DALLA MALATTIA AL GENE :

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1 UN PERCORSO METODOLOGICO DI STUDIO IN GENETICA DALLA MALATTIA AL GENE : LA LEPTINA E L OBESITA UNIVERSITA DEGLI STUDI DI GENOVA LABORATORIO DI GENETICA MOLECOLARE-IRRCS GASLINI GENOVA ISTITUTO PER LA CURA E LA PREVENZIONE DEL CANCRO- GENOVA 1

2 LA LEPTINA 2

3 INDICE 1. Le basi genetiche dell obesità pag La leptina regola il metabolismo energetico pag.4 I recettori periferici della leptina 3. Il gene ob e l identificazione della leptina pag I Polimorfismi di sequenza del DNA pag. 8 Gli Enzimi di restrizione I RFLP e gli SNPs Frequenza degli SNPs Individuazione degli SNPs 5. Analisi molecolare del DNA. pag. 11 Estrazione del DNA. La tecnica della PCR per l analisi dei polimorfismi Termociclatori.Taq polimerasi.primer. Digestione con Enzimi di restrizione (ER) Elettroforesi su gel di Agarosio 6. Attività di Laboratorio pag.14 - Estrazione del DNA - PCR - Digestione con Enzimi di restrizione - Elettroforesi su gel di Agarosio 7. Strumenti e materiale a disposizione pag Bibliografia pag Glossario 3

4 1. BASI GENETICHE DELL OBESITA. La maggior parte degli animali,compresi gli esseri umani, tende ad avere un peso corporeo stabile; in altre parole, se è consentito loro di mangiare a volontà, essi mangiano quanto basta per mantenere il peso corporeo stabilito. Tuttavia un ceppo di topi omozigoti per difetti nel gene obese (detti topi ob/ob) sono caratterizzati da un peso superiore al doppio rispetto a quello dei topi normali (OB/OB) e si nutrono in eccesso quando possono accedere a quantità illimitate di cibo. I topi obesi sono privi della proteina leptina, il prodotto del gene obese. Questi topi omozigoti ob/ob mostrano una sindrome di obesità caratterizzata da una grave adiposità, iperfagia, ipotermia, iperlipidemia, iperinsulinemia, resistenza all insulina. Il gene ob fu clonato nel 1994 e la leptina fu identificata nel 1995 quale prodotto del gene ob e segnale ormonale regolatorio del bilancio energetico. 2.LA LEPTINA REGOLA IL METABOLISMO ENERGETICO La leptina è un ormone peptidico di 167 aminoacidi, di circa 16 kda, ed ha un singolo legame disolfuro, necessario per la sua attività. E prodotta normalmente e in grande quantità dagli adipociti e regola il tessuto adiposo e il bilancio massa corporea/energia, ma è presente anche nello stomaco, nei muscoli, nella placenta e in alcuni tessuti fetali. La leptina circola nel sangue e agisce sul cervello regolando la quantità di cibo da introdurre in rapporto al dispendio energetico. Quando la massa grassa diminuisce, si abbassa la concentrazione di leptina plasmatica stimolando l appetito. Viceversa, se la massa grassa aumenta, aumenta la concentrazione di leptina che inibisce l appetito. Questo sistema controlla l equilibrio omeostatico del tessuto adiposo. Quando si inietta leptina nei topi ob/ob, questi mangiano meno e perdono peso. La leptina è quindi considerata un segnale di sazietà che influenza il sistema di controllo dell appetito presente nel cervello. E stato inoltre scoperto che la leptina regola il metabolismo energetico, così come il consumo di energia. Nei roditori, l assunzione di leptina aumenta la spesa energetica e diminuisce la massa grassa senza interferire con la massa magra corporea. Se viene somministrata a topi, la leptina normalizza la glicemia, il livello di insulina e di lipidi e la temperatura corporea. Mentre sembra che i recettori periferici per la leptina non siano essenziali per la perdita di peso, invece le azioni della leptina mediate a livello centrale si presume siano determinanti nel regolare l equilibrio generale dell organismo. I recettori periferici della Leptina La semplice base genetica dell obesità riscontrata nei topi ob/ob non sembra applicabile alla maggior parte delle persone obese. Nell uomo i livelli di leptina aumentano con la percentuale di grasso corporeo, in accordo con l ipotesi riguardante la sintesi di leptina da parte degli adipociti. Negli esseri umani, tuttavia l obesità non sembra il risultato di una mancata produzione di leptina, ma di una re s istenza alla leptina dovuta forse a una diminuzione della concentrazione di un recettore per la leptina presente nel cervello, precisamente nell ipotalamo e nel plesso coroideo, aree del cervello note per il controllo del comportamento alimentare; oppure a una saturazione s azi del recettore ettor e che trasporta la leptina nel sistema nervoso centrale, attraverso la barriera emato-encefalica. Lo splicing alternativo del gene per il recettore della leptina produce almeno 5 isoforme di RNAm che si esprimono in un modo tessuto-specifico e codificano per proteine che hanno domini extracellulari identici, ma diversi domini transmembrana. I recettori sono divisi in 4

