK non sono in grado di attivare ALK nelle linee cellulari di rabdomiosarcoma suggerendo meccanismi di regolazione diversi da quelli finora descritti. Infatti non si osservano né la fosforilazione a livello delle tirosine presenti nel sito chinasico né l attivazione delle vie di segnale. Per capire il ruolo di ALK, è stato quindi utilizzato un anticorpo monoclonale agonista (mab16-39) in grado di legarsi al dominio extracellulare di ALK e stimolarne la dimerizzazione. In queste condizioni, è stato possibile osservare un aumento della fosforilazione di ALK e di proteine implicate nei fenomeni di proliferazione e sopravvivenza cellulare tumorale (MAPK; PI3K/AKT). L inibizione di ALK determina una diminuzione della fosforilazione di ALK, e della trasduzione del segnale che risulta in un aumento della morte cellulare programmata (apoptosi). In conclusione il ruolo di ALK nei RMS rimane ancora largamente sconosciuto, anche se i nostri dati sembrano suggerire un ruolo importante di ALK nella tumorigenesi del RMS. 2

7 SUMMARY Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common pediatric soft-tissue sarcoma in childhood and arises as a consequence of regulatory disruption of the growth and differentiation pathways of myogenic precursor cells. RMS are divided in two main subgroups on the basis of histology: alveolar (ARMS) and embryonal (ERMS). ARMS, which is associated with a relatively high frequency of metastatic disease and needs an intensive therapeutic regimen, is the rhabdomyosarcoma subtype that carries the poorest prognosis. It comprises the 20% of patients and is characterized by specific chromosomal translocations, t(2;13)(q35;q14) and t(1;13)(p36;q14), that originate abnormally regulated fusion protein PAX3- and PAX7-FKHR, respectively. In contrast to ARMS, ERMS occurs at younger age, has a better prognosis and it is associated with an 11p15.5 loss of heterozygosity (LOH) and it comprises 80% of all RMS. Nowadays, the detection of genetic imbalances is used for a correct and rapid diagnosis of RMS subtypes, but prognostic biomarkers and factors that increase patient s survival are not known. Recently, expression of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) has been observed in RMS, but its role has not been investigated. ALK is a receptor tyrosine kinase (RTK) described as the constitutively active fusion protein in different tumors and, as membrane protein, in neurons of the central and peripheral nervous system at late embryonic stages. Recently ALK was also found in other malignant cancers, such as glioblastomas and neuroblastomas, associated to genetic aberrations, such as amplifications or point mutations. ALK has an extracellular ligand-binding region, a transmembranespanning domain and a kinase catalytic region. ALK is known to be activated through autoactivation in vitro, as the other RTK, in which ligands induce dimerization that results from conformational changes in the active site and lead to autophosphorylation with activated downstream signalling pathways, critical for cell proliferation and survival. However, the growth factor to enforce ALK dimerization and activation is still unknown, althought recently pleiotrophin (PTN) and midkine (MK) were proposed to be the physiological ligands. In this study we evaluated the biological and preclinical relevance of ALK in RMS, given that ALK has been originally described in RMS cell lines, but its function has not been studied. ALK expression was evaluated in 9 RMS cell lines, 4 ERMS and 5 ARMS, by Real Time PCR and western blotting, and we found 3

8 that ALK expression level is higher in alveolar RMS cells having PAX-FKHR gene. Furthermore no basal self-activation of ALK was detected, suggesting that ALK is constitutively inactive differently from the fusion protein NPM-ALK in ALCL or EML4-ALK in NSCLC, therefore its dimerization is ligand-dependent. Our data suggest that PTN and MK failed to activate ALK in RMS cell lines, indicating different regulatory mechanisms. In fact we do not observe neither tyrosine phosphorylation in kinasic domain of ALK or activation of the signalling pathways downstream of the receptor. To elucidate the role of ALK in RMS, we used an agonist monoclonal antibody (mab16-39) against the extracellular domain to induce dimerization. Stimulation of RMS cells markedly induces the phosphorylation of ALK and of proteins involved in cell proliferation and survival (MAPK; PI3K/AKT). ALK inhibition decreased tyrosine phosphorylation of ALK and of signalling pathways, which increased programmed cell death (apoptosis) and cell cycle arrest. In conclusion, ALK function is still unknown in RMS, althought our data suggest an important role in RMS tumorigenesis. 4

9 1.INTRODUZIONE 1.1 Il Rabdomiosarcoma I sarcomi dei tessuti molli costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie maligne, le quali insorgono da cellule mesenchimali primordiali che normalmente danno origine al tessuto muscolare, osseo, cartilagineo e fibroso. Questi tumori hanno un incidenza pari a 11 casi/anno/ di soggetti in età pediatrica e costituiscono la quinta neoplasia più comune, con una frequenza del 6,2% dopo le leucemie acute, i tumori del sistema nervoso centrale, i linfomi ed il neuroblastoma [1]. Oltre il 60% dei sarcomi dei tessuti molli è rappresentato dal rabdomiosarcoma (RMS) che costituisce, quindi, il più frequente sarcoma dei soggetti sotto i 15 anni d età e rappresenta il 3-5% delle neoplasie in età pediatrica, e circa l 1.2% dei sarcomi in età adulta [1]. Esso prende origine dal tessuto muscolare striato, ma talora può insorgere in tessuti mesenchimali in cui le fibre striate sono assenti, come ad esempio la parete vescicale. Esistono due picchi di incidenza, uno tra i 2 e i 5 anni d età ed un altro, tra gli 11 e i 15 anni di età. Il sesso maschile appare modestamente più colpito dalla neoplasia (rapporto maschi:femmine 1,4:1) [2]. Le localizzazioni principali sono il distretto testa-collo (35-40% dei casi), seguite dal tratto genito-urinario (20% dei casi) e meno frequente dal tronco e dagli arti (16% dei casi) [3]. La sede d insorgenza del tumore, la sua disseminazione e la presenza di metastasi determinano le caratteristiche di presentazione clinica dei RMS. La tumefazione, anche se non dolente, è il segno più comune in questo tipo di neoplasia. Circa il 20-30% dei casi presenta metastasi alla diagnosi e le sedi di maggior frequenza sono polmoni e sistema nervoso centrale (37%), linfonodi (35%), ossa (25%), fegato (16%), tessuti molli (95) e midollo osseo (7%) [2]. La precisa stadiazione dei RMS risulta molto importante e si avvale di tecniche di diagnostica per immagine, come TAC, RMN e scintigrafia ossea, e di analisi eseguite sui campioni operatori [4]. 1.2 Caratterizzazione isto-patologica Il rabdomiosarcoma venne descritto per la prima volta nel 1854, ma i vari sottotipi istologici furono riconosciuti più tardi. La classificazione attualmente in uso è 5

10 quella dell Intergroup Rhabdomyosarcoma Study Group (IRSG), gruppo statunitense, che considera i vari istotipi di RMS in 4 gruppi prognostici [5, 6]: - Prognosi favorevole: RMS botroide e a cellule fusate; - Prognosi intermedia: RMS embrionale (ERMS); - Prognosi sfavorevole: RMS alveolare (ARMS) e sarcoma indifferenziato; - Prognosi incerta: RMS con caratteristiche rabdoidi. I RMS embrionali rappresentano circa il 60-70% dei casi e sono caratterizzati da una morfologia simile al muscolo fetale con un lasso stroma mixoide e cellule a diverso stadio di differenziamento. Si osservano, infatti, un numero variabile di rabdomioblasti frammisti a cellule mesenchimali indifferenziate, a cellule con citoplasma allungato e nucleo eccentrico e a cellule con forma poligonale. Gli ERMS insorgono soprattutto nella regione genito-urinaria e nel tratto testa-collo e si manifestano con due diversi picchi di età: nel bambino di età inferiore ai 5 anni e nell adolescente [7]. I RMS alveolari costituiscono il 20% dei casi e sono così chiamati in quanto presentano una morfologia simile agli alveoli polmonari. Infatti si possono osservare setti connettivali fibrovascolari che separano gruppi di cellule neoplastiche che generalmente aderiscono al connettivo verso la periferia degli alveoli ed appaiono disgregate verso il centro. Esiste una variante morfologica chiamata solido-alveolare che appare costituita da aree solide e risulta sprovvista dei tipici aspetti alveolari. In questo caso la diagnosi si basa sullo studio di aspetti citologici (nuclei ipercromici, nucleoli evidenti e scarso citoplasma). Generalmente gli ARMS colpiscono adolescenti e giovani adulti e si localizzano maggiormente nel tronco e alle estremità [1]. Per quanto riguarda le varianti con minor frequenza (10%), si possono ritrovare quelle botrioidi, considerate un sottogruppo degli ERMS, e pleomorfiche che colpiscono gli adulti [1, 7]. Oggi i tumori con aspetti misti alveolari ed embrionali vengono classificati come ARMS se presentano anche una minima morfologia alveolare, mentre in passato venivano classificati in base alle aree quantitativamente predominanti [4]. L istologia, lo stadio ed il sito d insorgenza del tumore sono stati identificati come gli indicatori prognostici che influenzano più significativamente la sopravvivenza [3, 8]. In merito alla sede primaria, i siti con prognosi più favorevole sono testa e collo (escluse sedi parameningee), il tratto genito-urinario (esclusi vescica e 6

