DALLA MALATTIA AL GENE :

Dimensione: px
Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "DALLA MALATTIA AL GENE :"

Transcript

1 UN PERCORSO METODOLOGICO DI STUDIO IN GENETICA DALLA MALATTIA AL GENE : LA LEPTINA E L OBESITA UNIVERSITA DEGLI STUDI DI GENOVA LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-IRRCS GASLINI GENOVA ISTITUTO PER LA CURA E LA PREVENZIONE DEL CANCRO- GENOVA 1

2 LA LEPTINA 2

3 INDICE 1. Le basi genetiche dell obesità pag La leptina regola il metabolismo energetico pag.4 I recettori periferici della leptina 3. Il gene ob e l identificazione della leptina pag I Polimorfismi di sequenza del DNA pag. 8 Gli Enzimi di restrizione I RFLP e gli SNPs Frequenza degli SNPs Individuazione degli SNPs 5. Analisi molecolare del DNA. pag. 11 Estrazione del DNA. La tecnica della PCR per l analisi dei polimorfismi Termociclatori.Taq polimerasi.primer. Digestione con Enzimi di restrizione (ER) Elettroforesi su gel di Agarosio 6. Attività di Laboratorio pag.14 - Estrazione del DNA - PCR - Digestione con Enzimi di restrizione - Elettroforesi su gel di Agarosio 7. Strumenti e materiale a disposizione pag Bibliografia pag Glossario 3

4 1. BASI GENETICHE DELL OBESITA. La maggior parte degli animali,compresi gli esseri umani, tende ad avere un peso corporeo stabile; in altre parole, se è consentito loro di mangiare a volontà, essi mangiano quanto basta per mantenere il peso corporeo stabilito. Tuttavia un ceppo di topi omozigoti per difetti nel gene obese (detti topi ob/ob) sono caratterizzati da un peso superiore al doppio rispetto a quello dei topi normali (OB/OB) e si nutrono in eccesso quando possono accedere a quantità illimitate di cibo. I topi obesi sono privi della proteina leptina, il prodotto del gene obese. Questi topi omozigoti ob/ob mostrano una sindrome di obesità caratterizzata da una grave adiposità, iperfagia, ipotermia, iperlipidemia, iperinsulinemia, resistenza all insulina. Il gene ob fu clonato nel 1994 e la leptina fu identificata nel 1995 quale prodotto del gene ob e segnale ormonale regolatorio del bilancio energetico. 2.LA LEPTINA REGOLA IL METABOLISMO ENERGETICO La leptina è un ormone peptidico di 167 aminoacidi, di circa 16 kda, ed ha un singolo legame disolfuro, necessario per la sua attività. E prodotta normalmente e in grande quantità dagli adipociti e regola il tessuto adiposo e il bilancio massa corporea/energia, ma è presente anche nello stomaco, nei muscoli, nella placenta e in alcuni tessuti fetali. La leptina circola nel sangue e agisce sul cervello regolando la quantità di cibo da introdurre in rapporto al dispendio energetico. Quando la massa grassa diminuisce, si abbassa la concentrazione di leptina plasmatica stimolando l appetito. Viceversa, se la massa grassa aumenta, aumenta la concentrazione di leptina che inibisce l appetito. Questo sistema controlla l equilibrio omeostatico del tessuto adiposo. Quando si inietta leptina nei topi ob/ob, questi mangiano meno e perdono peso. La leptina è quindi considerata un segnale di sazietà che influenza il sistema di controllo dell appetito presente nel cervello. E stato inoltre scoperto che la leptina regola il metabolismo energetico, così come il consumo di energia. Nei roditori, l assunzione di leptina aumenta la spesa energetica e diminuisce la massa grassa senza interferire con la massa magra corporea. Se viene somministrata a topi, la leptina normalizza la glicemia, il livello di insulina e di lipidi e la temperatura corporea. Mentre sembra che i recettori periferici per la leptina non siano essenziali per la perdita di peso, invece le azioni della leptina mediate a livello centrale si presume siano determinanti nel regolare l equilibrio generale dell organismo. I recettori periferici della Leptina La semplice base genetica dell obesità riscontrata nei topi ob/ob non sembra applicabile alla maggior parte delle persone obese. Nell uomo i livelli di leptina aumentano con la percentuale di grasso corporeo, in accordo con l ipotesi riguardante la sintesi di leptina da parte degli adipociti. Negli esseri umani, tuttavia l obesità non sembra il risultato di una mancata produzione di leptina, ma di una re s istenza alla leptina dovuta forse a una diminuzione della concentrazione di un recettore per la leptina presente nel cervello, precisamente nell ipotalamo e nel plesso coroideo, aree del cervello note per il controllo del comportamento alimentare; oppure a una saturazione s azi del recettore ettor e che trasporta la leptina nel sistema nervoso centrale, attraverso la barriera emato-encefalica. Lo splicing alternativo del gene per il recettore della leptina produce almeno 5 isoforme di RNAm che si esprimono in un modo tessuto-specifico e codificano per proteine che hanno domini extracellulari identici, ma diversi domini transmembrana. I recettori sono divisi in 4

5 due gruppi: un gruppo che ha piccoli domini intracellulari (32-97 residui di AA) ed altri che hanno un grande dominio intracellulare di 302 residui. I recettori per la leptina furono identificati biochimicamente e risultarono appartenere alla famiglia delle citochine; sono caratterizzati da un singolo dominio trans-membrana che si associa con una classe di proteine tirosin-chinasi definite Janus Chinasi (JAK). Le JAK legano il ligando mediante fosforilazione della tirosina di proteine segnale come l IP3-kinasi o una famiglia di fattori di traduzione e attivatori della trascrizione. Il controllo, sia sui topi obesi ob/ob che sui topi diabetici db/db (diabete), suggerisce che la leptina regola l equilibrio immagazzinamento/ossidazione degli acidi grassi. Il muscolo scheletrico esprime entrambi i due tipi di recettori per la leptina e contribuisce in modo significativo al catabolismo lipidico; questo significa che il muscolo scheletrico rappresenta un target per la leptina periferica. Nei topi a cui veniva fornita un alta concentrazione di leptina si è osservato un aumento dell ossidazione degli acidi grassi e una diminuzione dell esterificazione a triacilgliceroli (TAG). L Insulina ha l effetto opposto. Ma quando i due ormoni vengono somministrati insieme, la leptina attenua gli effetti antiossidanti e lipogenici dell Insulina. Uno studio recente mostra che gli effetti acuti della leptina sulla ß-ox dei grassi sono mediati dalla Proteina-kinasi-AMPdip.(AMPK), un enzima che è attivato dalle variazioni di concentrazione del rapporto AMP/ATP. Pertanto, sia nel muscolo che nel tessuto adiposo, la leptina determina: In sintesi. - aumento della ß -OX dei grassi - aumento della lipolisi - diminuzione della sintesi di TAG La leptina è un ormone che regola la termogenesi e controlla il peso corporeo di un individuo sia stimolando l ossidazione degli acidi grassi e l assorbimento del glucosio sia prevenendo il deposito dei lipidi in tessuti non adiposi. Agisce con azione sia periferica, attivando il sistema nervoso periferico, sia centrale, influenzando le funzioni dell ipotalamo. È secreto dalle cellule del tessuto adiposo, gli adipociti, sembra quindi chiaro che in presenza di sovrabbondanza di esse si avrà una maggiore produzione di leptina, in caso contrario, cioè in carenza di cellule adipose, si assisterà a un abbassamento dei livelli dell ormone. È in grado di diminuire il senso della fame e, tramite la termogenesi adattativa, aumentare la spesa energetica dell organismo. La struttura biochimica della leptina è assimilabile a quella delle citochine con catene a lunga elica. Tale gruppo di sostanze è una sorta di ponte di comunicazione fra il sistema neuroendocrino e quello immunitario. La secrezione della leptina non è influenzata soltanto dal grado di adiposità e dal bilancio calorico, ma anche dall alta concentrazione nel sangue di determinati ormoni fra i quali ad esempio il testosterone, l adrenalina e gli estrogeni. Recenti studi indicano che la leptina ha un ruolo importante anche nello sviluppo della fase puberale e nella gravidanza, funzionando come una sorta di termometro usato dai centri ipotalamici per verificare la presenza di sufficienti scorte di grasso per iniziare queste importanti fasi. 5