5 due gruppi: un gruppo che ha piccoli domini intracellulari (32-97 residui di AA) ed altri che hanno un grande dominio intracellulare di 302 residui. I recettori per la leptina furono identificati biochimicamente e risultarono appartenere alla famiglia delle citochine; sono caratterizzati da un singolo dominio trans-membrana che si associa con una classe di proteine tirosin-chinasi definite Janus Chinasi (JAK). Le JAK legano il ligando mediante fosforilazione della tirosina di proteine segnale come l IP3-kinasi o una famiglia di fattori di traduzione e attivatori della trascrizione. Il controllo, sia sui topi obesi ob/ob che sui topi diabetici db/db (diabete), suggerisce che la leptina regola l equilibrio immagazzinamento/ossidazione degli acidi grassi. Il muscolo scheletrico esprime entrambi i due tipi di recettori per la leptina e contribuisce in modo significativo al catabolismo lipidico; questo significa che il muscolo scheletrico rappresenta un target per la leptina periferica. Nei topi a cui veniva fornita un alta concentrazione di leptina si è osservato un aumento dell ossidazione degli acidi grassi e una diminuzione dell esterificazione a triacilgliceroli (TAG). L Insulina ha l effetto opposto. Ma quando i due ormoni vengono somministrati insieme, la leptina attenua gli effetti antiossidanti e lipogenici dell Insulina. Uno studio recente mostra che gli effetti acuti della leptina sulla ß-ox dei grassi sono mediati dalla Proteina-kinasi-AMPdip.(AMPK), un enzima che è attivato dalle variazioni di concentrazione del rapporto AMP/ATP. Pertanto, sia nel muscolo che nel tessuto adiposo, la leptina determina: In sintesi. - aumento della ß -OX dei grassi - aumento della lipolisi - diminuzione della sintesi di TAG La leptina è un ormone che regola la termogenesi e controlla il peso corporeo di un individuo sia stimolando l ossidazione degli acidi grassi e l assorbimento del glucosio sia prevenendo il deposito dei lipidi in tessuti non adiposi. Agisce con azione sia periferica, attivando il sistema nervoso periferico, sia centrale, influenzando le funzioni dell ipotalamo. È secreto dalle cellule del tessuto adiposo, gli adipociti, sembra quindi chiaro che in presenza di sovrabbondanza di esse si avrà una maggiore produzione di leptina, in caso contrario, cioè in carenza di cellule adipose, si assisterà a un abbassamento dei livelli dell ormone. È in grado di diminuire il senso della fame e, tramite la termogenesi adattativa, aumentare la spesa energetica dell organismo. La struttura biochimica della leptina è assimilabile a quella delle citochine con catene a lunga elica. Tale gruppo di sostanze è una sorta di ponte di comunicazione fra il sistema neuroendocrino e quello immunitario. La secrezione della leptina non è influenzata soltanto dal grado di adiposità e dal bilancio calorico, ma anche dall alta concentrazione nel sangue di determinati ormoni fra i quali ad esempio il testosterone, l adrenalina e gli estrogeni. Recenti studi indicano che la leptina ha un ruolo importante anche nello sviluppo della fase puberale e nella gravidanza, funzionando come una sorta di termometro usato dai centri ipotalamici per verificare la presenza di sufficienti scorte di grasso per iniziare queste importanti fasi. 5

6 Un probabile quadro dei meccanismi segnale della leptina periferica è mostrato nella Fig.1 La leptina prodotta dagli adipociti si lega ai recettori periferici nel tessuto adiposo,nel fegato,nel pancreas e nel muscolo scheletrico, attivando il quadro dei segnali mediati dalle chinasi JAK. La leptina inibisce le azioni lipogeniche dell Insulina attraverso meccanismi non ancora ben identificati. Fegato adipociti LEPTINA L-Receptors pancreas INSULINA I-Receptors PI3K JAK muscolo scheletrico geni lipogenici/ sintesi di colesterolo Metabolismo del GLU Lipolisi termogenesi [AMP]/[ATP] AMPK Acil-CoA epatica DAG TAG Acidi grassi ß-OX Lipogenesi RE Mitocondrio acidi grassi esogeni Fig.1 6