11 prostata) e il dotto biliare; tutte le altre sedi sono considerate a prognosi sfavorevole. La sopravvivenza a 5 anni è di circa il 73% per gli ERMS e il 48% per gli ARMS [7]; per gli ARMS metastatici si aggira attorno al 10-30% mentre per gli ERMS localizzati è di oltre il 95% [3, 7-10]. L ARMS si presenta spesso già metastatizzato alla diagnosi ed è caratterizzato da un andamento più aggressivo rispetto all embrionale con scarsa risposta alla terapia e con una prognosi peggiore [10]. 1.3 Alterazioni cromosomiche Negli ultimi anni, analisi molecolari e tecniche di citogenetica hanno dimostrato la presenza di alterazioni cromosomiche nei vari sottotipi di RMS. In particolare, gli ARMS sono caratterizzati in circa il 70-80% dei casi da specifiche traslocazioni cromosomiche reciproche [9, 11, 12] che coinvolgono il braccio lungo del cromosoma 13 ed il braccio lungo del cromosoma 2, t(2;13)(q35;q14), o il braccio corto del cromosoma 1, t(1;13)(p36;q14), che codificano per proteine chimeriche PAX3-FKHR (PAX3-FOXO1) e PAX7-FKHR (PAX7-FOXO1), rispettivamente (figura 1). Circa il 20-30% degli ARMS non presenta traslocazioni. L espressione della proteina di fusione PAX3-FKHR è associata ad una prognosi sfavorevole, soprattutto nei pazienti con metastasi. Infatti la sopravvivenza a 4 anni si aggira attorno all 8% rispetto al 75% dei tumori positivi per PAX7-FKHR [9]. Figura 1. Proteina di fusione PAX-FKHR. PAX è costituito da tre domini funzionali: il Paired Domain, Homeo-Domain e Transactivation Domain. La regione C-terminale è ricca in glicine, serine e treonine. FKHR presenta il dominio ForkHead per il legame al DNA, il dominio Transactivation e la regione C-terminale ricca in proline. La proteina di fusione PAX-FKHR (837 aminoacidi) presenta il dominio ForkHead tronco fuso con i domini Paired e Homeo- di PAX3. 7

12 I geni PAX3 e PAX7, appartengono alla famiglia dei geni regolatori PAX, e si trovano, rispettivamente, sui cromosomi 2 ed 1; sono caratterizzati da un dominio di legame al DNA, costituito da un Paired Domain e da un Homeodomain, ed un dominio di transattivazione (Transactivation Domain). Si ritiene che questi geni abbiano un ruolo sia nel controllo dello sviluppo embrionale che nel mantenimento dell espressione di geni tessuto specifici negli adulti. Il gene FKHR si trova sul cromosoma 13 ed appartiene alla famiglia dei fattori di trascrizione Forkhead. Esso presenta, come i geni PAX, un dominio di legame al DNA (Forkhead Domain) e un dominio di transattivazione. I punti di rottura di PAX3/PAX7 avvengono generalmente sul dominio di transattivazione, mentre quelli di FKHR avvengono nel dominio di legame al DNA [13]. La proteina di fusione PAX3/PAX7-FKHR contiene il Paired e l Homeo Domain derivanti da PAX3/7 ed il dominio di transattivazione di FKHR. In alcuni casi di rabdomiosarcoma alveolare sono state identificate altre proteine di fusione, le quali coinvolgono sempre PAX3, come ad esempio PAX3-NCOA1 [14, 15]. Le proteine di fusione PAX-FKHR sono fattori di trascrizione molto più potenti delle rispettive proteine wild-type, di circa volte [16]. Questo sembrerebbe dovuto ad un sito di attivazione ricco di proline presente all estremità carbossiterminale di FKHR che ne aumenterebbe l affinità di legame al gene causandone l over-espressione o la repressione [17]. Inoltre l attività oncogenica di PAX3-FKHR sembra dovuta, oltre ad un alterata regolazione dei geni target di PAX3, anche al legame a nuovi geni target [18, 19]. Tra i geni regolati da PAX- FKHR troviamo MYCN, MYOD1, FOXF1, KCNN3, IGFBP3, GADD45A, i quali sono implicati nello sviluppo del sistema nervoso, muscolare e nella regolazione della trascrizione [20, 21]. Inoltre questa famiglia di proteine risulta coinvolta nella proliferazione e nella sopravvivenza cellulare, nell angiogenesi e nell attivazione di molti altri segnali [22]. Nei RMS sono state descritte altre traslocazioni cromosomiche meno frequenti, come t(2;8)(q37;q13), t(2;2)(q35;p23) da cui si originano le proteine di fusione PAX3-NCOA2 e PAX3-NCOA1, rispettivamente [14, 23, 24]. Circa il 94% degli ERMS presentano una regione di almeno 15 mb con perdita di eterozigosità (LOH, Loss Of Heterozigosity), il cui grado dipende strettamente dal sottotipo istologico [25]. Infatti i rabdomiosarcomi embrionali mostrano un cariotipo più complesso della controparte alveolare che risulta dalla forte 8

13 instabilità genomica che li caratterizza [26]. Le regioni più frequenti di LOH sono situate nel cromosoma 11, sia sul braccio lungo che corto. A lungo si è considerato la perdità di eterozigosità al 11p15.5 come marker per la diagnosi degli ERMS [27-29], sebbene, recenti studi abbiano ormai evidenziato che questo sito di LOH sia presente anche nel 77% degli ARMS non traslocati e nel 24% di quelli traslocati [25]. Tale regione include i geni H19, IGF2 e CDKN1C e gli ERMS, infatti, presentano frequentemente la perdita dell allele materno di IGF2 (per silenziamento), e duplicazione di quello paterno in quella che è conosciuta come disomia uniparentale [29, 30]. IGF2 viene sovraespresso quindi per la perdita di imprinting (LOI, Loss Of Imprinting) che risulta dall espressione biallelica paterna del gene [31, 32]. Sono state trovate altre regioni di LOH nei RMS, come ad esempio: il locus 9q22 che include il gene PTCH1 nel 30% degli ERMS, la regione 4q soprattutto nei rabdomiosarcomi alveolari con traslocazione t(2;13), e la regione 8q in quelli non traslocati [25]. Inoltre, nei RMS alveolari ed embrionali risulta frequente l amplificazione della regione 2p24. Questo comporta la sovra-espressione dell oncogene MYCN, che è un marcatore prognostico sfavorevole soprattutto negli ARMS [33, 34]. Infine anche la regione 12q13 può essere interessata da amplificazione dei geni SAS, CDK4 e GLI [35, 36], così come sono state riscontrate mutazioni puntiformi degli oncogeni K-RAS ed N-RAS e la sovraespressione di MET [22, 37]. 1.4 ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase) è un recettore tirosin chinasico (RTK) ampiamente descritto nei linfomi anaplastici a grandi cellule (ALCL) come proteina di fusione (NPM-ALK), ed è espresso nel sistema nervoso centrale durante lo sviluppo embrionale [38]. La sua espressione nei tessuti umani diminuisce durante la gestazione ed alla nascita risulta debolmente espresso solo nelle cellule nervose ed endoteliali, nelle quali forse ha un ruolo nello sviluppo e differenziazione cellulare [39]. Evidenze per il suo ruolo essenziale nello sviluppo del mesoderma e del sistema nervoso sono state riportate anche in Drosophila (DAlk) [40]. Recentemente è stato dimostrata la sua espressione in numerosi tumori solidi come neuroblastoma e glioblastoma e, come altri recettori ad attività chinasica, esso può andare incontro a traslocazioni cromosomiche reciproche. Le 9

14 più studiate sono la traslocazione t(2;5)(p23;q35) negli ALCL da cui origina la proteina di fusione NPM-ALK [41, 42], le traslocazioni t(1;2)(q25;p23), t(2;3)(p23;q21) e le inversioni cromosomiche inv(2)(p21;p23) e inv(2)(p23;q35), che danno origine rispettivamente ai prodotti di fusione TPM3-ALK, TFG-ALK, ATIC-ALK e EML4-ALK [43, 44]. 1.5 Struttura di ALK ALK è un recettore tirosin-chinasico appartenente alla super famiglia dei recettori chinasici insulino simili (IRK), codificato da un locus che si trova nel cromosoma 2p23 [45] (figura 2). Esiste un omologia dell 85% tra ALK umano e ALK murino e del 34% tra quello umano e DAlk, indicando che i recettori tirosin-chinasici sono altamente conservati tra le specie. Figura 2. Localizzazione di ALK nel cromosoma 2. Il gene che codifica ALK è localizzato sul locus p23 del cromosoma 2 ed è costituito da 6226bp. La proteina è costituita da una regione extracellulare che comprende il sito di legame per i fattori di crescita, una regione transmembrana, e una regione intracitoplasmatica con sito catalitico. Il dominio extracellulare presenta forte omologia con il recettore LTK (Leukocyte Tyrosin Kinase) [46] e per questo viene inserito nella superfamiglia IRK, la quale comprende anche IGF-1R (Insulin Growth-1 Receptor), MET, cros e i recettori neurotrofici [47-49]. Come per alcuni RTK, l attivazione di ALK necessita una dimerizzazione ligandodipendente e di una fosforilazione in trans dei due monomeri (crossfosforilazione), per stimolare la trasduzione del segnale dal citoplasma al nucleo (figura 3). 10