6 Un probabile quadro dei meccanismi segnale della leptina periferica è mostrato nella Fig.1 La leptina prodotta dagli adipociti si lega ai recettori periferici nel tessuto adiposo,nel fegato,nel pancreas e nel muscolo scheletrico, attivando il quadro dei segnali mediati dalle chinasi JAK. La leptina inibisce le azioni lipogeniche dell Insulina attraverso meccanismi non ancora ben identificati. Fegato adipociti LEPTINA L-Receptors pancreas INSULINA I-Receptors PI3K JAK muscolo scheletrico geni lipogenici/ sintesi di colesterolo Metabolismo del GLU Lipolisi termogenesi [AMP]/[ATP] AMPK Acil-CoA epatica DAG TAG Acidi grassi ß-OX Lipogenesi RE Mitocondrio acidi grassi esogeni Fig.1 6

7 3. IL GENE ob. Dal SITO NCBI : LEP Official Symbol LEP and Name: leptin [Homo sapiens] Other Aliases: FLJ94114, OB, OBS Other Designations: leptin (murine obesity homolog); leptin (obesity homolog, mouse); obese, mouse, homolog of; obesity factor Chromosome: 7; Location: 7q31.3 Annotation: Chromosome 7, NC_ ( ) MIM: GeneID: 3952 This gene encodes a protein that is secreted by white adipocytes, and which plays a major role in the regulation of body weight. This protein, which acts through the leptin receptor, functions as part of a signaling pathway that can inhibit food intake and/or regulate energy expenditure to maintain constancy of the adipose mass. This protein also has several endocrine functions, and is involved in the regulation of immune and inflammatory responses, hematopoiesis, angiogenesis and wound healing. Mutations in this gene and/or its regulatory regions cause severe obesity, and morbid obesity with hypogonadism. This gene has also been linked to type 2 diabetes mellitus development. [provided by RefSeq] Genomic regions, transcripts, and products red: coding region blue: untraslated region Genomic context chromosome: 7; Location: 7q31.3 Lep Official Symbol Lep and Name: leptin [Mus musculus] Other Aliases: ob, obese Chromosome: 6; Location: cm Annotation: Chromosome 6, NC_ ( ) GeneID:

8 4. POLIMORFISMI DI SEQUENZA DEL DNA Il termine polimorfismo significa esistenza di forme diverse. In genetica, il polimorfismo può essere analizzato sia a livello proteico che di materiale genetico. In questo secondo caso, le forme diverse, ossia le varianti genetiche possono riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo allelico), oppure un tratto di DNA non codificante (polimorfismo di sequenza). Queste diversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che più del 98% del DNA umano è DNA non codificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata in sequenze non codificanti, il fenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è riconoscibile dall esterno (ex. nei gruppi sanguigni). Dato l elevato numero di loci polimorfici, i polimorfismi di sequenza sono molto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (gruppi sanguigni, albinismo, colore degli occhi, ecc..) e conseguentemente più utili nella ricerca biologica e medica. E stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un Enzima di Restrizione, la variazione, creando o distruggendo il sito di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di taglio di quel dato enzima all interno della popolazione. Digerendo con quell enzima il DNA di individui diversi, si osserva quindi un polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione RFLP - e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione diversi. Come tutti i polimorfismi, i RFLP possono essere equiparati ad alleli codominanti di un locus mendeliano:la presenza o assenza di uno o dell altro allele può essere riconosciuta in ogni individuo,consentendo la distinzione in omozigoti ed eterozigoti. Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze di numero e/o dimensione dei frammenti di DNA ottenuti con la digestione con un certo enzima di restrizione. I frammenti sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel. L avvento della genetica molecolare ha permesso di identificare i polimorfismi del DNA, che sono diventati i marcatori genetici più comunemente usati. Attualmente si utilizzano tre tipi di polimorfismi del DNA: i Polimorfismi di Lunghezza dei Frammenti di Restrizione, o RFLP i Polimorfismi del Singolo Nucleotide, o SNP i Polimorfismi di Lunghezza di Sequenze Semplici, o SSLP che vengono poi distinti in VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o minisatelliti, e i STR (Simple Tandem Repeats ) o microsatelliti. GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNA riconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici ( cioè possono essere letti in entrambe le direzioni )la cui successione di basi è identica su entrambi i filamenti quando ciascuno di essi venga letto in direzione 5 > 3. La sequenza riconosciuta non è unica e varia da enzima ad enzima, anche se con la stessa specificità di sequenza. Infatti, sebbene gli enzimi di 8

9 restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono essere tagliate sono molto meno numerose (poco più di 200 ). I siti di restrizione sono delle normali sequenze di basi, lunghi dai 4 fino a diverse decine di paia di basi, per cui si possono trovare più o meno facilmente nel genoma. Un enzima di restrizione può tagliare all interno di una sequenza o nelle sue vicinanze, oppure la sequenza consenso può anche essere distante diverse centinaia di basi. Il taglio prodotto dagli enzimi può generare frammenti di DNA con estremità piatte (blunt), o sporgenti ( 5 -protruding e 3 -protruding). Le estremità prodotte sono appiccicose, cioè possono formare ponti Idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari. Le estremità coesive facilitano inoltre la reazione della DNA ligasi. L enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento al 5 (5 -protruding): 5...G/ AATTC CTTAA /G...5 L enzima HhaI opera un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento al 3 (3 -protruding ) : 5 G C G /C 3 3 C/G C G 5 Nome enzima Organismo di provenienza Sequenza d riconoscimento e posizione di taglio Pronuncia EcoRI E.Coli RY13 G/A A T T C C T T A A/G HindIII BamHI Haemophilus influenzae Rd Bacillus amyloliquefaciens A/A G C T T T T C G A /A G/G A T C C C C T A G/G Eco-ri-uno Acca-ind-tre Bam-acca-uno ENZIMI DI RESTRIZIONE. Sono prodotti dai batteri che li utilizzano per difendersi da un DNA estraneo, esempio un virus Altri enzimi (le metilasi ) proteggono il DNA batterico grazie all azione delle proprie endonucleasi di restrizione. Gli ER si indicano con un sistema di lettere e numeri che si riferisce al ceppo batterico da cui sono stati isolati. Polimorfismo a singolo nucleotide o SNPs Un polimorfismo a singolo nucleotide (in inglese Single Nucleotide Polymorphism o SNP, pronunciato snip) è un polimorfismo (cioè una variazione a livello di una sequenza di acidi nucleici) che si presenta tra individui della stessa specie, caratterizzata da una differenza a carico di un unico nucleotide. Ad esempio, se le sequenze individuate in due soggetti sono: AAGCCTA e AAGCTTA 9

