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1 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Informazioni per la diagnosi molecolare di sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2 (Connessina 26) al locus DFNB1sul braccio lungo del cromosoma 13. Le ipoacusie interessano circa il 4% della popolazione di età inferiore ai 45anni e comprendono un vasto spettro di manifestazioni cliniche. Oltre il 60% delle sordità è di origine genetica, la rimanente parte è dovuta a cause di natura ambientale (infezioni durante la gravidanza, traumi, farmaci, etc.) Delle sordità di origine genetica il 30% fanno parte di una condizione sindromica (la perdita di udito si associa ad altri sintomi e/o manifestazioni cliniche) ad eredità mendeliana o mitocondriale (sindrome di Alport, Norie, Usher, Waardenburg, etc.) Il 70% delle sordità di origine genetica sono forme non sindromiche (la perdita di udito è l unico sintomo presente) ad eredità mendeliana o mitocondriale. Sono caratterizzate da una elevata eterogeneità genetica, cioè dalla presenza di geni diversi in grado, una volta mutati di dare origine a quadri clinici del tutto sovrapponibili, e possono essere suddivise, in base alle modalità di trasmissione, come di seguito: Recessive (circa 80% dei casi) Dominanti (circa il 20% dei casi) X-linked (circa l 1% dei casi) Mitocondriali (circa l 1% dei casi) Allo stato attuale sono stati identificati 30 loci per le forme recessive, 39 loci per le forme dominanti e 6 loci per le forme trasmesse come carattere legato al cromosoma X. Solo alcuni dei corrispondenti geni sono stati identificati (20 geni per l esattezza) e diversi tra questi appartengono ad alcune famiglie di geni codificanti per proteine coinvolte nei meccanismi della contrazione delle cellule ciliate. Le sordità recessive, il locus DFNB1 e la mutazione 35delG La maggior parte delle famiglie di origine caucasoide in cui la sordità si trasmette come carattere autosomico recessivo sono associate al locus DFNB1 (circa l 80%, ma in Italia e Spagna si arriva anche al 90% dei casi) che si trova sul braccio lungo del cromosoma 13 (13q11). Il gene coinvolto nel determinare la sordità codifica per la proteina connessina 26 (CX26) detta anche GJB2. Le connessine sono una famiglia di proteine presenti sulla membrana plasmatica che formano dei canali necessari per gli scambi e le comunicazioni tra le cellule. La ipoacusia presente in queste famiglie è di tipo neurosensoriale bilaterale profondo ed è presente alla nascita (congenita). 1

2 Sono state descritte diverse mutazioni nel gene GJB2, ma nelle popolazioni caucasoidi, nella maggior parte dei casi associati al locus DFNB1, si osserva una sola mutazione, chiamata 35delG (perdita di una guanina in posizione 35). La mutazione 35delG si ritrova nella maggior parte dei soggetti affetti da sordità ereditaria in Italia ed in tutto il bacino del Mediterraneo ed è in grado di spiegare il 50% di tutte le sordità. Se dopo una accurata valutazione anamnestica si escludono i soggetti con deficit uditivo da cause iatrogene ed i casi in cui non vi è una chiara trasmissione ereditaria di tipo recessivo la mutazione 35delG caratterizza più del 70% di tutti i casi di sordità. Non va dimenticato che il 40% dei casi sporadici è dovuto alla presenza di questa mutazione (Estivill et al.,1998). Una così elevata frequenza di soggetti affetti con mutazione 35delG in omozigosi si spiega con un elevato numero di portatori sani di questa mutazione nella popolazione generale. La frequenza della mutazione 35delG in Italia è elevata (1/35 individui) come anche in molte altre nazioni del bacino del mediterraneo (frequenze oscillanti tra 1/25 e 1/50) (Gasparini et al.,2000). La diagnosi molecolare delle sordità genetiche La diagnosi molecolare delle sordità genetiche, nel nostro Laboratorio, prevede (come da linee guida per l inquadramento diagnostico delle ipoacusie genetiche- gruppo di lavoro SIGU) una consulenza genetica che precede il test molecolare (raccolta anamnesi familiare, illustrazione delle finalità e dei limiti dei test dato l elevato numero dei geni associati a sordità, etc.) ed uno studio familiare esteso; una volta escluse le cause iatrogene di sordità è opportuno sottoporre tutti i soggetti con problemi di ipoacusia all esame molecolare nei geni noti per la identificazione della forma di sordità. Si esegue l analisi del gene GJB2 mediante tecnica di sequenziamento diretto. Se viene evidenziata la mutazione 35delG su un sola copia del gene GJB2 viene effettuato un esame sull intero gene per identificare una eventuale II mutazione. Se non c è omozigosi o eterozigosi composta GJB2 viene studiata la regione promotrice di GJB2 ed il gene GJB6 (connessina 30) allo scopo di escludere forme di doppia eterozigosi (digenia). Se l analisi molecolare ai geni GJB2 e GJB6 risulta negativa è consigliabile l esecuzione del test specifico per la mutazione mitocondriale A1555G (frequenza nella popolazione 1/1000). Una volta identificato sugli affetti il gene coinvolto e la relativa mutazione si rende disponibile un test molecolare per ogni componente del nucleo familiare (ed anche un test diagnostico prenatale); questo può portare a definire con precisione il rischio riproduttivo in ciascun soggetto della famiglia. Test di screening sulla coppia e diagnosi prenatale In alcuni casi, ove richiesto espressamente, può essere effettuata la identificazione della mutazione 35delG come test di sreening sulla coppia per identificare lo stato di portatore (come previsto dalle stesse linee guida per l inquadramento diagnostico delle ipoacusie genetiche -gruppo di lavoro SIGU); in diagnosi prenatale il test sul feto è effettuato solo se presente lo stato di portatore su uno o entrambi i genitori; in questi casi, se il feto risulta negativo alla mutazione 35delG, può essere esclusa sul feto la sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita associata al locus DFNB1(GJB2) oppure non essere esclusa se il feto è portatore della mutazione 35delG di un genitore. 2