15 Figura 3. Schema dell attivazione dei recettori tirosin-chinasici (RTK). L interazione del ligando con il recettore determina la dimerizzazione e la fosforilazione dei domini chinasici (cross-fosforilazione). In questo modo le proteine intracellulari si legano e vengono fosforilate dal recettore stesso. Il gene ALK è costituito da 6226bp e codifica per una proteina di 177kDa, la quale, in seguito a N-glicosilazione, diventa di circa 200kDa [42, 50]. Il recettore ALK è costituito da 1620 aminoacidi, di cui 1030 formano il dominio extracellulare, 28 il dominio transmembrana, 64 quello juxtamembrana, e 562 aminoacidi costituiscono la porzione intracitoplasmatica (figura 4). In particolare, il dominio extracellulare presenta: - 26 aminoacidi idrofobici all N-terminale; - il sito di legame per le molecole che attivano ALK (regione ); - 16 siti di N-glicosilazione (Asn-X-Ser/Thr); - un dominio LDL-A (lipoproteine a bassa densità di classe A) la cui funzione è ignota; - un dominio MAM (Meprin, A5, Mu) che media le interazioni tra cellule; - una regione ricca in glicine. Figura 4. Struttura proteica di ALK. La regione extracellulare all estremità N- terminale presenta 2 domini MAM (aminoacidi e ), un dominio LDL (aminoacidi ) ed un dominio ricco in glicine (aminoacidi ). Il dominio transmembrana TM (aminoacidi ) connette i domini extra- ed intra- cellulari. Il dominio intracitoplasmatico contiene un dominio juxtamembrana (aminoacidi ) ed il dominio catalitico tirosin-chinasico (aminoacidi ). (Rif. Azarova A.M. et al. Emerging importance of ALK in neuroblastoma. Seminars in Cancer Biology (2011) 21: ). 11

16 Il dominio catalitico tirosin-chinasico (aminoacidi ) presenta una regione conservata di 3 tirosine YXXXYY (A-loop: sito di attivazione, che presenta Tyr1278, Tyr1282, Tyr1283) che regola l attività catalitica [51], e molti altri siti di fosforilazione localizzati sia nel dominio juxtamembrana (aminoacidi ) che all interno del dominio citoplasmatico (aminoacidi ), che consentono il legame di fattori coinvolti nella trasmissione del segnale, come IRS-1 (Insulin Receptor Substrate-1) e SHC (Src homology domain) [51]. Recentemente la struttura della tasca chinasica di ALK è stata studiata mediante cristallografia a raggi X [52, 53] ed è emerso che esso possiede caratteristiche tipiche delle tirosin-chinasi (figura 5A). Infatti è costituito da un lobo NT (Nterminale) connesso tramite una regione a cerniera al lobo CT (C-terminale). Il primo lobo è ricco in foglietti β antiparalleli, mentre il secondo è caratterizzato da 8 eliche e due foglietti β. Il sito catalitico (residui ) è posizionato tra l elica αe ed il primo foglietto β del lobo CT. ALK e IGF1RK/IRK presentano una elevata omologia di sequenza nel sito di attivazione (A-loop) e la loro attività catalitica è correlata al grado di fosforilazione dei residui tirosinici [54]. I recenti studi di cristallografia [52, 53], hanno dimostrato che ALK, a differenza degli altri RTK, presenta una specificità di legame per una determinata sequenza dei ligandi [55] e che la tirosina in posizione 1278 risulta essere il sito preferenziale di fosforilazione, nonché il sito critico per la sua attivazione e attività trasformante [56]. Per l attivazione di IGF1RK/IRK, invece, sono necessarie la fosforilazione della seconda e terza tirosina della regione YXXXYY (Tyr 1135 e 1136 rispettivamente). Quindi la fosforilazione delle Tyr 1135 e 1278 risulta critica proprio perché tali residui sono implicati nei meccanismi che regolano l attivazione dei recettori. 12

17 A B Figura 5. Struttura tridimensionale di ALK e sito catalitico. A, struttura tridimensionale di ALK in due orientamenti ortogonali. In blu è riportato il lobo CT, in giallo la regione a cerniera, il loop di attivazione in rosso, in porpora l elica αc, in arancione 5 foglietti-β anti-paralleli, NT: estremità N-terminale, CT: estermità C- terminale. B, allineamento della regione catalitica di IGF1RK/IRK e ALK. (Rif. Lee C.C. et al. Crystal structure of the ALK catalytic domain. Biochem Journal (2010) 430, ) 1.6 Funzione di ALK Recenti studi hanno dimostrato che la maggior espressione di ALK è nel sistema nervoso centrale e periferico [51, 57] durante la gestazione, mentre i livelli di trascritto (mrna) e quelli proteici sono quasi nulli durante la crescita e lo sviluppo post-natale [57, 58]. Studi di espressione in Drosophila e topo hanno confermato la maggior localizzazione di ALK nel sistema nervoso, in particolare nel talamo, ipotalamo e bulbo olfattivo [57, 58]. Più recentemente è stato dimostrato che ALK è espresso anche a livello del nervo ottico, retina, lingua, testicoli e ovaio di topo, così come a livello del mesoderma e muscolatura del tratto digestivo in Drosophila [40, 59, 60]. Sulla base di queste osservazioni, è stato ipotizzato un ruolo nello sviluppo e nella funzionalità del sistema nervoso, anche se topi knockout per ALK non hanno evidenziato particolari alterazioni durante lo sviluppo di questo sistema [61]. Questa ipotesi, però, risulta ancora controversa, visti i recenti studi che dimostrano un ruolo inibitorio di ALK nella differenziazione neuronale in 13

18 C.elegans [62]. La mancata alterazione nello sviluppo dei neuroni di topi knockout per ALK, hanno fatto ipotizzare che ALK possa essere un recettore dipendente [63], e che quindi la sua attivazione richieda la presenza di specifici ligandi: nello stato inattivo, ALK sarebbe in grado di indurre apoptosi mediante clivaggio caspasi-dipendente dell acido aspartico presente in posizione 1160, mentre in presenza dei ligandi, e quindi nello stato attivo, sarebbe in grado di inibirla [64]. Ulteriori studi devono essere fatti per capire sia i meccanismi che regolano questo tipo di attivazione sia le conseguenze a livello fisiologico e a livello dello sviluppo embrionale. Le ipotesi relative all attivazione di ALK sono molteplici, dal momento che è stato riportato che possa essere un recettore per i fattori neurotrofici [49] o che possa fungere da ligando per se stesso, vista la presenza di un motivo simile a quello presente nel fattore di crescita epiteliale (EGF) nel proprio dominio extracellulare. Recentemente, sono stati eseguiti una serie di studi su pleiotropina (PTN) e midkine (MK), dal momento che la loro espressione risulta concomitante e delimitata nelle stesse regioni di ALK durante lo sviluppo embrionale [65, 66]. PTN e MK sono fattori di crescita che legano l eparina (heparin-binding growth factors) e sono coinvolte sia nello sviluppo dei neuroni che nell induzione dell angiogenesi e mitosi in diverse modelli cellulari [67-70]. Tramite studi di marcatura con 32 [P], è stato dimostrato, infatti, che PTN e MK sono in grado di legare la stessa regione del dominio extracellulare di ALK, causandone la fosforilazione e l attivazione [66, 69]. Le due molecole, inoltre, sono in grado di attivare diversi segnali intracellulari, portando così alla conclusione che NPM- ALK svolga, un importante attività anti-apoptotica e trasformante, coinvolgendo l attivazione di STAT3, PI3K/AKT, RAS/ERK (figura 6) [71-73]. Questi pathways sono generalmente up-regolati in linee cellulari trasformate [74] e uno studio recente ha dimostrato come l inibizione selettiva dell espressione di STAT3 in linee cellulari di ALCL ALK-positive induca rapidamente l apoptosi e l arresto del ciclo cellulare, con concomitante riduzione dell espressione di proteine anti-apoptotiche come Bcl-2, Bcl-xl e mcl-1, evidenziando così l attività anti-apoptotica di ALK [75]. Nonostante recenti evidenze del legame di PTN e MK ad ALK, esistono molti dubbi sulla capacità di attivare direttamente questo recettore, in quanto studi successivi hanno riportato la mancata attivazione di ALK dopo stimolazione con 14

19 PTN in diverse linee cellulari [76, 77] sottolineando, così, l esigenza di ulteriori approfondimenti a riguardo. Nel 2007 infatti è stato proposto un meccanismo indiretto di attivazione di ALK tramite PTN, che andrebbe a coinvolgere il recettore RPTPβ/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase ζ), il quale normalmente determina la defosforilazione dei siti di attivazione di ALK. Il legame di PTN a questo recettore inibirebbe la defosforilazione di ALK causandone, quindi, l attivazione [78]. Figura 6. Pathways attivati da ALK. Le vie di segnale possono essere attivate dal legame con specifiche molecole, amplificazione genica o mutazioni. PTN:pleiotropina; MK: midkine; RPTPβ/ζ: receptor protein tyrosine phosphatase ζ. (Rif. Azarova A.M. et al. Emerging importance of ALK in neuroblastoma. Seminars in Cancer Biology (2011) 21: ). 1.7 Espressione di ALK nei tumori ALK è stato descritto per la prima volta nella linea cellulare di ARMS, RH30 [41, 42, 57] e successivamente la sua espressione è stata riportata in diversi istotipi tumorali [79, 80], compreso neuroblastoma [50, 76], glioblastoma [81, 82], melanoma e carcinoma mammario [76, 77]. Lamant et al. nel 2000 hanno osservato l espressione di ALK in circa il 92% di casi di neuroblastoma, senza però poter correlare l espressione proteica con la prognosi della malattia [50]. Studi successivi hanno supportato queste osservazioni senza però capirne il significato [76]. Negli ultimi anni, tuttavia, l importanza del ruolo di ALK nello sviluppo tumorale, è stata dimostrata nel glioblastoma e nel medulloblastoma in cui ALK è sensibile alla stimolazione con PTN e MK e la sua inibizione causa arresto del ciclo cellulare ed apoptosi [66, 81]. 15