10 è presente uno SNP che differenzia i due alleli C e T. Frequenza degli SNPs All interno di una popolazione, è possibile determinare una minor frequenza allelica, il rapporto tra la frequenza della variante più rara e quella più comune di un determinato SNP. È importante notare che possono esistere variazioni notevoli tra popolazioni umane. Uno SNP molto comune in un determinato gruppo etnico può dunque essere molto raro in un altra popolazione. Gli SNPs costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane. SNPs con minor frequenza allelica, pari o maggiore all 1%, sono presenti ogni circa paia di basi lungo l intero genoma. In media, due SNPs su tre vedono una variazione tra citosina e timina. Gli SNPs possono presentarsi all interno di una sequenza codificante di un gene, all interno di una regione intronica o in una regione intergenica. Gli SNPs all interno di un gene, in ogni caso, non necessariamente modificano la sequenza amminoacidica codificata, dal momento che il codice genetico è degenerato. Uno SNP che genera in tutte le sue forme lo stesso peptide è detto sinonimo (synonymous); in caso contrario è detto non-sinonimo (non-synonymous). Individuazione degli SNPs Un metodo utile per individuare gli SNPs è la valutazione dei cosiddetti polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (Restriction fragment length polymorphisms) o RFLP. Se un allele contiene un sito di riconoscimento per un enzima di restrizione ed un altro no, la digestione dei due alleli genererà due frammenti di dimensione differente. In realtà oggi gli SNPs sono studiati principalmente attraverso i microarrays, che permettono l analisi simultanea di centinaia di diversi SNPs ed una veloce analisi elaborata da un computer. L allele 2 ha una mutazione : A -> C che elimina un sito di restrizione di EcoRI. GAATTC GACTTC Trattando il DNA con l enzima, F <-R F--> R l allele 2 non viene tagliato in quel sito Sono mostrati due frammenti di restrizione ottenuti 350 con digestione con l enzima EcoRI di due alleli (1 e 2) di un gene. 150 Potenzialità degli SNPs L allele 1 è interrotto da un sito di taglio per l enzima EcoRI (GAATTC) allele2 allele1 eterozigote l allele 2, a causa di una mutazione di una singola base, non presenta il sito di taglio (GACTTC). Lo studio degli SNPs è molto utile poiché variazioni anche di singoli nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai patogeni, agli agenti chimici, ai farmaci. Per tale motivo gli SNPs possono 10

11 5. ANALISI MOLECOLARE DEL DNA. ESTRAZIONE DEL DNA. Il DNA può essere estratto da qualunque cellula nucleata. I tipi cellulari più utilizzati sono rappresentati dai leucociti di sangue periferico, colture cellulari (fibroblasti, amniociti,villi coriali). L isolamento del DNA richiede l utilizzo di enzimi capaci di distruggere le membrane cellulari e nucleari e di solventi organici in grado di separare le proteine dagli acidi nucleici. Nella procedura classica di estrazione del DNA genomico, le cellule vengono lisate e sottoposte a trattamento proteolitico con Proteinasi K, eliminata successivamente con estrazioni fenoliche.il DNA purificato viene precipitato in Etanolo.La determinazione quantitativa della concentrazione del DNA estratto, calcolata in ng/µl, viene effettuata mediante lettura spettrofotometrica valutando l assorbanza del campione a 260 nm. LA TECNICA DELLA PCR PER L ANALISI DEI RFLP L introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di DNA, ha rivoluzionato la genetica molecolare e le sue applicazioni sono praticamente infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi di malattie genetiche mediante analisi di RFLP. L utilizzo della PCR semplifica molte cose. Ad esempio, la PCR consente di analizzare uno specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNA nucleare di una cellula,ossia sul DNA genomico. La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di amplificazione in vitro di un frammento di DNA di cui si conosca la sequenza nucleotidica delle regioni terminali. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA genomico a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento a una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l altra complementare ad un altro tratto posto all altra estremità (reverse primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela di desossinucleotidi trifosfati(dntps), in appropriate condizioni di reazione, è possibile copiare numerosissime volte (30-40 volte) il tratto compreso tra i due primer, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (92-95 C), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per la sintesi delle catene complementari. Se la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si rinaturi e in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72 C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo denaturazione annealing extension numerose volte (in genere da 30 a 40 volte), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato tratto di DNA, corrispondente a DNA in quantità tale da essere visualizzabile in un gel di agarosio mediante colorazione specifica. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenti: 1. è molto rapido (da 60 a 90 minuti), 2. la manualità è semplicissima, 3. è automatizzato, 4. i risultati sono visualizzabili con facilità. Il limite più grosso è rappresentato dalla necessità di conoscere le sequenze fiancheggianti il tratto di DNA che si vuole amplificare, per poter costruire i primer specifici. 11

12 N cicli N molecole della sequenza di DNA bersaglio La PCR ha rivoluzionato la genetica molecolare. Le applicazioni della PCR sono praticamente infinite. I principali ambiti di utilizzo sono la diagnosi prenatale di malattie genetiche e le indagini di medicina legale. I termociclatori Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l intero processo in modo automatico all interno di strumenti detti termociclatori (thermal cyclers) in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente: 1. denaturazione del DNA: 30 sec. a 94 C 2. appaiamento(annealing)deiprimer: 30 sec. a C 35 cicli 3. sintesi (extension)di DNA: 30 sec-5 min. a 72 C Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all uso di una DNA polimerasi termostabile estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus. L isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione! Scelta dei primer Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere l amplificazione di un tratto di DNA in modo specifico. I primer devono essere disegnati a monte e a valle dei siti di restrizione. Si tratta di oligonucleotidi, con dimensioni comprese tra le 15 e le 30 basi che ibridano su filamenti opposti in posizioni fiancheggianti la regione di interesse del DNA. Per minimizzare la formazione di artefatti è importante che le loro sequenze non contengano basi complementari (all interno dello stesso primer o tra i due primer); inoltre la Temperatura di fusione dei due oligonucleotidi deve essere identica o almeno molto vicina. Digestione con enzimi di restrizione (ER) Come abbiamo detto, gli ER sono endonucleasi che tagliano il legame fosfodiesterico nel DNA a doppia elica a livello di sequenze specifiche (siti di restrizione). La digestione con ER va condotta a 37 C in una soluzione tampone (fornita insieme all enzima dal produttore) che garantisce le condizioni ottimali (di salinità e ph) per la digestione. Il tempo di incubazione varia a seconda se si digerisce DNA genomico o frammenti di DNA corti.nel primo caso la digestione richiede almeno 8 ore (o tutta la notte). Nel secondo caso sono sufficienti da 1-4 ore. Gli ER sono reagenti costosi e delicati. Temono le contaminazioni (usare precauzioni nel prelevare l enzima dalla soluzione stock) e l inattivazione (si devono conservare a -20 C e, al momento dell uso, mantenere sempre in un bagno di ghiaccio). 12

