Biotecnologie applicate all esplorazione, produzione e conversione di oil & gas

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1 3.4 Biotecnologie applicate all esplorazione, produzione e conversione di oil & gas Le applicazioni biotecnologiche vengono qui intese come sfruttamento di processi biocatalizzati, per migliorare o definire nuove tecnologie nel mondo dell esplorazione e produzione del petrolio. Il petrolio, come miscela complessa di idrocarburi, è facile substrato per l attività degradativa di microrganismi selezionati che, per poterne utilizzare le componenti necessarie alla crescita cellulare, devono avere caratteristiche di resistenza ai solventi organici; questo li contraddistingue come oleofili e solvente-resistenti. Tradizionalmente, importanti applicazioni associate alle attività petrolifere riguardano l utilizzazione di processi microbiologici per il trattamento di suoli e acque contaminati. Vengono altresì descritti reazioni e processi strettamente attinenti alle attività di esplorazione e produzione, quale la gestione di fenomeni microbiologici dei giacimenti a temperature moderate. L impatto economico dei fenomeni di sintesi biologica di 2 S nei giacimenti (con conseguente souring o acidificazione da solfuro d idrogeno) rende importante per l industria la prevenzione di questo fenomeno, non ancora capito né tantomeno controllato. La vecchia idea di utilizzare efficacemente batteri indigeni dei giacimenti, o aggiungerne dall esterno per stimolare un aumento produttivo (MER, Microbial Enhanced il Recovery), è ancora controversa ma non è stata mai completamente abbandonata. Sempre in ambito industriale è vivo l interesse per le vaste riserve di idrati di metano, abbondantemente presenti sui fondali profondi oceanici, che si ipotizza vengano prodotti da batteri metanogeni che vivono al di sotto dei depositi. I primi due paragrafi riguardano una breve descrizione delle comunità microbiche attive nelle reazioni di biotrasformazione degli idrocarburi naturali e una descrizione delle reazioni principali o di più recente scoperta. Nel paragrafo successivo vengono descritte alcune delle applicazioni alle attività di E&P attualmente allo stadio di sviluppo, innovazione o prime prove in campo. Nella parte finale vengono quindi descritte attività e prospettive sulla funzionalizzazione biologica del metano Microbiologia associata agli idrocarburi Gran parte degli spazi che sul nostro pianeta sono occupati da giacimenti di petrolio nelle sue varie composizioni (greggio pesante, leggero, liquido o gassoso) è abitata anche da forme di vita semplici quali batteri, archeobatteri e funghi. Si stima infatti che la gran parte dei microrganismi del pianeta risieda nella cosiddetta biosfera profonda (deep biosphere), dove i microrganismi stessi contribuiscono in modo sostanziale ai cicli di trasformazione degli elementi chimici quali carbonio, zolfo, metalli e minerali. L importanza dell interazione della biosfera profonda con la porzione della crosta terrestre che ospita accumuli di idrocarburi è dimostrata dal fatto che la maggior parte del greggio scoperto in giacimenti a temperature inferiori a 70 è interessata da una storia più o meno severa di biodegradazione (Larter e Aplin, 2003) e di trasformazione della sua composizione. Quando il petrolio (o alcune sue componenti) raggiunge la superficie terrestre o i fondali marini mediante percorsi di rilascio naturale (seepage) o tramite attività legate alla produzione, in condizioni compatibili con la vita batterica vengono a crearsi i presupposti principali per la formazione di ecosistemi aerobici o microaerofili basati sulle reazioni ossidative dei componenti idrocarburici. Microbiologia del sottosuolo La ricerca sulla biologia del sottosuolo costituisce una disciplina relativamente giovane e in veloce evoluzione. Dal punto di vista della ricerca di base gli sforzi si concentrano soprattutto sull ampliamento delle conoscenze sulla biodiversità, sulle capacità metaboliche dei microrganismi sotterranei e sulla comprensione dei meccanismi VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 271