20 Più recentemente è stata riportata l espressione di CLTC ALK in un gruppo di linfomi non Hodgkin (NHL) con prognosi infausta [83]. Il suo ruolo non è ancora chiaro, nonostante negli ALCL, un gruppo di NHL, sia stata largamente descritta la proteina di fusione NPM-ALK in circa l 85% dei casi. 1.8 Proteine di fusione Molti recettori tirosin-chinasici sono implicati nell oncogenesi di neoplasie, in quanto soggetti a diverse alterazioni genetiche, come amplificazioni, traslocazioni reciproche o mutazioni puntiformi, che causano una deregolazione dei siti catalitici e l attivazione di una serie di segnali legati all induzione della trasformazione e proliferazione cellulare e alla resistenza alla terapia [84]. Le traslocazioni cromosomiche che coinvolgono ALK portano alla formazione di proteine di fusione che presentano il dominio intracitoplasmatico di ALK (aminoacidi ), incluso il sito catalitico, e condividono alcune caratteristiche comuni (figura 7): - la proteina di fusione all N-terminale presenta un dominio di oligomerizzazione; - il partner genico all N-terminale controlla l espressione costitutiva della proteina chimerica. Figura 7. Proteine di fusione che coinvolgono ALK. Sono riportate alcune traslocazioni cromosomiche che generano proteine di fusione, le loro frequenze nei linfomi anaplastici a grandi cellule (ALCL) e nei tumori miofibroblastici infiammatori (IMT) e la loro localizzazione subcellulare basata su saggi di immunoistochimica. N: localizzazione nucleare, C: localizzazione citoplasmatica, NM: membrana nucleare. (Rif. Li R. et al. Development of Anaplastic Lymphoma Kinase small-molecule inhibitors for cancer therapy. Medinal Research Reviews. 2008, 28(3):

21 La proteina di fusione maggiormente descritta è NPM-ALK, espressa in circa l 85% dei linfomi ALCL ALK +. Esso origina dalla traslocazione t(2;5)(p23;q35) ed il clonaggio dei punti di rottura dei due cromosomi ha permesso di identificare i due geni coinvolti in tale riarrangiamento cromosomico: NPM (nucleophosmin o B23) sul cromosoma 5, ed ALK sul cromosoma 2. Il gene di fusione risultante esprime una proteina di circa 80 kda, ad attività tirosin-chinasica (NPM- ALK/p80) e a localizzazione citoplasmatica e nucleare [41, 42]. Nel restante 15% degli ALCL ALK-positivi la proteina di fusione e localizzata esclusivamente nel citoplasma. Analisi citogenetiche più approfondite hanno però rivelato in questi restanti casi la presenza di aberrazioni cromosomiche differenti dalla t(2;5). Quelle più frequenti e meglio caratterizzate molecolarmente, quali t(1;2)(q25;p23), t(2;3)(p23;q21) e inv(2)(p23q35), danno origine rispettivamente ai prodotti di fusione TPM3-ALK, TFG-ALK ed ATIC-ALK [43, 44, 85]. TPM3- ALK è associato anche ai tumori miofibroblastici infiammatori (IMT, Inflammatory Myofibroblast Tumor), i quali possono presentare altre proteine di fusione come CARS-ALK e CLCT-ALK. Questi tumori presentano un origine mesenchimale, hanno tendenza a metastatizzare con scarsa risposta alla chemio- o radioterapia [86]. Recentemente nei tumori ai polmoni NSCLC (Non Small Cell Lung Cancer) è stata identificata una nuova proteina di fusione, EML4-ALK, la cui frequenza è di circa il 3% nei pazienti affetti da questo tipo di neoplasia. La capacità trasformante di questa proteina chimerica è stata dimostrata sia in vitro che in modelli murini, mentre la sua inibizione induce blocco del ciclo cellulare ed apoptosi [87]. E stato dimostrato che pazienti con NSCLC ALK + rispondono a Crizotinib, inibitore specifico di ALK, e mostrano una sopravvivenza libera da malattia a 6 mesi del 72% rispetto a pazienti con NSCLC ALK - (33%) [88]. Crizotinib si trova in fase II di sperimentazione clinica ed in letteratura si trovano diversi articoli riguardo la sua efficacia in vitro in altri istotipi tumorali [89]. 1.9 Mutazioni di ALK L espressione di ALK è stata riportata in diverse linee cellulari di neuroblastoma [50] e lo studio delle mutazioni somatiche ed ereditarie o delle amplificazioni in questo tipo di tumore, è importante per lo sviluppo di terapie mirate. E stato 17

22 riportato che in circa il 50% dei casi di neuroblastoma ereditario, ALK presenta mutazioni nel dominio catalitico. Mediante sequenziamento sono state individuate 3 mutazioni in ALK: R1275Q, R1192P, G1128A. La prima mutazione risulta essere la più frequente [90, 91] e si trova in una regione fortemente associata a mutazioni attivanti osservate in diverse proteine oncogene, come BRAF [92]. Analogamente, mutazioni somatiche sono state identificate all interno del dominio catalitico in campioni di neuroblastoma primario, e quelle più frequenti sono risultate essere R1275Q e F1174L. In presenza di queste mutazioni, l attivazione di ALK non richiede la dimerizzazione del recettore, che viene fosforilato in maniera autonoma. La capacità trasformante dei mutanti di ALK è stata dimostrata sia in topi nudi che in linee cellulari [93, 94], e come atteso il silenziamento di ALK causa l inibizione della proliferazione cellulare ed apoptosi [93, 95]. In particolare, ALK F1174L è caratterizzato da una maggior capacità trasformante rispetto ad ALK R1275Q [77], e frequentemente è espresso in tumori che presentano anche amplificazione del gene MYCN. L associazione di queste due alterazioni genetiche risulta fortemente correlata ad una prognosi infausta, come recentemente riportato [77]. Inoltre ALK-F1174L è associato a chemioresistenza in pazienti con neuroblastoma, e ciò fa ipotizzare un ruolo critico di tale mutazione nell oncogenesi del tumore [96]. Studi recenti hanno dimostrato che l amplificazione, o l aumento del numero di copie del gene di ALK sono nella maggior parte dei casi associati all amplificazione del gene MYCN [77, 97] e a prognosi infausta, anche se il significato funzionale di tale anomalia rimane ancora ignoto [77]. Passoni et al. hanno descritto una sovraespressione di ALK wild-type, in linee cellulari ed in campioni di neuroblastoma, che sembra indipendente da amplificazioni geniche o da mutazioni del dominio chinasico [98]. L espressione di ALK sembra correlare, inoltre, al suo stato di attivazione nelle linee cellulari IMR32 che presentano alti livelli del recettore, ma non nelle linee NB5 che non esprimono ALK. I trattamenti con inibitori dell attività chinasica di ALK, CEP e CEP-14513, determinano una inibizione della proliferazione dosedipendente ed un aumento della morte cellulare, in linee che sovraesprimono ALK. Il fatto che le mutazioni di ALK abbiano un ruolo nei neuroblastomi ereditari e sporadici, pone questo recettore come un futuro target per nuove t 18

23 1.10 Inibitori di ALK Negli ultimi anni sono state sviluppate diverse molecole in grado di bloccare la proliferazione tumorale dipendente dall attivazione costitutiva di ALK, concentrando gli sforzi sull inibizione dell attività chinasica ed in particolare del sito di legame dell ATP nel dominio catalitico. Il primo inibitore di ALK ad entrare nei trial clinici è il Crizotinib (PF , Pfizer), un derivato della 2,4-pirimidindiammina in grado di competere con l ATP, nel sito di legame di ALK e c-met [99] (figura 8). E stata dimostrata la sua potente attività antiproliferativa in linee cellulari ALCL (Karpas-299, SU- DHL-1, IC e 43nM rispettivamente), la quale risulta correlata all inibizione della fosforilazione di NPM-ALK. In cellule di ALCL, Crizotinib induce un blocco del ciclo cellulare e causa morte cellulare in seguito all inibizione di NPM- ALK [89]. La sua efficacia è stata dimostrata anche in topi SCID in cui sono state inoculate cellule di ALCL umano, determinando una diminuzione della proliferazione cellulare ed una completa regressione del tumore entro i primi 15 giorni di trattamento (100mg/kg/giorno) [89]. Il Crizotinib, inoltre, è in grado di inibire la crescita in linee cellulari di neuroblastoma e NSCLC, in particolare, nelle cellule che presentano amplificazione del gene di ALK o la mutazione R1275Q [100]. I tumori che presentano la mutazione F1174L risultano, invece, resistenti al Crizotinib, ma rispondono meglio al TAE684 (5-cloro-2,4 diamminofenilpirimidina) [101]. Gli effetti indesiderati nel trattamento con Crizotinib comprendono nausea, vomito, diarrea e disturbi alla vista, mentre quelli più severi, come alti livelli di transaminasi, sono poco frequenti e reversibili [88]. 19