3 A tal proposito è importante sottolineare che: se entrambi i genitori sono negativi al test per la mutazione 35delG questo non esclude che possano essere presenti altre mutazioni rare al medesimo locus (DFNB1 o gene GJB2) non evidenziabili con questo test o mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica. se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG e l altro negativo al test per la mutazione 35delG viene effettuato un test ulteriore per la ricerca di 66 mutazioni sul genitore non portatore della mutazione 35delG. il test sul feto è effettuato solo se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG (o altra mutazione); questo test può escludere (feto negativo alla mutazione 35delG) la forma di sordita neurosensolriale bilaterale profonda associata al locus DFNB1 (GJB2) nel 50% dei casi o non escluderla nell altro 50% dei casi (se il feto è portatore della mutazione 35delG) poiché potrebbe portare una II mutazione rara al medesimo locus (GJB2) presente in uno dei genitori e non evidenziabile anche con il test per la ricerca di ulteriori 66 mutazioni (nei casi di non esclusione non è possibile avere una definizione accurata del rischio di malattia nel feto). In ogni caso il test sul feto effettuato non è in grado di identificare mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica. se entrambi i genitori sono positivi al test per la mutazione 35delG o altra mutazione al medesimo locus (entrambi portatori) il rischio di avere un figlio affetto da sordità neurosensoriale bilaterale profondo congenito è pari al 25% (cioè ad una probabilità su 4). In questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto. Materiali e metodi utilizzati L analisi per la ricerca della mutazione 35delG viene condotta inizialmente effettuando una reazione di amplificazione molecolare del DNA, conosciuta come PCR (Polymerase Chain Reaction), di una parte della regione codificante del gene GJB2 (CX26 o Connessina 26; locus DFNB1 sul braccio lungo del cromosoma 13) e successiva digestione del prodotto di PCR con l enzima di restrizione BseLI (BsiYI) (Storm et al.,1999). L eventuale analisi per la ricerca di ulteriori 66 mutazioni nel gene viene condotta effettuando una reazione di amplificazione molecolare del DNA di una parte della regione codificante e non codificante del gene GJB2 (Zelante et al.,1997 mod). Il prodotto di PCR così ottenuto, dopo purificazione, viene sottoposto ad analisi automatizzata mediante l impiego di un sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente (Cycle Sequencing su ABI 3730). Referenti per l analisi genetica di sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita Conformemente alle Linee Guida Nazionali sui Test Genetici, il prelievo di sangue e l analisi molecolare sui genitori, il prelievo di liquido amniotico per l eventuale test molecolare sul feto per la sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita associata al locus DFNB1, sono precedute da una consulenza genetica, effettuata da Medici Specialisti in Genetica Medica, che ha la finalità di trasmettere a chi chiede di sottoporsi al test le informazioni necessarie a comprenderne il significato e le implicazioni correlate al risultato e, quindi, di ottenere il consenso informato degli interessati. 3