2 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM che hanno regolato le origini della vita sul nostro pianeta. Gli ambienti ottimali per le indagini sulla cosiddetta biosfera profonda sono costituiti dai pozzi di trivellazione. Attualmente i pozzi che si addentrano in ambienti superprofondi sono molto pochi e nessuno di questi è stato realizzato con finalità esclusivamente scientifiche. Le poche perforazioni finalizzate al puro scopo di esplorare la vita microbica non superano i m, mentre le più profonde trivellazioni terrestri raggiungono i m. La distanza dalla superficie del pianeta non è tuttavia il più importante fattore limitante per la sopravvivenza, costituito, piuttosto, dalla temperatura. Fino a oggi il limite superiore di temperatura misurato per la permanenza in vita di un organismo ipertermofilo è di 113, limite che può essere raggiunto sia a livello delle superfici oceaniche in corrispondenza di fonti idrotermali, sia a metri di profondità in formazioni rocciose sedimentarie. onsiderando che a livello globale esistono pochissimi pozzi di trivellazione che raggiungono tale profondità, a causa degli elevati costi e delle difficoltà tecniche, se ne deduce che l esplorazione della biosfera superprofonda è semplicemente agli albori e che molti aspetti permangono pertanto oscuri. In particolare, un elemento fondamentale deve essere ancora chiarito ed è quello che riguarda lo stato metabolico della comunità microbica sotterranea: i microbi intraterrestri sono metabolicamente attivi a tutti i livelli in modo costante oppure possono resistere per lunghi periodi in stato di quiescenza? E per quanto tempo? È noto comunque che i batteri sono capaci di utilizzare qualsiasi forma di energia che sia termodinamicamente disponibile nell ambiente in cui si trovano. Questa energia può essere rappresentata da materiale organico trasportato dalla superficie terrestre tramite lenti processi di diffusione delle acque, da carbonio organico rimasto intrappolato nei sedimenti fin dai tempi della loro formazione, dagli idrocarburi presenti nei giacimenti e da flussi di geogas come 2, 2 e 4 che diffondono dagli strati profondi del mantello. Potenzialmente queste fonti energetiche costituiscono una riserva inesauribile per la biomassa del sottosuolo e potrebbero formare la fonte di sostentamento di veri e propri ecosistemi autonomi, come mostra la fig. 1 che illustra il ciclo del carbonio nella biosfera profonda. Questo ciclo non richiede energia solare come fonte energetica. Idrogeno e 2 provenienti dagli strati più interni della crosta terrestre sono metabolizzati dai microrganismi a condizioni di temperatura compatibili con la vita batterica e in presenza di acqua. Inoltre, su campioni provenienti da perforazioni eseguite su antiche formazioni saline dell Europa settentrionale, sono stati isolati batteri alofili che apparentemente sono rimasti in stato quiescente per più di 250 milioni di anni. Queste osservazioni implicano il fatto che esistono alcuni microrganismi nel sottosuolo che, nelle opportune condizioni, possono essere considerati immortali. Il fattore che attualmente limita l espandersi delle conoscenze sulla geobiosfera è legato alla reperibilità e alla qualità dei campioni da analizzare, poiché i processi di perforazione profonda sono molto costosi e tecnicamente complessi. I campioni disponibili molto spesso provengono da trivellazioni petrolifere tradizionali. Su fanghi e acque di formazione degli strati oleosi è stato possibile identificare e classificare diverse specie microbiche, molte delle quali apparentemente non legate al metabolismo degli idrocarburi. Le tecniche utilizzate per la ricerca sono di tipo sia tradizionale coltura-dipendente, sia molecolare colturaindipendente. I metodi coltura-dipendenti prevedono l isolamento su terreno selettivo specifico e la successiva classificazione dei ceppi batterici presenti in un certo ambiente. Sulle colture pure è poi possibile effettuare una serie di sperimentazioni mirate alla caratterizzazione biochimica e genetica dei ceppi in esame. La concentrazione e l insieme caratterizzante di condizioni ambientali (principalmente temperatura), donatori di elettroni, concentrazione salina e nutrienti hanno un forte peso nel determinare la composizione del consorzio microbico nell ecosistema della roccia serbatoio (reservoir), che in tipiche condizioni di assenza di ossigeno fig. 1. Il ciclo del carbonio nella biosfera profonda (Pedersen, 2000). acetato batteri ferro-riduttori batteri solfato-riduttori 4 4 polimeri organici batteri acetogeni acetato metanogeni acetoclastici metanogeni autotrofi degradazione anaerobica 2 2 geogas 272 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