7 3. IL GENE ob. Dal SITO NCBI : LEP Official Symbol LEP and Name: leptin [Homo sapiens] Other Aliases: FLJ94114, OB, OBS Other Designations: leptin (murine obesity homolog); leptin (obesity homolog, mouse); obese, mouse, homolog of; obesity factor Chromosome: 7; Location: 7q31.3 Annotation: Chromosome 7, NC_ ( ) MIM: GeneID: 3952 This gene encodes a protein that is secreted by white adipocytes, and which plays a major role in the regulation of body weight. This protein, which acts through the leptin receptor, functions as part of a signaling pathway that can inhibit food intake and/or regulate energy expenditure to maintain constancy of the adipose mass. This protein also has several endocrine functions, and is involved in the regulation of immune and inflammatory responses, hematopoiesis, angiogenesis and wound healing. Mutations in this gene and/or its regulatory regions cause severe obesity, and morbid obesity with hypogonadism. This gene has also been linked to type 2 diabetes mellitus development. [provided by RefSeq] Genomic regions, transcripts, and products red: coding region blue: untraslated region Genomic context chromosome: 7; Location: 7q31.3 Lep Official Symbol Lep and Name: leptin [Mus musculus] Other Aliases: ob, obese Chromosome: 6; Location: cm Annotation: Chromosome 6, NC_ ( ) GeneID:

8 4. POLIMORFISMI DI SEQUENZA DEL DNA Il termine polimorfismo significa esistenza di forme diverse. In genetica, il polimorfismo può essere analizzato sia a livello proteico che di materiale genetico. In questo secondo caso, le forme diverse, ossia le varianti genetiche possono riguardare un gene, vale a dire un tratto di DNA codificante una proteina (polimorfismo allelico), oppure un tratto di DNA non codificante (polimorfismo di sequenza). Queste diversità di sequenza si definiscono polimorfismi e dato che più del 98% del DNA umano è DNA non codificante, e che quindi la maggior parte di queste differenze è localizzata in sequenze non codificanti, il fenotipo di un polimorfismo di sequenza del DNA non è riconoscibile dall esterno (ex. nei gruppi sanguigni). Dato l elevato numero di loci polimorfici, i polimorfismi di sequenza sono molto più frequenti dei polimorfismi allelici tradizionali (gruppi sanguigni, albinismo, colore degli occhi, ecc..) e conseguentemente più utili nella ricerca biologica e medica. E stato osservato che il DNA di due individui differisce per circa un nucleotide ogni 500/1000. Quando un polimorfismo interessa una sequenza riconosciuta da un Enzima di Restrizione, la variazione, creando o distruggendo il sito di restrizione, darà luogo a differenze nei siti di taglio di quel dato enzima all interno della popolazione. Digerendo con quell enzima il DNA di individui diversi, si osserva quindi un polimorfismo di lunghezza dei frammenti di restrizione RFLP - e cioè dal DNA di individui diversi si generano frammenti di restrizione diversi. Come tutti i polimorfismi, i RFLP possono essere equiparati ad alleli codominanti di un locus mendeliano:la presenza o assenza di uno o dell altro allele può essere riconosciuta in ogni individuo,consentendo la distinzione in omozigoti ed eterozigoti. Il fenotipo di un RFLP è evidenziabile in termini di differenze di numero e/o dimensione dei frammenti di DNA ottenuti con la digestione con un certo enzima di restrizione. I frammenti sono visibili dopo migrazione elettroforetica su un gel. L avvento della genetica molecolare ha permesso di identificare i polimorfismi del DNA, che sono diventati i marcatori genetici più comunemente usati. Attualmente si utilizzano tre tipi di polimorfismi del DNA: i Polimorfismi di Lunghezza dei Frammenti di Restrizione, o RFLP i Polimorfismi del Singolo Nucleotide, o SNP i Polimorfismi di Lunghezza di Sequenze Semplici, o SSLP che vengono poi distinti in VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) o minisatelliti, e i STR (Simple Tandem Repeats ) o microsatelliti. GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE Un Sito di restrizione o sequenza consenso viene definito come una particolare sequenza di DNA riconosciuta da un enzima di restrizione o endonucleasi come il punto in cui tagliare la molecola di DNA. Questi siti sono generalmente palindromici ( cioè possono essere letti in entrambe le direzioni )la cui successione di basi è identica su entrambi i filamenti quando ciascuno di essi venga letto in direzione 5 > 3. La sequenza riconosciuta non è unica e varia da enzima ad enzima, anche se con la stessa specificità di sequenza. Infatti, sebbene gli enzimi di 8