24 Figura 8. Strutture chimiche di alcuni inibitori di ALK. (Rif. Ardini E. et al., Anaplastic lymphoma kinase: role in specific tumors, and development of small molecule inhibitors for cancer therapy. Cancer Letters 2010). Un altro inibitore di uso clinico è NVP-TAE684 (Novartis Pharma) (figura 8), il quale inibisce sia la proliferazione nelle linee cellulari di ALCL (Karpas-299 e SU-DHL-1 con IC 50 di 2-5 nm) che la fosforilazione di NPM-ALK in modo dosedipendente [102]. Questa molecola è stata testata in oltre 602 linee cellulari tumorali e si è dimostrata efficace anche in quelle di neuroblastoma e NSCLC che esprimono la proteina ALK o le varianti tronche di essa [100]. GSK A è un potente inibitore competitivo di ALK e IGF-1R che presenta una IC 50 di 0.5 e 1.6nM, rispettivamente (figura 8). E in grado di inibire la crescita tumorale in diversi modelli cellulari, come SUP-M2, SU-DHL-1, Karpas- 299, SR-786, L-82 (linee cellulari ALCL) e in NCI-H2228 (linee cellulari NSCLC) ed, inoltre, è stata dimostrata la completa regressione tumorale in topi SCID in circa 21 giorni di trattamento con una dose di 60mg/kg/giorno [103]. Attualmente sono in studio inibitori di ALK di seconda generazione, come i derivati della tetraidropirido-pirazina, che presentano un alta selettività per ALK ed una IC 50 compresa tra 10 e 15nM [104, 105]. Tra questi, CMPD 13, derivato della 2,4-diarilamminopirimidina, inibisce totalmente l attività di NPM-ALK sia in vitro che in vivo, ed induce tossicità nelle linee cellulari EML4-ALK + di NSCLC e nelle linee NB-1 di neuroblastoma che presentano amplificazione del recettore ALK [106]. 20

25 Tuttavia, recentemente sono stati riportati casi di farmaco-resistenza agli inibitori di ALK, a causa dell insorgenza di mutazioni secondarie durante la terapia [107, 108]. Queste mutazioni sono state riscontrate sia in pazienti affetti da NSCLC EML4-ALK + sia in pazienti con tumore miofibroblastico di tipo infiammatorio (IMT) con traslocazione t(2;2)(p23;q11-13) [108]. 21

26 2. SCOPO DELLA TESI Scopo della tesi è l analisi dello stato di espressione ed attività del recettore tirosin-chinasico ALK in linee cellulari di rabdomiosarcoma pediatrico, analogamente a quanto già osservato in altri tumori pediatrici (neuroblastoma, glioblastoma e melanoma) [61]. I pochi dati finora disponibili suggeriscono che ALK è espresso in cellule di rabdomiosarcoma, più frequentemente nel sottotipo alveolare che in quello embrionale, ma la sua rilevanza biologica e i meccanismi che regolano la sua attivazione e attività non sono ancora noti. Lo studio si propone quindi di analizzare, unitamente all espressione ed all attività di ALK, i meccanismi di attivazione, mediante l uso di specifiche molecole attivanti o inibitorie. Tali molecole sembrano implicate nella proliferazione e sopravvivenza cellulare dei modelli tumorali che esprimono ALK, attraverso la stimolazione o l inibizione dell attività chinasica del recettore. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato pleiotropina (PTN) e midkine (MK), quali ligandi putativi di ALK, whip-154, inibitore di ALK, e mab16-39, un anticorpo monoclonale agonista in grado di stimolare l auto-fosforilazione del recettore ALK e la trasduzione di segnali critici per la sopravvivenza e proliferazione della cellula trasformata [65, 66, 109, 110]. Particolare attenzione è stata posta all individuazione di molecole in grado di bloccare la proliferazione delle cellule di rabdomiosarcoma attraverso l inibizione specifica del recettore ALK, per poter sviluppare strategie terapeutiche in grado di migliorare la sopravvivenza dei pazienti affetti da rabdomiosarcoma pediatrico. 22

27 3.MATERIALI E METODI 3.1 Colture cellulari In questo studio sono state utilizzate 5 linee cellulari umane di rabdomiosarcoma alveolare (RH30, RH28, RH18, RH4, RC2), 4 linee di rabdomiosarcoma embrionale (RD, CCA, SMS-CTR e RH36), 2 linee di neuroblastoma (LAN5, IMR32), 1 di linfoma anaplastico a grandi cellule (Karpas-299), 3 linee di leucemia (K562, DG75, CEM). Le cellule sono state mantenute in coltura con RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, UK) addizionato di glutammina (2mM), penicillina (100U/ml) e streptomicina (100ug/ml), 10% FCS inattivato, a 37 C e 5% di CO Reagenti ed anticorpi Il sale di tetrazolio MTT, 3,(4,4-dimetiltiazolo)-2,5 difenil-tetrazolo bromuro, è stato acquistato da SIGMA (Sigma-Aldrich, USA). I reagenti per la quantificazione proteica (BCA TM protein quantitation assay) sono stati acquistati da Pierce (Pierce Chemical Co., USA), come la soluzione chemiluminescente impiegata per la determinazione delle proteine sulle membrane di nitrocellulosa e PVDF, le quali sono state acquistate da Schleicher & Schuell. Gli anticorpi anti-alk sono stati acquistati da Invitrogen (Invitrogen Corp., USA) o forniti gentilmente dal Prof. Falini dell Università di Perugia; gli anticorpi antiphosphoalk, anti-erk1/2, anti-phosphoerk1/2, anti-phosphostat3 (Y705), anti-akt, anti-phosphoakt, anti-jnk, anti-parp, anti-ciclina D3 sono stati acquistati da Cell Signaling (Cell Signaling Technology Inc., USA). L anticorpo anti-β-actina, anti-bcl2 sono stati acquistati da Santa Cruz (Santa Cruz Biotechnology, USA), mentre anti-hsp90 (clone 9D2) e anti-hsp70 da Stressgen (Stressgen, USA). Gli anticorpi secondari perossidati sheep anti-mouse e donkey anti-rabbit sono stati acquistati da GE Healthcare (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Svezia), così come protein G-Sepharose Fast Flow TM. La pleiotropina (0.5 mg/ml in PBS 1x), midkine (0.5 mg/ml in PBS 1x) e 17- DMAG (20 mm in DMSO) sono stati acquistati da Alexis (Alexis, AXXORA Life Science, USA); whi-p-154 (25mM in DMSO) da Calbiochem (Calbiochem, Merck, Germania), mentre l anticorpo monoclonale mab16-39 (0.1 mg/ml in acqua distillata) è stato concesso gentilmente dal Dr. Yamamoto dell Università di Tokio. 23

28 Tutti gli altri reagenti sono stati acquistati da Sigma (Sigma-Aldrich, USA). 3.3 Saggio di citotossicità con MTT Il saggio con MTT, 3,(4,4-dimetiltiazolo)-2,5 difenil-tetrazolo bromuro, ha lo scopo di valutare la capacità da parte delle cellule vitali di convertire, nella sua forma ridotta, il sale di tetrazolio giallo in un precipitato viola insolubile di formazano. La reazione di riduzione è attribuita all attività glicolitica mitocondriale ed è un processo dipendente dalla presenza di NADH e NADPH. Nelle cellule in attiva proliferazione la conversione di MTT nella sua forma ridotta è rilevabile tramite lettura spettrofotometrica ad una lunghezza d onda di 540nm. Questo saggio è impiegato per la valutazione del tasso di proliferazione cellulare, visto che la quantità di formazano che si forma in seguito alla reazione mitocondriale è proporzionale al numero di cellule sane e vitali nella popolazione esaminata. Per valutare la riduzione mitocondriale dell MTT, le cellule sono state seminate in piastre a 96 pozzetti ad una concentrazione opportuna in volume di 100µl, a cui sono stati aggiunti 100µl di una soluzione di whi-p-154 a concentrazione 1, 5, 20 o 50µM finali o una soluzione di mab16-39 a concentrazioni di 0.1, 0.25, 0.5, 1µg/ml. Le cellule di controllo sono state mantenute in presenza di DMSO per escludere ogni possibile tossicità attribuibile al solvente. Le piastre sono state incubate a 37 C, e ad intervalli di 24 ore è stato aggiunto ad ogni pozzetto un volume pari a 20µl di una soluzione di 5 mg/ml MTT. Le piastre sono state incubate per 4 h a 37 C, per permettere l incorporazione e la riduzione del sale di tetrazolio, centrifugate per 5 min. a 1200 rpm e risospese in 150µl di DMSO, per favorire la solubilizzazione dei cristalli di formazano. Le piastre sono state quindi lasciate agitare per 30 minuti e quindi lette ad una lunghezza d onda di 540nm (Victor 3 Multilabel Counter, PerkinElmer). Nei grafici vengono riportati i valori medi di assorbanza di tre diversi esperimenti o i rapporti tra i valori di assorbanza delle cellule mantenute in presenza ed in assenza di whi-p-154 (A/A0: [A]/[A]ctr) che corrispondono alle medie di tre esperimenti indipendenti. 24