13 Elettroforesi su gel di agarosio E una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore. Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo (catodo) verso il polo positivo (anodo). Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la velocità di migrazione. E, viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante elettroforesi, vengono caricati sul gel anche i cosiddetti marcatori di peso molecolare, ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza. Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di nucleotidi (basi) che lo costituiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp). La separazione elettroforetica dura circa 45 minuti circa. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, con particolari sistemi di colorazione. Il DNA delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA. Comunemente, per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel si aggiunge all agarosio il bromuro di etidio, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV. Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta. Il bromuro di etidio va maneggiato con estrema cautela in quanto è un agente intercalante del DNA e, come tale, ha proprietà mutagene. Noi utilizzeremo il GEL RED, intercalante non tossico che non richiede precauzioni particolari. 13

14 6. Attività di laboratorio Individuazione del polimorfismo della Leptina SNP rs Un polimorfismo della leptina è stato associato ad alti livelli di leptina in soggetti obesi e in soprappeso. Il gene della Leptina sta sul cromosoma 7; è fatto di due esoni e 3 introni. Il polimorfismo che noi andremo a considerare si trova nella regione del Promotore a pb dal sito d inizio della trascrizione. E individuato con la sigla : SNP rs e consiste nella possibile sostituzione della GUANINA con l ADENINA. Il genotipo di un individuo potrà quindi essere : GG (omozigote wild type) GA (eterozigote) AA (omozigote per il polimorfismo). Nella popolazione europea le tre condizioni si presentano con la frequenza di : A/A = 0,276 A/G =0,466 G/G = 0,259 STEP 1. ESTRAZIONE DI DNA DA MUCOSA BOCCALE Raccolta del campione. Raccogliere in una provetta le cellule di sfaldamento della mucosa boccale ottenute sfregando con uno stuzzicadenti e quindi sospese nella saliva. Il volume dovrebbe essere di circa 5-7 ml. Centrifugare per 5 min. a 2500 rpm. Togliere il sopranatante. Le cellule saranno raccolte nel pellet sul fondo della provetta. Lisi delle cellule. Aggiungere al pellet : 300 µl. di Lysis Solution, 1,5 µl di Proteinasi K. Trasferire in una provetta da 1,5 ml. Mescolare la provetta invertendola per 25 volte. Incubare in un bagnetto a 55 C per 1 ora Trattamento con RNasi Aggiungere 3 µl di RNasi Mescolare il campione invertendo la provetta 25 volte Incubare a 37 C per 50 min 14

15 Precipitazione delle proteine 1. Mettere la provetta col campione in bagno di ghiaccio per 1 min 2. Aggiungere 100 µl di Protein Precipitation Solution al lisato cellulare 3. Vortexare vigorosamente ad alta velocità per 20 per ottenere una miscela uniforme. 4. Mettere la provetta in bagno di ghiaccio per Centrifugare a 13,000xg per 3.Le proteine precipitate dovrebbero formare un sottile pellet bianco. Se questo non accade,ripetere i punti 3,4 e 5 Precipitazione del DNA Trasferire il sopranatante contenente il DNA(lasciando sul fondo il pellet del precipitato proteico)in una provetta pulita da 1,5 ml contenente 300 µl di Isopropanolo 100%(2-isopropanolo). Mescolare invertendo la provetta 50 volte e incubare a Temperatura ambiente per almeno 5. Il DNA può essere visibile ( o no) come un piccolo pellet bianco. Centrifugare a 13,000 xg per 5 min. Eliminare il sopranatante e asciugare la provetta su una carta assorbente pulita. Aggiungere 300 µl di Etanolo 70% e agitare la provetta più volte per lavare il DNA Centrifugare a 13,000 xg per 1. Con molta attenzione eliminare l Etanolo. Il pellet si può staccare, quindi versare adagio e facendo attenzione a non perderlo. Agitare e asciugare su carta assorbente pulita e all aria affinché evapori tutto l Etanolo. Idratazione del DNA Aggiungere 20 µl di Hydration Solution. Incubare il campione a 65 C per 30 min. a Temperatura ambiente. Picchiettare ogni tanto la provetta per favorire la dispersione del DNA. Conservare il DNA a 4 C, oppure a 20 C se deve essere conservato a lungo. STEP 2. PCR Lavorare in ghiaccio! MIX per 25 µl di PCR : ACQUA µl BUFFER 2.5 µl dntp 2.5 µl F 1.0 µl R 1.0 µl MgCl µl TAQGold 0.12 µl µl Campione di DNA : 2 µl Ogni gruppo ha a disposizione : - una provetta con la mix - una provetta contenente il DNA 15

16 PCR MIX DNA Mettere la provetta contenente Mix+ DNA nel termociclatore e iniziare il programma: DENATURAZIONE del DNA 95 C per 9 DENATURAZIONE 94 C per 45 APPAIAMENTO (annealing) 60 C per 45 SINTESI(extension) 72 C per 45 SINTESI Finale 72 C per 5 per 35 volte Alla fine della PCR i prodotti di reazioni si conservano a 4 C per 24 h. Il tempo di durata è di circa 2 ore. STEP 3. PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO AL 2% Sciogliere l Agarosio nella beuta con la soluzione tampone TAE. Far bollire la soluzione nel microonde agitando di tanto in tanto fino a quando questa non diventa trasparente. Quando la soluzione è tiepida, ma non ancora gelificata, aggiungere l intercalante del DNA, GelRed, 3 µl. Preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo e inserire il pettine. Versare la soluzione di Agarosio nella vaschetta per elettroforesi e lasciare polimerizzare (solidificare). Nell attesa, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel,utilizzando gel già pronti, con 10 µl di colorante Togliere il pettine quando il gel sarà solidificato. Tagliare un pezzetto di gel necessario per caricare la PCR. Versare il tampone TAE nella camera di corsa STEP 4. CHECK PCR L esito della PCR viene valutato con un check prelevando 5 di PCR + 2 µl colorante e facendo una elettroforesi di 10 min. Colorante: loading dye 10x: Blu di bromofenolo 0,41% Glicerolo 50% Glicerolo 50% Su un pezzetto di plastica del microfilm posizionare le gocce di 2 µl di colorante. Prelevare con la micropipetta 5 µl di amplificato di PCR e mescolarlo con la goccia di colorante. Blu di bromofenolo 0,41% Caricare con la miscela un pozzetto nel gel immerso nella vaschetta Caricare un pozzetto con un marcatore di 100 pb. La corsa elettroforetica dura 10 min e serve per sapere Glicerolo se il DNA 50% si è amplificato. Al termine della corsa,si prende il gel e lo si osserva al transilluminatore. 16