9 restrizione isolati siano oltre 3500, le sequenze bersaglio che possono essere tagliate sono molto meno numerose (poco più di 200 ). I siti di restrizione sono delle normali sequenze di basi, lunghi dai 4 fino a diverse decine di paia di basi, per cui si possono trovare più o meno facilmente nel genoma. Un enzima di restrizione può tagliare all interno di una sequenza o nelle sue vicinanze, oppure la sequenza consenso può anche essere distante diverse centinaia di basi. Il taglio prodotto dagli enzimi può generare frammenti di DNA con estremità piatte (blunt), o sporgenti ( 5 -protruding e 3 -protruding). Le estremità prodotte sono appiccicose, cioè possono formare ponti Idrogeno tra le due code a filamento singolo complementari. Le estremità coesive facilitano inoltre la reazione della DNA ligasi. L enzima EcoRI produce un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento al 5 (5 -protruding): 5...G/ AATTC CTTAA /G...5 L enzima HhaI opera un taglio sfalsato creando due estremità coesive a singolo filamento al 3 (3 -protruding ) : 5 G C G /C 3 3 C/G C G 5 Nome enzima Organismo di provenienza Sequenza d riconoscimento e posizione di taglio Pronuncia EcoRI E.Coli RY13 G/A A T T C C T T A A/G HindIII BamHI Haemophilus influenzae Rd Bacillus amyloliquefaciens A/A G C T T T T C G A /A G/G A T C C C C T A G/G Eco-ri-uno Acca-ind-tre Bam-acca-uno ENZIMI DI RESTRIZIONE. Sono prodotti dai batteri che li utilizzano per difendersi da un DNA estraneo, esempio un virus Altri enzimi (le metilasi ) proteggono il DNA batterico grazie all azione delle proprie endonucleasi di restrizione. Gli ER si indicano con un sistema di lettere e numeri che si riferisce al ceppo batterico da cui sono stati isolati. Polimorfismo a singolo nucleotide o SNPs Un polimorfismo a singolo nucleotide (in inglese Single Nucleotide Polymorphism o SNP, pronunciato snip) è un polimorfismo (cioè una variazione a livello di una sequenza di acidi nucleici) che si presenta tra individui della stessa specie, caratterizzata da una differenza a carico di un unico nucleotide. Ad esempio, se le sequenze individuate in due soggetti sono: AAGCCTA e AAGCTTA 9

10 è presente uno SNP che differenzia i due alleli C e T. Frequenza degli SNPs All interno di una popolazione, è possibile determinare una minor frequenza allelica, il rapporto tra la frequenza della variante più rara e quella più comune di un determinato SNP. È importante notare che possono esistere variazioni notevoli tra popolazioni umane. Uno SNP molto comune in un determinato gruppo etnico può dunque essere molto raro in un altra popolazione. Gli SNPs costituiscono il 90% di tutte le variazioni genetiche umane. SNPs con minor frequenza allelica, pari o maggiore all 1%, sono presenti ogni circa paia di basi lungo l intero genoma. In media, due SNPs su tre vedono una variazione tra citosina e timina. Gli SNPs possono presentarsi all interno di una sequenza codificante di un gene, all interno di una regione intronica o in una regione intergenica. Gli SNPs all interno di un gene, in ogni caso, non necessariamente modificano la sequenza amminoacidica codificata, dal momento che il codice genetico è degenerato. Uno SNP che genera in tutte le sue forme lo stesso peptide è detto sinonimo (synonymous); in caso contrario è detto non-sinonimo (non-synonymous). Individuazione degli SNPs Un metodo utile per individuare gli SNPs è la valutazione dei cosiddetti polimorfismi di lunghezza dei frammenti di restrizione (Restriction fragment length polymorphisms) o RFLP. Se un allele contiene un sito di riconoscimento per un enzima di restrizione ed un altro no, la digestione dei due alleli genererà due frammenti di dimensione differente. In realtà oggi gli SNPs sono studiati principalmente attraverso i microarrays, che permettono l analisi simultanea di centinaia di diversi SNPs ed una veloce analisi elaborata da un computer. L allele 2 ha una mutazione : A -> C che elimina un sito di restrizione di EcoRI. GAATTC GACTTC Trattando il DNA con l enzima, F <-R F--> R l allele 2 non viene tagliato in quel sito Sono mostrati due frammenti di restrizione ottenuti 350 con digestione con l enzima EcoRI di due alleli (1 e 2) di un gene. 150 Potenzialità degli SNPs L allele 1 è interrotto da un sito di taglio per l enzima EcoRI (GAATTC) allele2 allele1 eterozigote l allele 2, a causa di una mutazione di una singola base, non presenta il sito di taglio (GACTTC). Lo studio degli SNPs è molto utile poiché variazioni anche di singoli nucleotidi possono influenzare lo sviluppo delle patologie o la risposta ai patogeni, agli agenti chimici, ai farmaci. Per tale motivo gli SNPs possono 10