29 3.4. Immunoblotting Le cellule sono state seminate ad una opportuna concentrazione su piastre Petri da 60 o 100mm e successivamente trattate, con 17-DMAG (1µM), pleiotropina (5-100ng/ml), midkine(1-100ng/ml), mab16-39 (0.1-1µg/ml) e whi-p-154 (5-50µM). Le cellule sono state lisate dopo abbondante lavaggio in PBS 1x e risospese in µl di buffer di lisi (Tris-HCl 10mM, ph 7.5; NaCl 130mM; 1% TritonX-100; EDTA 5mM; BSA 1mg/ml; sodio fosfato 20mM, ph 7.5; sodio pirofosfato 10mM, ph 7.0; glicerofosfato 25mM; sodio ortovanadato 1mM; sodio molibdato 10mM; aprotinina 20µg/ml; leupeptina 20µg/ml; PMSF 1mM) ed incubate in ghiaccio per 20 minuti. I lisati cellulari sono stati poi purificati mediante centrifugazione a 4 C (14.000rpm per 30 min). Il surnatante rappresenta il pool proteico cellulare rappresentativo sia della frazione citosolica che di quella nucleare solubile. La concentrazione proteica è stata determinata mediante saggio colorimetrico con BCA (acido bicinconinico), lettura spettrofotometrica a 540nm, utilizzando l albumina sierica bovina (2 mg/ml BSA) come standard di riferimento. Una volta determinate le concentrazioni proteiche dei campioni, i lisati proteici (la quantità di lisato proteico è indicato nelle figure), diluiti in soluzione riducente RLB (Reducing Loading Buffer: DTT 77µg/ml; 1g/ml SDS; 50% glicerolo; 40% Tris-HCl 1M ph 6.8), sono stati separati su gel di poliacrilamide (8-12% SDS-PAGE). In condizioni denaturanti riducenti infatti, le proteine contenute negli estratti si separano lungo il gel esclusivamente in base al loro peso molecolare, indipendentemente dalla loro carica o conformazione, e proprio grazie a questo possono essere identificate. Le proteine sono state poi trasferite over-night su membrana di nitrocellulosa mantenendo all interno della camera di trasferimento temperatura (4 C) e voltaggio (50V) costanti. Le proteine cariche negativamente, per migrazione in presenza di un campo elettrico, vengono trasferite su una membrana di nitrocellulosa o PVDF, successivamente saturata in una soluzione bloccante di latte deidratato privo di grassi al 5% (2 h) per evitare il legame aspecifico dell anticorpo con la superficie porosa della membrana. La membrana è stata quindi lasciata ibridare con l anticorpo specifico diretto contro la proteina di interesse, diluito opportunamente in una soluzione di latte deidratato (Antibody Solution costituita da 2.5% latte deidratato privo di grassi), per 1 h e 30 min. seguita da abbondanti lavaggi in TNE 1x, per eliminare l eccesso di anticorpo non 25

30 legatosi con la proteina. Per l individuazione della proteina è stato poi impiegato il metodo della chemiluminescenza. Questa metodologia si basa sull utilizzo di una perossidasi associata ad un anticorpo secondario che riconosce il frammento cristallizzabile (Fc) della specie biologica dalla quale deriva l anticorpo primario. In presenza di perossido di idrogeno, la perossidasi catalizza l ossidazione di un diacil-idrazide ciclico creando un intermedio instabile che decade con l emissione di luce. Questa luminescenza può essere rilevata tramite l esposizione di una lastra per raggi-x poi processata con liquidi di sviluppo fotografico (reagenti di fissaggio e sviluppo). 3.5 Immunoprecipitazione Le cellule sono state seminate ad una opportuna concentrazione su piastre Petri da 60 o 100mm e successivamente trattate con 17-DMAG 1µM. Le cellule sono state lisate come descritto nel paragrafo 3.4. L immunoprecipitazione è stata eseguita come riportato da Bonvini et al. nel 2002 [111]. Brevemente le proteine ottenute vengono quantificate mediante saggio BCA e vengono immunoprecipitati 1 mg di lisati proteici over-night a 4 C con 4µg di anticorpi specifici. Gli immunocomplessi sono stati poi assorbiti con 30µl di protein G-Sepharose Fast Flow TM per 2 h a 4 C e poi risospesi in RLB 1x (Reducing Loading Buffer) e separati mediante SDS-PAGE. Successivamente è stato eseguito il western blot utilizzando specifici anticorpi primari. 3.6 Analisi dei cicli cellulari mediante citometria a flusso Per l analisi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le cellule sono state seminate su piastre Petri da 60 o 100mm. Al termine di ogni trattamento, le cellule sono state tripsinizzate, centrifugate (5 min.) a 1200 rpm, lavate per due volte in PBS 1x e fissate in 1 ml di etanolo al 70% in H 2 O ultrapura. Dopo due lavaggi in PBS 1x, le cellule sono state risospese in 500µl di PBS 1 x con 50 µg/ml di propidio ioduro. L analisi è stata effettuata al citofluorimetro FACS Calibur (Becton Dickinson, USA). Lo ioduro di propidio è un colorante di natura fenantridinica, che quando si intercala al DNA a doppia elica, forma un complesso che emette una fluorescenza rossa (Abs/Em, 560/680nm) se colpito da un fascio laser di eccitazione (laser ad Argon, 488nm). Le cellule marcate con ioduro di propidio attraversano il fascio 26

31 laser e quando colpite dal laser emettono un segnale di luce diffusa ed un segnale di fluorescenza rossa che viene raccolto dallo strumento e riportato in una scala arbitraria di intensità di fluorescenza. Il citofluorimetro acquisisce all interno del campione un numero elevato di cellule marcate, dell ordine di 1x10 6, garantendo un elevata validità statistica. Il risultato è una distribuzione del numero di cellule rispetto all intensità di fluorescenza che è direttamente proporzionale al loro contenuto di DNA ( istogramma di DNA ). L istogramma di DNA consente una quantificazione della percentuale di cellule in una data fase del ciclo cellulare, sfruttando il diverso contenuto di DNA delle cellule nelle fasi G1, S, G2/M. L analisi viene effettuata con l ausilio di un software che permette di dividere l insieme dei segnali in tre parti fondamentali: due gaussiane, G1 e G2/M, e una intermedia, costituente la fase S, fornendo le percentuali di cellule nelle diverse fasi (%G1, %S, %G2 /M). 3.7 Saggi di invasività e migrazione La capacità di invasione delle linee cellulari in studio è stata valutata seminando le cellule alle seguenti densità: 1x10 5 RH30, 2x10 6 LAN5, in terreno privo di FCS in piccoli inserti il cui fondo era costituito da una membrana semipermeabile coattata sul lato interno con Matrigel TM (Becton Dickinson Falcon TM, Belgio). Tale membrana è stata prima reidratata per 2h a 37 C con terreno puro. Questi cestelli sono stati posizionati in piastre da 24 pozzetti in cui era stato messo terreno senza siero o addizionato con FCS 10% con/senza mab µg/mL per 16h a 37 C in atmosfera umidificata con CO 2 al 5%. Le cellule in grado di invadere il Matrigel vengono attratte per chemiotassi nel pozzetto sottostante e possono essere fissate in glutaraldeide 2,5% in acqua ultrapura per 20 min.. Successivamente vengono colorate con cristallo di violetto 0.2% in metanolo 20% per 20 min., lavate con PBS 1x ed asciugate. Alla fine sono state osservate con il microscopio a contrasto di fase DM IRB (Leica, Germania) ed è stata eseguita la conta delle cellule migrate. Per il saggio di migrazione, le cellule sono state seminate alle stesse densità sopra riportate in terreno privo di FCS su inserti il cui fondo era costituito da una membrana semipermeabile con pori di 8µm (Becton Dickinson Falcon TM, Belgio). I cestelli sono stati posizionati in piastre da 24 pozzetti in cui era stato messo terreno senza siero o addizionato con FCS 10% con/senza mab µg/mL 27

32 per 16h a 37 C in atmosfera umidificata con CO 2 al 5%. Le cellule migrate vengono fissate, colorate e visualizzate come per il saggio dell invasività. 3.8 Saggio Wound Healing Le cellule sono state seminate in piastre da 6 pozzetti e lasciate crescere per 48h. Quando confluenti, le cellule sono state incubate per 24h con terreno privo di FCS e successivamente grattate con un puntale eppendorf da 1000 al centro del pozzetto. Sono stati eseguiti una serie di lavaggi con terreno senza siero per eliminare le cellule che si sono staccate. Sono stati eseguiti i trattamenti con mab16-39 (0-100ng/ml), HGF (0-100ng/ml) e whi-p-154 (0-50µM) con/senza 10% di siero e quindi le cellule sono state fotografate al tempo 0, e poi a 24, 48 e 72h. 3.9 PCR, Polymerase Chain Reaction Il DNA delle linee cellulari è stato estratto mediante TRIzol (Invitrogen) seguendo il protocollo fornito dalla ditta. L amplificazione della regione extracellulare (esoni 1-3, 154bp, ALK-1) e della porzione intracitoplasmatica (esoni 20-22, 146bp, ALK-2) è stata eseguita secondo quanto riportato precedentemente [112]. In particolare, i primers utilizzati sono: - ALK-1 reverse: 5 -GGAAGTCAAAGCTGCACTCC-3 ; - ALK-1 forward: 5 -TTCGGGACTGGTCATAGCTC-3 ; - ALK-2 reverse: 5 -TCGTCCTGTTCAGAGCACAC-3 ; - ALK-2 forward: 5 -CGGAAAAACATCACCCTCAT-3. Il programma di amplificazione è il seguente: C 10 min C 30 sec C 30 sec C 30 sec C 10 min I passaggi 2,3 e 4 sono stati ripetuti per 40 cicli. I prodotti di reazione della PCR sono stati separati su gel di agarosio al 2% e la loro dimensione viene determinata attraverso la comparazione con il Marker VI (Roche, Milano, Italia). 28