17 STEP 5. DIGESTIONE ENZIMATICA Lavorare in bagno Di ghiaccio Bisogna preparare una mix per la reazione di digestione Mix per 5 µl : Acqua 2 µl Buffer 4 2,5 µl BSA 0,3 µl Hha1 0,2 µl Aggiungere la mix alla provetta contenente 20 µl di PCR. Il Volume totale sarà di 25µL. Trasferire la provetta in termostato a 37 C almeno per 2 ore. STEP 6. ELETTROFORESI DEL CAMPIONE DIGERITO Si procede come nel check della PCR. Si prepara la cella elettroforetica e il gel di agarosio Si posizionano le gocce di 5 µl. di colorante su un pezzo di plastica di microfilm. Si prelevano 20 µl di campione digerito con la micropipetta e si mescolano con la goccia di colorante. Si trasferisce il prelievo in un pozzetto di gel immerso nel tampone all interno della vaschetta per la corsa elettroforetica, facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto. In un pozzetto si mettono 2µL. di marker di 100 pb. In un pozzetto si mette un campione non digerito con 5µL di colorante Si accende l interruttore del power fissando il voltaggio a 120 Volt Osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA che,essendo incolore,non si può vedere. Al termine della corsa, si prende il gel e lo si osserva al transilluminatore 7. Strumentazione e materiale a disposizione provette eppendorf, portaprovette micropipettatrici P20, P200, puntali per micropipette termociclatore, centrifuga power supply (alimentatore), vaschetta e pettine per elettroforesi beuta, becker, cilindro graduato, spatola bagnomaria carta, contenitori per ghiaccio guanti monouso, camice 17

18 SITI WEB: BIBLIOGRAFIA 1.A.Nieters,N.Becker,J.Linseisen. Polymorphisms in candidate obesità genes and their interaction with dietary intake of n-6 polynsatured fatty acids affect obesità risk in a sub-sample of the EPIC-Heidelberg cohort.eur J Nutr T.Wang,M.Huang,W.Chang,A.Shan Ko, E.Tsai,C.M.Lee,Y.Ko. G-2548A Polymorphism of the Leptin Gene is correlated with Extreme Obesità in Taiwanese Aborigines.Obesity D.M.Muoio,G.L.Dohm.Peripheral metabolic actions of leptin. Best Practice & Clinical Endocrinology and Metabolism J.M.Friedman.Leptin at 14y of age : an ongoing story.am J Clin Nutr C.Ragin,C.Dallal,M.Okobia,F.Modugno,J.Chen,S.Garte,E.Taioli. Inf.Agent Cancer N.Isse,Y.Ogawa,N.Tamura,H.Masuzaki,K.Mori,T.Okazaki,.Structural Organisation and Chromosomal Assignement of the Human obese Gene.J Biol Chemistry GLOSSARIO. Annealing Elettroforesi Enzima Enzimi di restrizione Fenotipo Frammenti di restrizione Gene Genoma Genotipo Isoforma. Locus (appaiamento) formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla complementarietà delle basi. tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante la migrazione in un campo elettrico. proteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce il substrato su cui agire. chiamati anche endonucleasi di restrizione o forbici molecolari : sono enzimi che tagliano il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!) in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche, dette siti di restrizione insieme delle caratteristiche visibili di un organismo, che risultano dall interazione tra genotipo e ambiente. frammenti provenienti da una molecola di DNA più lunga per digestione con enzimi di restrizione unità ereditaria funzionale corrispondente generalmente al segmento di DNA che codifica una proteina. patrimonio genetico di una cellula o di un organismo. costituzione genetica di un organismo. Un tempo si riteneva che ogni gene codificasse per un unico prodotto polipeptidico o molecola di RNA, mentre oggi si sa che la maggioranza di geni umani specifica 2 o più forme alternative di proteine. ( plurale loci) posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel liguaggio comune il termine viene spesso usato come sinonimo di gene. Marcatore genetico qualsiasi differenza fenotipica, controllata geneticamente, utilizzata nell analisi genetica Oligonucleotide corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche decine di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di ibridazione molecolare e nella PCR 18

19 PCR (polymerase chain reaction) tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo segmenti specifici di DNA Polimorfismo esistenza di forme diverse di: alleli (polimorfismo allelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA). Polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (lunghezza variabile dei frammenti di restrizione). Polimorfismo del DNA, che si evidenzia trattando cromosomi omologhi con enzimi di restrizione. Determinato da una differenza di una base tra due DNA omologhi, differenza che causa la presenza o assenza di un sito di restrizione per uno specifico enzima di restrizione, e quindi frammenti di diversa lunghezza dopo trattamento con quell enzima. Primer corta catena polinucleotidica, a DNA o RNA, alla quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi nel corso della sintesi di DNA. Noto anche con il termine di innesco. Nella PCR si utilizza una coppia di primer. Promotore regione del DNA a cui si lega la RNA-polimerasi per avviare la trascrizione del gene(cioè la sintesi dell'rna-messaggero). Funziona come un "interruttore molecolare" che "accende" o "spegne" il gene. regioni di controllo sequenze del DNA che attivano e regolano l'espressione di un gene. La loro presenza è pertanto necessaria per la corretta e efficace espressione del gene. RNA-messaggero (mrna) copia a singolo filamento della sequenza nucleotidica di un gene, che trasporta ai ribosomi l'informazione per la sintesi (traduzione) della proteina corrispondente. Splicing del RNA processo in cui le sequenze introniche sono eliminate dai trascritti primari di RNA nel nucleo durante la trascrizione, per dar luogo alla produzione di molecole di mrnamaturo. Splicing alternativo Sequenze palindromiche assemblaggio differenziale di esoni durante la maturazione dell RNA. Si stima che più del 60% dei geni umani produca 2 o più proteine mediante questo meccanismo. Molti esoni specificano domini proteici strutturali distinti che possono essere combinati in modo diverso nelle cellule dei diversi tessuti nei quali il gene è espresso..si ottengono così isoforme tessuto-specifiche. sequenza nucleotidica che è identica al suo filamento complementare quando entrambi vengono letti nella stessa direzione chimica (es 5'-->3'). Esempio GATC. Siti di restrizione sequenza di basi ben determinata riconosciuta e tagliata dagli enzimi di restrizione in modo da lasciare corte sequenze a singola elica, dette estremità coesive poiché le loro basi sono complementari. 19

Protocollo Crime Scene Investigation

Protocollo Crime Scene Investigation Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!