11 5. ANALISI MOLECOLARE DEL DNA. ESTRAZIONE DEL DNA. Il DNA può essere estratto da qualunque cellula nucleata. I tipi cellulari più utilizzati sono rappresentati dai leucociti di sangue periferico, colture cellulari (fibroblasti, amniociti,villi coriali). L isolamento del DNA richiede l utilizzo di enzimi capaci di distruggere le membrane cellulari e nucleari e di solventi organici in grado di separare le proteine dagli acidi nucleici. Nella procedura classica di estrazione del DNA genomico, le cellule vengono lisate e sottoposte a trattamento proteolitico con Proteinasi K, eliminata successivamente con estrazioni fenoliche.il DNA purificato viene precipitato in Etanolo.La determinazione quantitativa della concentrazione del DNA estratto, calcolata in ng/µl, viene effettuata mediante lettura spettrofotometrica valutando l assorbanza del campione a 260 nm. LA TECNICA DELLA PCR PER L ANALISI DEI RFLP L introduzione della PCR, la tecnica che consente di amplificare selettivamente un tratto di DNA, ha rivoluzionato la genetica molecolare e le sue applicazioni sono praticamente infinite. Uno degli ambiti di utilizzo è la diagnosi di malattie genetiche mediante analisi di RFLP. L utilizzo della PCR semplifica molte cose. Ad esempio, la PCR consente di analizzare uno specifico tratto di DNA, invece di dover lavorare su tutto il DNA nucleare di una cellula,ossia sul DNA genomico. La PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica di amplificazione in vitro di un frammento di DNA di cui si conosca la sequenza nucleotidica delle regioni terminali. Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA genomico a doppio filamento e due corte sequenze oligonucleotidiche (primer), di cui una complementare ad un tratto di filamento a una estremità del DNA da amplificare (forward primer) e l altra complementare ad un altro tratto posto all altra estremità (reverse primer), in presenza di una DNA polimerasi termostabile e di una miscela di desossinucleotidi trifosfati(dntps), in appropriate condizioni di reazione, è possibile copiare numerosissime volte (30-40 volte) il tratto compreso tra i due primer, semplicemente facendo variare ciclicamente la temperatura di reazione. Infatti, raggiunta la temperatura di denaturazione (92-95 C), la doppia elica si apre (fase di denaturazione), rendendo disponibile lo stampo per la sintesi delle catene complementari. Se la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo prima che si rinaturi e in presenza di una DNA polimerasi con un optimum di temperatura elevato (circa 72 C), inizierà la sintesi di DNA a partire dai primer (fase di sintesi del DNA o extension), procedendo lungo i filamenti singoli. Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne ottengono due. Ripetendo il ciclo denaturazione annealing extension numerose volte (in genere da 30 a 40 volte), si ottiene una massiccia amplificazione specifica di un dato tratto di DNA, corrispondente a DNA in quantità tale da essere visualizzabile in un gel di agarosio mediante colorazione specifica. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenti: 1. è molto rapido (da 60 a 90 minuti), 2. la manualità è semplicissima, 3. è automatizzato, 4. i risultati sono visualizzabili con facilità. Il limite più grosso è rappresentato dalla necessità di conoscere le sequenze fiancheggianti il tratto di DNA che si vuole amplificare, per poter costruire i primer specifici. 11

12 N cicli N molecole della sequenza di DNA bersaglio La PCR ha rivoluzionato la genetica molecolare. Le applicazioni della PCR sono praticamente infinite. I principali ambiti di utilizzo sono la diagnosi prenatale di malattie genetiche e le indagini di medicina legale. I termociclatori Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l intero processo in modo automatico all interno di strumenti detti termociclatori (thermal cyclers) in grado di variare ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore è il seguente: 1. denaturazione del DNA: 30 sec. a 94 C 2. appaiamento(annealing)deiprimer: 30 sec. a C 35 cicli 3. sintesi (extension)di DNA: 30 sec-5 min. a 72 C Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all uso di una DNA polimerasi termostabile estratta da batteri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi utilizzata nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estratta dal batterio Thermus aquaticus. L isolamento di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall ingrato compito di aggiungere enzima fresco ad ogni ciclo di reazione! Scelta dei primer Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse). La scelta della coppia di primer è critica per una buona riuscita della PCR, ovvero per ottenere l amplificazione di un tratto di DNA in modo specifico. I primer devono essere disegnati a monte e a valle dei siti di restrizione. Si tratta di oligonucleotidi, con dimensioni comprese tra le 15 e le 30 basi che ibridano su filamenti opposti in posizioni fiancheggianti la regione di interesse del DNA. Per minimizzare la formazione di artefatti è importante che le loro sequenze non contengano basi complementari (all interno dello stesso primer o tra i due primer); inoltre la Temperatura di fusione dei due oligonucleotidi deve essere identica o almeno molto vicina. Digestione con enzimi di restrizione (ER) Come abbiamo detto, gli ER sono endonucleasi che tagliano il legame fosfodiesterico nel DNA a doppia elica a livello di sequenze specifiche (siti di restrizione). La digestione con ER va condotta a 37 C in una soluzione tampone (fornita insieme all enzima dal produttore) che garantisce le condizioni ottimali (di salinità e ph) per la digestione. Il tempo di incubazione varia a seconda se si digerisce DNA genomico o frammenti di DNA corti.nel primo caso la digestione richiede almeno 8 ore (o tutta la notte). Nel secondo caso sono sufficienti da 1-4 ore. Gli ER sono reagenti costosi e delicati. Temono le contaminazioni (usare precauzioni nel prelevare l enzima dalla soluzione stock) e l inattivazione (si devono conservare a -20 C e, al momento dell uso, mantenere sempre in un bagno di ghiaccio). 12