33 3.10 RT-qPCR La Real Time PCR quantitativa permette di quantificare i prodotti di amplificazione durante ogni ciclo di reazione a catena della polimerasi, che sono direttamente proporzionali alla quantità di templato iniziali. L espressione totale di ALK è stata analizzata utilizzando la real-time PCR (ViiA7, Applied Biosystems, USA) con metodica di rilevazione dell amplificato che si basa sull utilizzo del Sybr Green (Applied Biosystems). Questo metodo si basa sul legame di questa molecola sul solco minore del DNA. L aumento della fluorescenza durante l elongazione è proporzionale all aumento del numero di copie degli ampliconi. Come gene di riferimento per la normalizzazione dei dati è stato utilizzato il gene GAPDH e la reazione di amplificazione per ogni campione è stata effettuata in triplicato. I primers utilizzati sono riportati in Tabella 1. Le sonde per ALK sono state designate tra l esone 20 e 22 della regione intracitoplasmatica. GAPDH Primer forward: 5 -TCCTCTGACTTCAACAGCGA-3 Primer reverse: 5 -GGGTCTTACTCCTTGGAGGC-3 ALK-2 Primer forward: 5 -CGGAAAAACATCACCCTCAT-3 Primer reverse: 5 -GGAAGTCAAAGCTGCACTCC-3 Tabella 1. Sequenze dei primers utilizzati in PCR quantitativa. La reazione di amplificazione è stata ottenuta mediante una miscela costituita da: 2X Master Mix; 900nM primer forward; 900nM primer reverse; 50ng cdna e acqua ultrapura. Totale volume di reazione 25µl. Il ciclo di amplificazione è il seguente: C 2 min C 10 sec C 15 sec C 1 min I passaggi 3 e 4 vengono ripetuti per 40 cicli. Al termine dei 40 cicli è stato effettuato il protocollo di dissociazione che rivela la presenza di amplificati aspecifici come eventuali contaminazioni di DNA o dimeri di primers (95 C per 15 sec; 60 C per 1 min; 95 C per 15 sec). 29

34 Il software presente nello strumento traccia l amplification plot, cioè un grafico in cui in ascissa si trova il numero dei cicli ed in ordinata il segnale di fluorescenza. Nei primi cicli di PCR si assiste ad un piccolo cambiamento nel segnale di fluorescenza e ciò definisce la baseline dell amplification plot. L aumento della fluorescenza che si ottiene oltre la baseline dipende dalla quantità di prodotti di PCR che si sono accumulati. Un parametro importante in questo tipo di analisi è il ciclo soglia Ct (threshold Cycle), che corrisponde al numero di cicli in cui l intensità di fluorescenza supera il valore soglia. Un valore di Ct piccolo indica un precoce incremento della fluorescenza e che la sequenza bersaglio è abbondante. Per poter poi associare ad un valore di Ct una determinata quantità di target è necessario creare una curva standard in modo che a quantità note di target, venga fatto corrispondere un particolare valore di Ct. In questo studio, è stata adottata la quantificazione relativa dei geni target (ALK in linee cellulari tumorali) rispetto ai campioni di riferimento (muscolo scheletrico fetale) normalizzando i valori di amplificazione per un gene costitutivamente espresso (GAPDH). Per poi ottenere il rapporto di espressione dei campioni target rispetto al campione di riferimento si è utilizzato il modello matematico comparativo del CT. Brevemente: Ct target gene -Ct controllo endogeno = Ct Ct- Ct calibratore = Ct FC=2 - Ct Dove: Ct target gene indica threshold Cycle o ciclo soglia del gene target, ossia di ALK2; Ct controllo endogeno indica ciclo soglia di GAPDH; Ct calibratore : ciclo soglia del controllo non trattato; FC: Fold Change, variazione di espressione del gene target rispetto al calibratore. 30

35 4. RISULTATI 4.1 Espressione di ALK nelle linee cellulari di RMS. Per valutare l espressione del recettore ALK in cellule di rabdomiosarcoma [113], sono state utilizzate 9 linee cellulari di RMS, 5 alveolari (RH30, RH28, RH4, RC2, RH18) e 4 embrionali (RD, CCA, SMS-CTR, RH36), la quale è stata successivamente confrontata con l espressione di ALK nelle linee cellulari di neuroblastoma (LAN5, IMR32), medulloblastoma (DAOY), sarcoma di Ewing (TC32, TC106), linfoma ALCL (Karpas-299) e leucemia (CEM, DG75, K652). Per valutare l espressione del gene ALK e di eventuali varianti tronche, derivanti da riarrangiamenti cromosomici, è stata eseguita l amplificazione sia di regioni codificanti la porzione extracellulare che del dominio chinasico intracellulare usando primers in grado di amplificare gli esoni 1-3 e 20-22, rispettivamente. Tutte le linee cellulari di RMS mostrano espressione del trascritto di ALK, sia della porzione extra- che intracellulare, indipendentemente dal sottotipo istologico e dalla presenza della proteina di fusione PAX3/7-FKHR (figura 9A). Il trascritto di ALK risulta espresso anche in linee di neuroblastoma, di medulloblastoma e di linfoma ALCL, mentre le cellule di linfoma ALCL (Karpas-299) sono le uniche a presentare amplificazione solo della regione citoplasmatica vista l espressione della proteina NPM-ALK. Per quantificare il livello di trascritto di ALK, è stata quindi eseguita una RT-qPCR quantitativa nelle stesse linee cellulari (figura 9B), che ha dimostrato come le cellule di RMS che esprimono PAX-FKHR presentano livelli di espressione di ALK maggiori rispetto alle cellule PAX-FKHR - ed in come riportato nel grafico della figura 9C e confermata dall analisi statistica (Mann-Whitney test, p=0.032). 31

36 B A ALK-1 ALK-2 β2-microglobulina Karpas-299 RH30 RH4 RC2 RH28 RD SMS-CTR CCA RH36 RH18 LAN5 IMR32 ALCL RMS+ RMS- NB MSF TC32 TC106 DAOY k562 DG75 CEM EWS MB LC espressione relativa ALK C espressione relativa ALK p=0.036 p=0.032 p=0.057 RH30 RH4 RH28 RC2 RH18 RD RH36 CCA SMS-CTR LAN5 IMR32 ARMS A/N ERMS NB MB EWS LC ALCL DAOY TC32 TC106 K562 DG75 CEM KARPAS MSF 0 RMS+ RMS- MSF ALTRO Figura 9. Espressione di ALK in linee cellulari di RMS. A: l espressione di ALK è stata valutata usando primers che amplificano la regione extracellulare (ALK-1) e la regione citoplasmatica (ALK-2) del gene ALK. E stato scelto come gene housekeeping β2-microglobulina. B: espressione relativa di ALK misurata tramite RT-qPCR normalizzata al GAPDH. C: medie delle espressioni relative di ALK. I valori dei P sono stati calcolati mediante il test Mann-Whitney. ARMS: rabdomiosarcoma alveolare; ERMS: rabdomiosarcoma embrionale; ALCL: anaplastic large cell lymphoma; A/N: non ARMS; RMS+: RMS PAX-FKHR positivi, RMS-: RMS PAX-FKHR negativi; NB: neuroblastoma; MSF: muscolo scheletrico fetale; LC: leucemia; EWS: sarcoma di Ewing; MB: medulloblastoma. Sono stati quindi valutati i livelli di espressione proteica di ALK mediante western blotting, utilizzando anticorpi diretti contro la porzione intracellulare del recettore. Come riportato in figura 10, le linee cellulare di RMS alveolare che esprimono PAX-FKHR presentano una banda di maggiore intensità rispetto alle linee di RMS alveolare non traslocate e a quelle di RMS embrionali. In particolare, RH30 e RH28 mostrano livelli di espressione proteica particolarmente elevati, in accordo con quanto osservato a livello trascrizionale (figura 9B). 32

37 RH30 RH4 RC2 RH28 RD SMS-CTR CCA RH36 RH18 αalk αalkc β-actina Figura 10. Espressione proteica di ALK in linee cellulari di RMS. Western blotting per valutare l espressione proteica di ALK. Le proteine (60µg) sono state separate in condizioni denaturanti mediante SDS-PAGE e trasferite su membrana di nitrocellulosa. ALK è stato visualizzato mediante immunoblotting usando due anticorpi specifici per la porzione intracitoplasmatica del recettore. Come controllo del caricamento è stata utilizzata β-actina. ALK, quando espresso nei RMS, non risulta costitutivamente attivo, a differenza di NPM-ALK negli ALCL [41, 42], dato che la sua attivazione necessita di una dimerizzazione ligando-dipendente. A tal scopo abbiamo valutato il grado di fosforilazione di ALK, mediante immunoprecipitazione e western blotting, con anticorpi specifici per la forma fosforilata del recettore e dimostrando che ALK non risulta fosforilato nelle cellule di RMS (p-alk). Ciò suggerisce l esistenza di meccanismi diversi da mutazioni puntiformi attivanti o loop autocrino che possono regolare la sua attivazione in questo tumore (figura 11). IP: ALK KARPAS-299 LAN5 RH30 RD RH4 RH36 SMS-CTR CCA LAN5 * ALK NPM-ALK p-alk p-npm-alk Figura 11. Attivazione di ALK in linee di RMS. Per valutare lo stato di attivazione di ALK vengono immunoprecipitati 1 mg di lisati proteici over-night a 4 C con 4 µg di anticorpo anti-alk. Le membrane di nitrocellulosa vengono successivamente incubate con anticorpi specifici per la forma totale (pannello superiore) e per la forma fosforilata (pannello inferiore) di ALK. LAN5*: lisato proteico totale, non sottoposto ad immunoprecipitazione. 33