Dettagli

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione

Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3. Criteri di identificazione Identificazione dei microrganismi mediante tecniche di biologia molecolare Esercitazione n 3 Criteri di identificazione Tradizionale (fenotipo) Tecniche di biologia molecolare Il livello di risoluzione

Dettagli

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING SCOPO DELL'ATTIVITÀ Ciascuno studente estrae il proprio DNA da cellule della mucosa boccale. Quindi, mediante PCR, vengono amplificati frammenti corrispondenti

Dettagli

I marcatori molecolari. Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene

I marcatori molecolari. Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene I marcatori molecolari Dipartimento di Scienze Agronomiche e Genetica Vegetale Agraria Corso di Genetica Agraria Giovanna Attene Marcatori molecolari del DNA I marcatori molecolari sono sequenze di DNA

Dettagli

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO La collaborazione con il Virgilio e il progetto dell IFOM Il progetto DNA chiavi in mano è un percorso pensato dal Centro di Ricerca internazionale IFOM per avvicinare i ragazzi

Dettagli

PCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani,

PCR. (Reazione a catena della polimerasi) ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO. Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, PCR (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di INGEGNERIA GENETICA, Prof. Renato Fani, ESERCITAZIONE DI LAB. N.2 La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica

Dettagli

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune:

III giorno: Da questo punto in poi, per entrambe le tipologie di campioni, si segue un protocollo comune: III giorno: 1) Estrazione del DNA genomico da campioni SECCHI e da coltura liquida 2) Preparazione del gel di agarosio 3) Corsa del DNA genomico in gel di agarosio e sua visualizzazione 4) PCR del DNA

Dettagli

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)

Dettagli

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano PROGETTO DNA chiavi in mano IFOM PROGETTO DNA

Dettagli

I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta

I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali. Dott.ssa Chiara Targhetta I marcatori genetici e loro applicazioni nelle produzioni animali Dott.ssa Chiara Targhetta LOCUS localizzazione genomica unica all interno di un cromosoma; permette di definire la posizione di un gene

Dettagli

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA

Dettagli

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE

DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE DNA - DENATURAZIONE E RIASSOCIAZIONE Il doppio strand della molecola di DNA può denaturarsi dando due singoli strand ad alte temperature (>90 C). Due strand di DNA complementari possono accoppiarsi dando

Dettagli

Esperienza 2: gli enzimi di restrizione

Esperienza 2: gli enzimi di restrizione Esperienza 2: gli enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono delle proteine sintetizzate dai batteri per proteggersi dalle infezioni virali (batteriofagi). Questi enzimi tagliano il DNA virale

Dettagli

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi

Dettagli

Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie Primo anno della Laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico 2004-2005

Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie Primo anno della Laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico 2004-2005 Scuola Universitaria Interfacoltà per le Biotecnologie Primo anno della Laurea specialistica in Biotecnologie molecolari Anno Accademico 2004-2005 ALESSIA PERINO La leptina è una piccola proteina non glicosilata

Dettagli

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92 PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92 Elementi trasponibili Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in

Dettagli

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi

Dettagli

Analisi molecolare dei geni

Analisi molecolare dei geni Analisi molecolare dei geni Denaturazione e rinaturazione di una molecola di DNA Si rompono i legami idrogeno 100 C Denaturazione del DNA Rinaturazione per riassociazione delle sequenze complementari Ogni

Dettagli

Polimorfismi LEZIONE 6. By NA 1

Polimorfismi LEZIONE 6. By NA 1 Polimorfismi LEZIONE 6 By NA 1 * Polimorfismo Variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1% Variazioni nell aspetto By NA 2 Polimorfismo proteico Variazione presente nella popolazione

Dettagli

ENZIMI DI RESTRIZIONE

ENZIMI DI RESTRIZIONE ENZIMI DI RESTRIZIONE La scoperta degli enzimi di restrizione e modificazione Intorno agli anni 50 si notò che talvolta l introduzione in E.coli di DNA esogeno, proveniente da un diverso ceppo di E.coli,

Dettagli

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni

Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Diagnostica Biomolecolare: Tecnologie e Applicazioni Preparazione dei campioni: (Estrazione del DNA o dell RNA dal tessuto di interesse) Analisi delle mutazioni: SSCP DHPLC Dot blot - Southern - PCR (ARMS

Dettagli

scienza come gioco i segreti del DNA

scienza come gioco i segreti del DNA IS science centre immaginario scientifico Laboratorio dell'immaginario Scientifico - Trieste tel. 040224424 - fax 040224439 - e-mail: lis@lis.trieste.it - www.immaginarioscientifico.it indice Estrazione

Dettagli

Esperienza 10: la PCR

Esperienza 10: la PCR Esperienza 10: la PCR La tecnica della polimerizzazione a catena (in inglese polymerase chain reaction) o PCR, permette di amplificare milioni di volte un unico frammento di DNA. Questo metodo è diventato

Dettagli

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

Dettagli

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine)

Isolamento e purificazione di DNA e RNA. -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) Isolamento e purificazione di DNA e RNA -Rompere la membrana cellulare -Separare gli acidi nucleici da altri componenti cellulari (lipidi e proteine) -Separare gli acidi nucleici tra loro -Rompere la membrana

Dettagli

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR (Polymerase Chain Reaction) Metodo enzimatico estremamente rapido e semplice per produrre una quantità illimitata di copie della sequenza di un singolo gene Sometime a good idea comes to yow when you

Dettagli

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR)

AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI (PCR) PCR: reazione polimerasica a catena Inventata da Kary Mullis negli anni 80 (premio Nobel 1993) Serve per ottenere una grande quantita

Dettagli

Tecniche Diagnostiche molecolari

Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche di Biologia Molecolare La scoperta che il DNA è alla base di tutte le funzioni della cellula ha aperto la strada allo sviluppo di una disciplina denominata biologia

Dettagli

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori Istruzioni d uso BAG Cycler Check REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori pronto all uso, prealiquotato Indice 1. Descrizione del

Dettagli

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di Ingegneria Genetica e Microbiologa Applicata Prof. Renato Fani Percorso1: Analisi della variabilità genetica di popolazioni

Dettagli

ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI prof.ssa Daniela Gallo

ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI prof.ssa Daniela Gallo ISOLAMENTO E PURIFICAZIONE DEGLI ACIDI NUCLEICI prof.ssa Daniela Gallo INTRODUZIONE Acidi nucleici Gli acidi nucleici sono una famiglia eterogenea di macromolecole distribuite all interno di tutte le cellule

Dettagli

Replicazione del DNA

Replicazione del DNA Replicazione del DNA la replicazione del DNA viene effettuata da ENZIMI: DNA-polimerasi (catalizza la formazione del legame fosfodiestere) ogni filamento fa da stampo (enzima diretto dallo stampo) le DNA-polimerasi

Dettagli

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA Materiali biologici In questo file sono elencati, capitolo per capitolo, i materiali biologici da richiedere al CusMiBio (o centro simile) per realizzare gli esperimenti che abbiamo illustrato (www.cusmibio.unimi.it).

Dettagli

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Il primo passaggio per la maggior parte delle procedure che verranno trattate in questo corso consiste nell estrazione del DNA (e dell RNA) da materiale biologico, e nella sua purificazione mediante separazione

Dettagli

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte

PCR. PCR o reazione di polimerizzazione a catena. Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte PCR Prof.ssa Flavia Frabetti PCR o reazione di polimerizzazione a catena Fine anni 80 Amplificazione esponenziale di DNA. Puo amplificare un tratto di DNA per piu di 1 milione di volte Permette di estrarre

Dettagli

Elettroforesi degli acidi nucleici

Elettroforesi degli acidi nucleici Elettroforesi degli acidi nucleici Una volta che i frammenti del DNA o del RNA da analizzare sono stati amplificati con la reazione PCR è necessario separarli ed identificarli. A tale scopo si utilizza

Dettagli

ELETTROFORESI SU GEL

ELETTROFORESI SU GEL ELETTROFORESI SU GEL Permette la separazione di frammenti di DNA/RNA da una miscela complessa E una tecnica fondamentale per: l analisi (elettroforesi analitica) la purificazione degli acidi nucleici (elettroforesi