13 Elettroforesi su gel di agarosio E una tecnica che consente di separare in base alle loro dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica, facendole migrare su un gel in presenza di un campo elettrico. Il gel può essere immaginato come una rete tridimensionale attraverso le cui maglie migrano le molecole sotto l azione di un campo elettrico. Il campo elettrico è generato da un apparecchio, detto alimentatore. Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le molecole di DNA sono cariche negativamente per la presenza di gruppi fosfato e migrano dal polo negativo (catodo) verso il polo positivo (anodo). Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la velocità di migrazione. E, viceversa, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di migrazione. Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante elettroforesi, vengono caricati sul gel anche i cosiddetti marcatori di peso molecolare, ossia una miscela di frammenti di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei frammenti a peso molecolare noto con quella dei frammenti di DNA in esame, è possibile calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza. Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di nucleotidi (basi) che lo costituiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp). La separazione elettroforetica dura circa 45 minuti circa. Al termine, i vari frammenti di DNA, essendo incolori, possono essere visualizzati, con particolari sistemi di colorazione. Il DNA delle diverse classi di peso molecolare è visibile sotto forma di bande distinte: sono le cosiddette bande di DNA. Comunemente, per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel si aggiunge all agarosio il bromuro di etidio, una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di emettere fluorescenza se esposta a luce UV. Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultravioletta. Il bromuro di etidio va maneggiato con estrema cautela in quanto è un agente intercalante del DNA e, come tale, ha proprietà mutagene. Noi utilizzeremo il GEL RED, intercalante non tossico che non richiede precauzioni particolari. 13

14 6. Attività di laboratorio Individuazione del polimorfismo della Leptina SNP rs Un polimorfismo della leptina è stato associato ad alti livelli di leptina in soggetti obesi e in soprappeso. Il gene della Leptina sta sul cromosoma 7; è fatto di due esoni e 3 introni. Il polimorfismo che noi andremo a considerare si trova nella regione del Promotore a pb dal sito d inizio della trascrizione. E individuato con la sigla : SNP rs e consiste nella possibile sostituzione della GUANINA con l ADENINA. Il genotipo di un individuo potrà quindi essere : GG (omozigote wild type) GA (eterozigote) AA (omozigote per il polimorfismo). Nella popolazione europea le tre condizioni si presentano con la frequenza di : A/A = 0,276 A/G =0,466 G/G = 0,259 STEP 1. ESTRAZIONE DI DNA DA MUCOSA BOCCALE Raccolta del campione. Raccogliere in una provetta le cellule di sfaldamento della mucosa boccale ottenute sfregando con uno stuzzicadenti e quindi sospese nella saliva. Il volume dovrebbe essere di circa 5-7 ml. Centrifugare per 5 min. a 2500 rpm. Togliere il sopranatante. Le cellule saranno raccolte nel pellet sul fondo della provetta. Lisi delle cellule. Aggiungere al pellet : 300 µl. di Lysis Solution, 1,5 µl di Proteinasi K. Trasferire in una provetta da 1,5 ml. Mescolare la provetta invertendola per 25 volte. Incubare in un bagnetto a 55 C per 1 ora Trattamento con RNasi Aggiungere 3 µl di RNasi Mescolare il campione invertendo la provetta 25 volte Incubare a 37 C per 50 min 14

15 Precipitazione delle proteine 1. Mettere la provetta col campione in bagno di ghiaccio per 1 min 2. Aggiungere 100 µl di Protein Precipitation Solution al lisato cellulare 3. Vortexare vigorosamente ad alta velocità per 20 per ottenere una miscela uniforme. 4. Mettere la provetta in bagno di ghiaccio per Centrifugare a 13,000xg per 3.Le proteine precipitate dovrebbero formare un sottile pellet bianco. Se questo non accade,ripetere i punti 3,4 e 5 Precipitazione del DNA Trasferire il sopranatante contenente il DNA(lasciando sul fondo il pellet del precipitato proteico)in una provetta pulita da 1,5 ml contenente 300 µl di Isopropanolo 100%(2-isopropanolo). Mescolare invertendo la provetta 50 volte e incubare a Temperatura ambiente per almeno 5. Il DNA può essere visibile ( o no) come un piccolo pellet bianco. Centrifugare a 13,000 xg per 5 min. Eliminare il sopranatante e asciugare la provetta su una carta assorbente pulita. Aggiungere 300 µl di Etanolo 70% e agitare la provetta più volte per lavare il DNA Centrifugare a 13,000 xg per 1. Con molta attenzione eliminare l Etanolo. Il pellet si può staccare, quindi versare adagio e facendo attenzione a non perderlo. Agitare e asciugare su carta assorbente pulita e all aria affinché evapori tutto l Etanolo. Idratazione del DNA Aggiungere 20 µl di Hydration Solution. Incubare il campione a 65 C per 30 min. a Temperatura ambiente. Picchiettare ogni tanto la provetta per favorire la dispersione del DNA. Conservare il DNA a 4 C, oppure a 20 C se deve essere conservato a lungo. STEP 2. PCR Lavorare in ghiaccio! MIX per 25 µl di PCR : ACQUA µl BUFFER 2.5 µl dntp 2.5 µl F 1.0 µl R 1.0 µl MgCl µl TAQGold 0.12 µl µl Campione di DNA : 2 µl Ogni gruppo ha a disposizione : - una provetta con la mix - una provetta contenente il DNA 15