38 Successivamente è stata valutato se l espressione del recettore potesse dipendere dall interazione con le proteine Heat Shock 90 e 70 (HSP90 e HSP70), le quali appartengono alla famiglia delle proteine chaperone e svolgono un importante ruolo nella stabilizzazione e degradazione di diverse chinasi, come NPM-ALK e EML4-ALK [111]. Come riportato in letteratura, l inibizione di HSP90 nei linfomi ALCL, mediata da 17-allylamino,17-demetossigeldanamicina (17-AAG), determina una diminuzione dell espressione di NPM-ALK che è associata ad una rapida degradazione proteosomica della proteina stessa [111] [114]. In questo studio abbiamo quindi valutato l attività di 17-DMAG, un derivato più solubile di 17-AAG, sulle linee di RMS per verificare l effetto sull espressione della proteina ALK. Come si può osservare in figura 12, ALK è associato ad HSP90 in condizioni normali, mentre in presenza di 17-DMAG l interazione tra le due proteine viene inibita dal farmaco ed ALK si associa ad HSP70 prima della sua degradazione proteosomale (figura 12B). Inoltre il pre-trattamento con 17-DMAG determina la degradazione di ALK ed un aumento di HSP70, come visibile in figura 12C. Tutto ciò conferma che ALK è una proteina che dipende da HSP90 per una corretta maturazione ed espressione, e, la degradazione del recettore indotta da 17-DMAG, è conseguenza dell inibizione di HSP90 nelle medesime condizioni sperimentali [111, 114]. 34

39 A ctr 17-dg 17-dg ctr ctr 17-dg Karpas-299 * B RH30 * ctr 17-dg ctr 17-dg ctr 17-dg ALK ALK IP: HSP90 IP: HSP70 WB: ALK NPM-ALK WB: ALK NPM-ALK RH30 LAN5 Karpas-299 Karpas-299 LAN5 RH30 C ctr 17-dg ctr 17-dg ALK HSP70 β-actina RH30 LAN5 Figura 12. Effetti del 17-DMAG sullo stato di ALK. A,B: Per valutare lo stato di attivazione di ALK vengono immunoprecipitati 1 mg di lisati proteici over-night a 4 C con 4 µg di anticorpo anti-hsp90 (A) o anti-hsp70 (B). Le membrane di nitrocellulosa vengono successivamente marcate con anticorpi specifici per la forma totale di ALK. C: western blotting per valutare l espressione di ALK e HSP70 dopo trattamento con 17- DMAG 1µM per 16 ore. Come controllo del caricamento è stata utilizzata β-actina. Ctr: controllo; 17-dg: 17-DMAG; 9D2: clone 9D2 dell anticorpo anti-hsp90; RH30*, Karpas-299*: lisato proteico totale, non sottoposto ad immunoprecipitazione. 4.2 Attivazione di ALK La dimerizzazione ligando-dipendente è uno dei requisiti fondamentali per l attivazione di recettori tirosin-chinasici, anche se studi recenti hanno dimostrato che alterazioni cromosomiche, come mutazioni puntiformi o amplificazioni geniche, possono determinarne l attivazione prescindendo dall interazione con i ligandi [77, 90]. Abbiamo quindi valutato se l attivazione di ALK nelle cellule di RMS potesse dipendere dalla somministrazione di pleiotropina (PTN) e midkine (MK), come riportato recentemente in altri modelli cellulari tumorali [65, 66](figura 13). 35

40 A PTN MK B PTN MK RH4 CTR ng/ml RH30 CTR ng/ml p-alk p-alk ALK ALK p-akt p-akt AKT AKT β-actina β-actina C PTN MK LAN5 CTR ng/ml p-alk ALK p-akt AKT β-actina Figura 13. Stimolazione di ALK mediante pleiotropina e midkine. Le linee cellulari RH4, RH30 e LAN5 sono state esposte 30 minuti a dosi crescenti di PTN (5-100 ng/ml) e di MK (1-100 ng/ml). Sono stati caricati 50µg di lisati proteici. Sono riportati gli immunoblotting per p-alk, ALK, p-akt, AKT. Come controllo di caricamento è stato utilizzata β-actina. Come si può vedere dalla figura 13, pleiotropina e midkine non sono in grado di stimolare l attivazione di ALK e le vie di segnale ad esso associate. Infatti non si notano né la fosforilazione del recettore (p-alk) né quella di AKT. Queste osservazioni sono in linea con quanto già riportato in letteratura, dove si dimostra come PTN e MK attivino ALK non per un diretto legame col recettore, ma previa inibizione della protein-tirosina fosfatasi β/ζ (RPTP β/ζ) che in condizioni normali mantiene ALK nella sua forma inattiva defosforilata [78]. In alternativa la stimolazione di ALK può essere ottenuta mediante anticorpi monoclonali agonisti, come dimostrato in cellule di neuroblastoma [110]. Come si evince dalla figura 14, l anticorpo mab16-39 induce, nelle cellule di rabdomiosarcoma (RH30) e di neuroblastoma (LAN5), la fosforilazione di ALK ed ERK, una serin-treonin chinasi critica per la proliferazione di diversi istotipi tumorali. Tuttavia le deboli bande che si osservano in assenza di mab16-39 suggeriscono uno stato basale di fosforilazione che potrebbe dipendere da altri meccanismi che coinvolgono altri 36

41 ligandi. In cellule di RMS embrionale che presentano una minor espressione del recettore, invece, non si osserva l attivazione di ERK, a conferma della specificità dell anticorpo per il recettore ALK. RH30 RD LAN5 CTR PTN 2.5 PTN 5 mab 0.1 mab 1 CTR PTN 2.5 PTN 5 mab 0.1 mab 1 CTR PTN 2.5 PTN 5 mab 0.1 mab 1 p-alk p-erk β-actina Figura 14. Confronto della stimolazione di ALK mediante PTN e mab Le linee cellulari RD (0.35x10 6 ), RH30 (0.35x10 6 ) e LAN5 (1.2x10 6 ) sono state mantenute per 48h in terreno privo di FCS; sono state esposte per 30 minuti a PTN (2.5 e 5 ng/ml) e a mab16-39 (0.1 e 1 µg/ml). Sono stati caricati 50µg di lisati proteici. Sono riportati gli immunoblotting per p-alk, p-erk. Come controllo di caricamento è stato utilizzata β- actina. L espressione e l attivazione del recettore ALK sono state quindi valutate in presenza di concentrazioni crescenti di mab e correlate con l espressione e l attività di proteine critiche per la sopravvivenza delle cellule tumorali. Come si osserva in figura 15A, l attivazione di AKT (p-akt) e di ERK (p-erk) è strettamente associata all attivazione di ALK in presenza dell anticorpo agonista mab16-39 in cellule che esprimono livelli alti o abbastanza alti di recettore (LAN5 e RH30), ma non nelle cellule in cui l espressione di ALK è bassa (RH4) o nulla (RD). Inoltre la stimolazione di ALK risulta estremamente rapida (figura 15B), come per ERK e AKT. Nello specifico si raggiunge un massimo dell attività di ALK appena dopo minuti dall aggiunta dell anticorpo agonista e tale effetto è visibile con la più bassa concentrazione di mab16-39 (0.1µg/ml). In conclusione la stimolazione di ALK con questo anticorpo ha confermato che le principali vie di segnale sono ERK1/2 e AKT, come dimostrato nel neuroblastoma [110], e data l attività svolta da queste molecole si potrebbe ipotizzare che ALK abbia un ruolo nella proliferazione e sopravvivenza cellulare anche in questo tipo di tumori. 37

42 A 0 LAN µg/ml RH µg/ml RH µg/ml 0 RD µg/ml p-alk p-alk p-alk ALK p-akt AKT ALK p-akt p-erk ALK p-akt p-erk p-erk β-actina β-actina ERK β-actina B 0 5 LAN h 24h 0 5 RH h 24h 0 RH h 24h p-alk ALK p-akt AKT p-erk mab µg/ml ERK β-actina Figura 15. Stimolazione di ALK mediante mab16-39 dose e tempo dipendente. Le linee cellulari RD (0.35x10 6 ), RH30 (0.35x10 6 ), RH4 (0.5x10 6 ) e LAN5 (1.2x10 6 ) sono state mantenute per 48h in terreno privo di FCS. Le cellule sono state trattate con dosi crescenti di anticorpo monoclonale (0.1-1µg/ml) (A) o per tempi diversi 0.1µg/ml (5 minuti-24 ore) (B). Sono riportati gli immunoblotting per p-alk/alk, p-erk/erk, p- AKT/AKT. Come controllo di caricamento è stata utilizzata β-actina. Infine, per verificare se l attivazione del recettore fosse associata ad un aumento della sua trascrizione, i livelli di mrna di ALK sono stati quantificati mediante real-time PCR quantitativa in presenza o assenza di mab Come si può osservare dalla figura 16, la somministrazione dell anticorpo agonista non determina un aumento della trascrizione di ALK indipendentemente dalla presenza o assenza di siero, in accordo con lo stato stazionario della proteina nelle medesime condizioni sperimentali (figura 15A). Quindi si evince che la stimolazione mediata di ALK determina effetti diretti sulla fosforilazione della chinasi e delle sue molecole segnale, ma non determina aumento della sua trascrizione. 38

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