Dettagli

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction)

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI. ( PCR =Polymerase Chain Reaction) REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI ( PCR =Polymerase Chain Reaction) Verso la metà degli anni 80, il biochimico Kary Mullis mise a punto un metodo estremamente rapido e semplice per produrre una quantità

Dettagli

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione SINTESI DELL RNA Replicazione Trascrizione Traduzione L RNA ha origine da informazioni contenute nel DNA La TRASCRIZIONE permette la conversione di una porzione di DNA in una molecola di RNA con una sequenza

Dettagli

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici

Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Tecniche molecolari per lo studio degli acidi nucleici Prof.ssa Flavia Frabetti aa. 2010-11 Estrazione acidi nucleici (DNA o RNA) Verifica tramite elettroforesi su gel di agarosio Amplificazione o clonaggio

Dettagli

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009 Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di 22-26 giugno 2009 DNA umano 1 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine

Dettagli

Corso di: GESTIONE FAUNISTICA. Prof. Bernardino Ragni

Corso di: GESTIONE FAUNISTICA. Prof. Bernardino Ragni Corso di: GESTIONE FAUNISTICA Prof. Bernardino Ragni Università degli Studi di Perugia Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche Naturali Corso di laurea in Scienze Naturali LAUREA MAGISTRALE Caso di studio:

Dettagli

Dott.ssa Renata Tisi. Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it

Dott.ssa Renata Tisi. Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere l informazione genetica nelle cellule,

Dettagli

Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010. Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA

Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010. Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA Corso di Laurea in Biotecnologie Anno-Accademico 2009-2010 Percorso nº 3: Clonaggio di segmenti di DNA 11-5-2010 I plasmidi: un mondo da esplorare. Elementi genetici capaci di replicarsi autonomamente

Dettagli

Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole?

Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole? Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole? Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105 Indice 1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cosa è il DNA p. 3 1.2 Struttura

Dettagli

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica

Dettagli

Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni?

Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni? Biotecnologie ed OGM : come vengono trasferiti i geni? a cura di Leonardo Magneschi Scuola Estiva di Orientamento Volterra 2007 Venerdì 29 giugno 2007 1 Introduzione all Ingegneria Genetica L ingeneria

Dettagli

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012

Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 Lezione XLI-XLII martedì 17-1-2012 corso di genomica aula 8 orario : Martedì ore 14.00-16.00 Giovedì ore 13.00-15.00 Esami 31- gennaio 2012 7- febbraio 2012 28 - febbraio 2012 D. Frezza Esercitazione II

Dettagli

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI 62 1. Pazienti con IBS Per eseguire l analisi del polimorfismo 5HTTLPR è stato necessario ottenere campioni di sangue intero o saliva dai quali estrarre il DNA genomico. A tal fine è

Dettagli

DNA footprinting. Interazioni DNA-proteine. Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi.

DNA footprinting. Interazioni DNA-proteine. Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. Interazioni DNA-proteine Il promotore è la regione di DNA al 5 di un gene, dove si lega la RNA polimerasi. L analisi della sequenza dei primi promotori nei batteri non rivelò, come atteso, la stessa sequenza

Dettagli

Progetto della classe II C

Progetto della classe II C Progetto della classe II C Preparazione allo svolgimento dell esperienza La II C è preparata all esperienza presso il centro di ricerca E.B.R.I. iniziando un intenso lavoro di approfondimento sulla genetica

Dettagli

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando

Dettagli

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno).

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Programma: Giorno 1Preparazione di DNA genomico da foglie 2 - Controllo qualità DNA

Dettagli

OBESITA. 11 Aprile 2013

OBESITA. 11 Aprile 2013 OBESITA 11 Aprile 2013 L obesità è una patologia cronica caratterizzata dall eccessivo accumulo di tessuto adiposo nell organismo ed è causata da fattori ereditari e non ereditari che determinano un introito

Dettagli

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo

SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo C.R.A. Consiglio per la Ricerca in Agricoltura Centro di ricerca per la genomica Fiorenzuola d Arda (Piacenza) SELEZIONE ASSISTITA PER LA RESISTENZA patogeni in orzo Tutor: Dott. Gianni TACCONI Studente:

Dettagli

Kit didattico Edvotek: la Tecnica del DNA fingerprinting

Kit didattico Edvotek: la Tecnica del DNA fingerprinting International pbi S.p.A. Milano Copyright pbi MARZO 2003 Kit didattico Edvotek: la Tecnica del DNA fingerprinting Introduzione L analisi del profilo di restrizione del DNA, detto anche DNA fingerprinting,

Dettagli

Metodiche Molecolari

Metodiche Molecolari Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare

Dettagli

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Caratterizzazione molecolare delle Distrofie Muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD): diagnosi di malattia e studi familari L Proda esegue le indagini molecolari per le Distrofie muscolari di Duchenne

Dettagli

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni

Dettagli

Dott.ssa Ilaria Barchetta

Dott.ssa Ilaria Barchetta Dott.ssa Ilaria Barchetta Dipartimento di Medicina Interna e Specialità Mediche Sapienza Università di Roma Diverse evidenze sperimentali hanno dimostrato una influenza diretta della vitamina D non solo

Dettagli

DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA

Dettagli

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di

Dettagli

METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI

METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI METODI DI MARCATURA DEGLI ACIDI NUCLEICI Marcatura di acidi nucleici Una sonda per ibridazione è una molecola di DNA marcata, con una sequenza complementare al DNA bersaglio da individuare. Poiché la sonda

Dettagli

Metodi di analisi mutazionale

Metodi di analisi mutazionale Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,

Dettagli

Corso di Biologia Molecolare

Corso di Biologia Molecolare Corso di Biologia Molecolare Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Acidi nucleici Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere

Dettagli

Corso di Biologia Molecolare

Corso di Biologia Molecolare Corso di Biologia Molecolare Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Acidi nucleici Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere

Dettagli

Biotecnologie e bonifica ambientale

Biotecnologie e bonifica ambientale Biotecnologie e bonifica ambientale Prof. Laura Martinis Liceo Scientifico G. Marinelli Prof. Massimo Vischi e Luca Marchiol - Facoltà di Scienze Agrarie dell Università di Udine Cl. III B Noi studenti

Dettagli

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE INDICE DNA ricombinante e sue applicazioni Tecniche del DNA ricombinante Inserzione di un gene in un plasmide Progetto Genoma Umano Biotecnologie e loro applicazioni Organismi

Dettagli

Principali tecniche di base

Principali tecniche di base Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione (Southern blotting) PCR (Polymerase Chain Reaction) (Sequenziamento) Tecniche di base Enzimi di di restrizione

Dettagli

I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE

I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE I MARCATORI GENETICI APPLICAZIONE AL SETTORE FORESTALE Un marcatore genetico è un qualsiasi fattore ereditario (quindi trasmissibile alla progenie) di cui esistano più varianti genotipiche. Essi consentono

Dettagli

Dott.ssa Quintarelli Concetta

Dott.ssa Quintarelli Concetta Dott.ssa Quintarelli Concetta Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Pre-PCR Accetazione Post-PCR Refertazione Area PCR GUANTI MONOUSO PUNTALI CON FILTRO CESTELLO PER GHIACCIO TUBINI PCR Materiale

Dettagli

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

Dettagli

NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI

NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI NUCLEOTIDI e ACIDI NUCLEICI Struttura dei nucleotidi Il gruppo fosfato conferisce carica negativa e proprietà acide FUNZIONI DEI NUCLEOTIDI MOLECOLE DI RISERVA DI ENERGIA L idrolisi dei nucleosidi trifosfato

Dettagli

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono

Dettagli

Elementi di genetica di base e marcatori molecolari. Dott.ssa Marica Soattin

Elementi di genetica di base e marcatori molecolari. Dott.ssa Marica Soattin Elementi di genetica di base e marcatori molecolari Dott.ssa Marica Soattin Organismi animali costituiti da cellule di tipo eucariote Cellule con nucleo differenziato delimitato da membrana e organelli

Dettagli

DNA - RNA. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi.