16 PCR MIX DNA Mettere la provetta contenente Mix+ DNA nel termociclatore e iniziare il programma: DENATURAZIONE del DNA 95 C per 9 DENATURAZIONE 94 C per 45 APPAIAMENTO (annealing) 60 C per 45 SINTESI(extension) 72 C per 45 SINTESI Finale 72 C per 5 per 35 volte Alla fine della PCR i prodotti di reazioni si conservano a 4 C per 24 h. Il tempo di durata è di circa 2 ore. STEP 3. PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO AL 2% Sciogliere l Agarosio nella beuta con la soluzione tampone TAE. Far bollire la soluzione nel microonde agitando di tanto in tanto fino a quando questa non diventa trasparente. Quando la soluzione è tiepida, ma non ancora gelificata, aggiungere l intercalante del DNA, GelRed, 3 µl. Preparare la vaschetta per elettroforesi con bordi di nastro adesivo e inserire il pettine. Versare la soluzione di Agarosio nella vaschetta per elettroforesi e lasciare polimerizzare (solidificare). Nell attesa, fare delle prove di caricamento dei pozzetti del gel,utilizzando gel già pronti, con 10 µl di colorante Togliere il pettine quando il gel sarà solidificato. Tagliare un pezzetto di gel necessario per caricare la PCR. Versare il tampone TAE nella camera di corsa STEP 4. CHECK PCR L esito della PCR viene valutato con un check prelevando 5 di PCR + 2 µl colorante e facendo una elettroforesi di 10 min. Colorante: loading dye 10x: Blu di bromofenolo 0,41% Glicerolo 50% Glicerolo 50% Su un pezzetto di plastica del microfilm posizionare le gocce di 2 µl di colorante. Prelevare con la micropipetta 5 µl di amplificato di PCR e mescolarlo con la goccia di colorante. Blu di bromofenolo 0,41% Caricare con la miscela un pozzetto nel gel immerso nella vaschetta Caricare un pozzetto con un marcatore di 100 pb. La corsa elettroforetica dura 10 min e serve per sapere Glicerolo se il DNA 50% si è amplificato. Al termine della corsa,si prende il gel e lo si osserva al transilluminatore. 16

17 STEP 5. DIGESTIONE ENZIMATICA Lavorare in bagno Di ghiaccio Bisogna preparare una mix per la reazione di digestione Mix per 5 µl : Acqua 2 µl Buffer 4 2,5 µl BSA 0,3 µl Hha1 0,2 µl Aggiungere la mix alla provetta contenente 20 µl di PCR. Il Volume totale sarà di 25µL. Trasferire la provetta in termostato a 37 C almeno per 2 ore. STEP 6. ELETTROFORESI DEL CAMPIONE DIGERITO Si procede come nel check della PCR. Si prepara la cella elettroforetica e il gel di agarosio Si posizionano le gocce di 5 µl. di colorante su un pezzo di plastica di microfilm. Si prelevano 20 µl di campione digerito con la micropipetta e si mescolano con la goccia di colorante. Si trasferisce il prelievo in un pozzetto di gel immerso nel tampone all interno della vaschetta per la corsa elettroforetica, facendo attenzione a non bucare il fondo del pozzetto e a non far uscire il campione fuori dal pozzetto. In un pozzetto si mettono 2µL. di marker di 100 pb. In un pozzetto si mette un campione non digerito con 5µL di colorante Si accende l interruttore del power fissando il voltaggio a 120 Volt Osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA che,essendo incolore,non si può vedere. Al termine della corsa, si prende il gel e lo si osserva al transilluminatore 7. Strumentazione e materiale a disposizione provette eppendorf, portaprovette micropipettatrici P20, P200, puntali per micropipette termociclatore, centrifuga power supply (alimentatore), vaschetta e pettine per elettroforesi beuta, becker, cilindro graduato, spatola bagnomaria carta, contenitori per ghiaccio guanti monouso, camice 17