4 L analisi molecolare è effettuata presso l Istituto di Diagnostica Clinica PRODA Sezione Citogenetica e Genetica Molecolare. 4

5 PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Sezione di Citogenetica e Genetica molecolare Responsabile: Dott. Guglielmo Sabbadini Specialista in Genetica Medica Consenso informato all indagine genetica per sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2 (connessina 26) al locus DFNB1sul braccio lungo del cromosoma 13 Ho preso visione delle informazioni allegate. Avendo compreso il significato e le implicazioni di queste procedure, chiedo di sottopormi alle seguente indagine genetica: test di screening di coppia per la ricerca della mutazione 35delG nel gene GJB2 (Connessina 26) al locus DFNB1 sul braccio lungo del cromosoma 13. Sono consapevole che il test sul feto sarà effettuato solo se presente lo stato di portatore su uno o entrambi i genitori; in questi casi, se il feto risulta negativo alla mutazione 35delG, può essere esclusa sul feto la sordita di tipo neurosensoriale bilaterale profondo congenita associata al locus DFNB1(GJB2) oppure non essere esclusa se il feto porta la mutazione 35delG di un genitore. Sono inoltre consapevole che: se entrambi i genitori sono negativi al test per la mutazione 35delG questo non esclude che possano essere presenti altre mutazioni rare al medesimo locus (DFNB1 o gene GJB2) non evidenziabili con questo test o mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica. se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG e l altro negativo al test per la mutazione 35delG viene effettuato un test ulteriore per la ricerca di 66 mutazioni sul genitore non portatore della mutazione 35delG il test sul feto è effettuato solo se un genitore è positivo al test per la mutazione 35delG (o altra mutazione); questo test può escludere (feto negativo alla mutazione 35delG) la forma di sordita neurosensolriale bilaterale profonda associata al locus DFNB1 (GJB2) nel 50% dei casi o non escluderla nell altro 50% dei casi (se il feto è portatore della mutazione 35delG) poiché potrebbe portare una II mutazione rara al medesimo locus (GJB2) presente in uno dei genitori e non evidenziabile anche con il test per la ricerca di ulteriori 66 mutazioni (nei casi di non esclusione non è possibile avere una definizione accurata del rischio di malattia nel feto). In ogni caso il test sul feto effettuato non è in grado di identificare mutazioni in loci diversi responsabili di forme diverse di sordità non sindromica. 5

6 se entrambi i genitori sono positivi al test per la mutazione 35delG o ad un'altra mutazione al medesimo locus (entrambi portatori) il rischio di avere un figlio affetto da sordità neurosensoriale bilaterale profondo congenito è pari al 25% (cioè ad una probabilità su 4). In questo caso la coppia può fare ricorso alla diagnosi prenatale per la diagnosi di malattia nel feto. l analisi per la ricerca della mutazione 35delG viene condotta inizialmente effettuando una reazione di amplificazione molecolare del DNA (PCR) di una parte del gene GJB2 e successiva digestione del prodotto di PCR con l enzima di restrizione BseLI (BsiYI; Storm et al.,1999). La eventuale ricerca delle 66 mutazioni conosciute nel gene GJB2, sul genitore non portatore della mutazione 35delG, viene condotta effettuando una reazione di amplificazione molecolare di una parte della regione codificante e non codificante del gene GJB2 e successiva analisi per sequenziamento automatico del prodotto di PCR purificato (Cycle Sequencing su ABI 3730; Zelante et al.,1997). La mia richiesta di sottopormi ai test è completamente volontaria. Una copia di questo consenso informato resterà in mio possesso ed una copia resterà al Laboratorio. Sono consapevole che raramente queste analisi possono fornire un risultato errato ma che, comunque, la probabilità di un errore diagnostico è inferiore all 1%. Dati anagrafici del paziente Cognome: Nome: Data e luogo di nascita: Indirizzo: Recapito telefonico: Roma, Firma del paziente Firma del Medico che ha raccolto il consenso 6

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