DNA - RNA. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi. DNA - RNA Le unità fondamentali costituenti il DNA e l RNA sono i Nucleotidi. Nucleotide = Gruppo Fosforico + Zucchero Pentoso + Base Azotata. Esistono 4 basi azotate per il DNA e 4 per RNA Differenze

Dettagli

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione.

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione. Soluzioni ai problemi del Capitolo 12 Domande concettuali C1. A. I geni dei trna codificano molecole di trna e i geni degli rrna le molecole di rrna che si trovano nei ribosomi. Esistono anche dei geni

Dettagli

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA

Dettagli

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica

Biologia molecolare clinica. Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Biologia molecolare clinica Organizzazione del laboratorio di biologia molecolare clinica Le tecniche di biologia molecolare negli ultimi anni si sono diffuse nei laboratori di diagnostica clinica dove

Dettagli

PURIFICAZIONE DI DNA

PURIFICAZIONE DI DNA PURIFICAZIONE DI DNA Esistono diverse metodiche per la purificazione di DNA da cellule microbiche, più o meno complesse secondo il grado di purezza e d integrità che si desidera ottenere. In tutti i casi

Dettagli

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del gene PV92 Ci fu un tempo in cui per amplificare il DNA, dovevi crescere tonnellate e tonnellate di piccole cellule. Poi è arrivato un ragazzo di nome Dr. Kary Mullis, Ha detto che si può amplificare in vitro altrettanto

Dettagli

Definizione di genoteca (o library) di DNA

Definizione di genoteca (o library) di DNA Definizione di genoteca (o library) di DNA Collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio. Possono essere di DNA genomico o di cdna. Libreria genomica: collezione

Dettagli

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la LABORATORIO 2: ESTRAZIONE ED ANALISI ELETTROFORETICA DI DNA GENOMICO Come fare? Seguiamo 3 semplici passaggi: Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la carne) Alcol Cooome?? E' così facile??

Dettagli

Biologia Cellulare e DNA «Bigino»

Biologia Cellulare e DNA «Bigino» Biologia Cellulare e DNA «Bigino» Giulio Barigelletti www.baveno.net Premesse 2 Sempre più frequentemente si sente parlare di DNA, Proteine, Amminoacidi, etc., relazionati all esistenza dell essere umano.

Dettagli

Lezioni di biotecnologie

Lezioni di biotecnologie Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 2 Analisi del DNA e delle proteine 3 Analizzare DNA e proteine Per le applicazioni delle biotecnologie è di fondamentale importanza: 1. essere in grado di identificare

Dettagli

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

SEQUENZIAMENTO DEL DNA SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico

Dettagli

Diagnosi genetiche molecolari

Diagnosi genetiche molecolari Diagnosi genetiche molecolari INDICAZIONI per la diagnosi genetica Ricorrenza nella famiglia di una malattia genetica - identificazione dei portatori - confermare la diagnosi basata sul quadro clinico

Dettagli

Le idee della chimica

Le idee della chimica G. Valitutti A.Tifi A.Gentile Seconda edizione Copyright 2009 Zanichelli editore Capitolo 25 Le basi della biochimica 1. I carboidrati 2. I lipidi 3. Gli amminoacidi, i peptidi e le proteine 4. La struttura

Dettagli

Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi

Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi Sequenziamento del DNA: strutture dei nucleotidi il metodo di Sanger 2-3 DIDEOSSINUCLEOTIDI Il contenuto di ciascuna provetta viene caricato in 4 pozzetti separati di un gel di poliacrilammide * Indica

Dettagli

PROGETTO VERSO IL FUTURO CON L INGEGNERIA GENETICA a.s. 2012/2013

PROGETTO VERSO IL FUTURO CON L INGEGNERIA GENETICA a.s. 2012/2013 PROGETTO VERSO IL FUTURO CON L INGEGNERIA GENETICA a.s. 2012/2013 PROTOCOLLI SPERIMENTALI FASE 1: Preparazione delle cellule competenti modificato da Maniatis Metodo Materiali Motivazioni Strumenti Utilizzare

Dettagli

RNA polimerasi operone. L operatore è il tratto

RNA polimerasi operone. L operatore è il tratto La regolazione genica nei procarioti Alcune proteine vengono prodotte dalla cellula ad un ritmo relativamente costante e l attività dei geni che codificano queste proteine non è regolata in modo sofisticato.

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). End point PCR vs quantitative Real-Time PCR PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando

Dettagli

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92 Ci fu un tempo in cui per amplificare il DNA, dovevi crescere tonnellate e tonnellate di piccole celle. Poi è arrivato un ragazzo di nome Dr. Kary Mullis, Ha detto che si può amplificare in vitro altrettanto

Dettagli

RNA interference. La tecnologia dell RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico

RNA interference. La tecnologia dell RNAi è basata su un processo di inattivazione genica post-trascrizionale, altamente specifico RNA interference Tecnica che permette di interferire con l espressione di alcuni geni mediante la trasfezione di piccoli frammenti di RNA a doppio filamento in grado di antagonizzare l RNA messaggero corrispondente.

Dettagli

La regolazione genica nei eucarioti

La regolazione genica nei eucarioti La regolazione genica nei eucarioti Lic. Scientifico A. Meucci Aprilia Prof. Rolando Neri Differenziamento negli eucarioti pluricellulari Negli eucarioti le cellule specializzate dei vari tessuti contengono

Dettagli

Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio

Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio Emiliano Giovanni Vavassori e.vavassori@sssup.it Allievo Ordinario Settore di Agraria Scuola Superiore di Studi Universitari e di Perfezionamento Sant

Dettagli

Strumenti e Tecniche di studio in patologia

Strumenti e Tecniche di studio in patologia Strumenti e Tecniche di studio in patologia Gli strumenti della patologia: Microscopia Biologia molecolare Indagini biochimiche Microscopia Ottica citopatologia ed istopatologia citochimica ed istochimica

Dettagli

Riprendiamo ora il cosiddetto dogma centrale della biologia: dal gene alla proteina

Riprendiamo ora il cosiddetto dogma centrale della biologia: dal gene alla proteina Riprendiamo ora il cosiddetto dogma centrale della biologia: dal gene alla proteina trascrizione traduzione L mrna lascia il nucleo e si posiziona sugli organelli chiamati ribosomi, contenenti rrna Trascrizione

Dettagli