18 SITI WEB: BIBLIOGRAFIA 1.A.Nieters,N.Becker,J.Linseisen. Polymorphisms in candidate obesità genes and their interaction with dietary intake of n-6 polynsatured fatty acids affect obesità risk in a sub-sample of the EPIC-Heidelberg cohort.eur J Nutr T.Wang,M.Huang,W.Chang,A.Shan Ko, E.Tsai,C.M.Lee,Y.Ko. G-2548A Polymorphism of the Leptin Gene is correlated with Extreme Obesità in Taiwanese Aborigines.Obesity D.M.Muoio,G.L.Dohm.Peripheral metabolic actions of leptin. Best Practice & Clinical Endocrinology and Metabolism J.M.Friedman.Leptin at 14y of age : an ongoing story.am J Clin Nutr C.Ragin,C.Dallal,M.Okobia,F.Modugno,J.Chen,S.Garte,E.Taioli. Inf.Agent Cancer N.Isse,Y.Ogawa,N.Tamura,H.Masuzaki,K.Mori,T.Okazaki,.Structural Organisation and Chromosomal Assignement of the Human obese Gene.J Biol Chemistry GLOSSARIO. Annealing Elettroforesi Enzima Enzimi di restrizione Fenotipo Frammenti di restrizione Gene Genoma Genotipo Isoforma. Locus (appaiamento) formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla complementarietà delle basi. tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante la migrazione in un campo elettrico. proteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce il substrato su cui agire. chiamati anche endonucleasi di restrizione o forbici molecolari : sono enzimi che tagliano il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!) in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche, dette siti di restrizione insieme delle caratteristiche visibili di un organismo, che risultano dall interazione tra genotipo e ambiente. frammenti provenienti da una molecola di DNA più lunga per digestione con enzimi di restrizione unità ereditaria funzionale corrispondente generalmente al segmento di DNA che codifica una proteina. patrimonio genetico di una cellula o di un organismo. costituzione genetica di un organismo. Un tempo si riteneva che ogni gene codificasse per un unico prodotto polipeptidico o molecola di RNA, mentre oggi si sa che la maggioranza di geni umani specifica 2 o più forme alternative di proteine. ( plurale loci) posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel liguaggio comune il termine viene spesso usato come sinonimo di gene. Marcatore genetico qualsiasi differenza fenotipica, controllata geneticamente, utilizzata nell analisi genetica Oligonucleotide corta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche decine di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di ibridazione molecolare e nella PCR 18

19 PCR (polymerase chain reaction) tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo segmenti specifici di DNA Polimorfismo esistenza di forme diverse di: alleli (polimorfismo allelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA). Polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (lunghezza variabile dei frammenti di restrizione). Polimorfismo del DNA, che si evidenzia trattando cromosomi omologhi con enzimi di restrizione. Determinato da una differenza di una base tra due DNA omologhi, differenza che causa la presenza o assenza di un sito di restrizione per uno specifico enzima di restrizione, e quindi frammenti di diversa lunghezza dopo trattamento con quell enzima. Primer corta catena polinucleotidica, a DNA o RNA, alla quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi nel corso della sintesi di DNA. Noto anche con il termine di innesco. Nella PCR si utilizza una coppia di primer. Promotore regione del DNA a cui si lega la RNA-polimerasi per avviare la trascrizione del gene(cioè la sintesi dell'rna-messaggero). Funziona come un "interruttore molecolare" che "accende" o "spegne" il gene. regioni di controllo sequenze del DNA che attivano e regolano l'espressione di un gene. La loro presenza è pertanto necessaria per la corretta e efficace espressione del gene. RNA-messaggero (mrna) copia a singolo filamento della sequenza nucleotidica di un gene, che trasporta ai ribosomi l'informazione per la sintesi (traduzione) della proteina corrispondente. Splicing del RNA processo in cui le sequenze introniche sono eliminate dai trascritti primari di RNA nel nucleo durante la trascrizione, per dar luogo alla produzione di molecole di mrnamaturo. Splicing alternativo Sequenze palindromiche assemblaggio differenziale di esoni durante la maturazione dell RNA. Si stima che più del 60% dei geni umani produca 2 o più proteine mediante questo meccanismo. Molti esoni specificano domini proteici strutturali distinti che possono essere combinati in modo diverso nelle cellule dei diversi tessuti nei quali il gene è espresso..si ottengono così isoforme tessuto-specifiche. sequenza nucleotidica che è identica al suo filamento complementare quando entrambi vengono letti nella stessa direzione chimica (es 5'-->3'). Esempio GATC. Siti di restrizione sequenza di basi ben determinata riconosciuta e tagliata dagli enzimi di restrizione in modo da lasciare corte sequenze a singola elica, dette estremità coesive poiché le loro basi sono complementari. 19

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