3 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS può essere composto da batteri metanogeni associati a batteri fermentativi o acetogeni o, spesso in alternativa, da batteri solfato-riduttori, ferro-riduttori e fermentativi. Poco si sa sulle fonti di azoto e fosforo utilizzate, anche se l azoto potrebbe essere fissato direttamente, o utilizzato tramite la biodegradazione di componenti azotoorganici del greggio. I microrganismi isolati più frequentemente negli ambienti correlati ai giacimenti petroliferi appartengono ai generi Desulfovibrio, Thermotoga (batterio fermentativo resistente ad alte temperature e concentrazioni saline), Thermoanaerobacter, Geobacillus, Petrotoga, Thermosipho e Thermococcus. Si tratta di microbi anaerobici meso- o termofili caratterizzati da temperature di crescita ottimali comprese tra 40 e 90 º. Alcuni tipi di Archaea solfato-riduttori e fermentativi sono stati isolati ripetutamente, come per esempio Archaeoglobus fulgidus, archeobatterio ipertermofilo e solfato-riduttore, isolato da impianti petroliferi dove può causare fenomeni di produzione di solfuro di idrogeno ad alta temperatura (80-85 ) e corrosione metallica e che può formare biofilm, e Methanococcus sp., archeobatterio anaerobio autotrofo, che trasforma 2 e 2 in metano e per il quale il valore ottimale di temperatura per la crescita è 85, anche se alcune specie resistono bene a pressioni di circa 200 bar (fig. 2). I metodi coltura-dipendenti sono tuttavia fortemente limitati nel loro campo d azione perché solo una piccola frazione dei ceppi batterici (0,1-1%) può essere coltivata in laboratorio. Per l identificazione di quei microrganismi che non possono essere coltivati in vitro esistono tecniche di biologia molecolare che, attraverso l utilizzazione di sonde di DNA (primer) specifiche per certe sequenze geniche, permettono di stabilire l appartenenza filogenetica degli organismi presenti nel campione di suolo o d acqua analizzato. Mediante questo tipo di approccio è stato possibile ampliare sensibilmente la conoscenza sui microrganismi coinvolti nella microbiologia del giacimento, anche se occorrono ancora ulteriori indagini per avere un quadro chiaro sulla loro distribuzione, funzione e interazione ecologica (Magot et al., 2000). Gli stessi approcci sopra descritti sono stati adottati per la caratterizzazione metabolica e filogenetica dei batteri che popolano altri ambienti estremi tipici delle zone profonde della Terra, come i vulcanetti di fango (mud volcanoes) e i sedimenti profondi e freddi delle fosse oceaniche. Di particolare interesse scientifico si sono rivelati gli studi sulle proprietà di alcuni microrganismi capaci di regolare il proprio metabolismo in funzione delle altissime pressioni di quegli ambienti (fino a 700 bar), attraverso meccanismi biochimici specifici e inducibili dalle condizioni di iperbarofilia. Particolarmente rilevante per l industria petrolifera negli sviluppi della ricerca in questo campo potrebbe essere l individuazione di specie o geni associati alla presenza di idrocarburi in ambienti anossici, potenzialmente utilizzabili come marcatori della presenza di idrocarburi in ambienti poveri di ossigeno. Microbiologia aerobica degli idrocarburi Microrganismi in grado di utilizzare metano, alcani e componenti aromatiche del petrolio come fonte di carbonio in presenza di ossigeno sono estremamente diffusi in natura, in ambienti sia acquatici sia terrestri. In particolare, studi molecolari effettuati negli anni Novanta hanno fatto luce sulle popolazioni microbiche specializzate che contribuiscono alla risposta naturale degli ecosistemi marini e terrestri al rilascio accidentale di grandi quantità di idrocarburi nell ambiente. L utilizzazione di consorzi o ceppi batterici aerobi selezionati per la rimozione di idrocarburi dall ambiente è spesso rivendicata anche commercialmente. L uso di ceppi non autoctoni per applicazioni di tipo ambientale deve essere tuttavia valutato accuratamente in alternativa a strategie di stimolazione, mediante aggiunta di nutrienti, della flora microbica locale, generalmente meglio adattata all ambiente in cui si trova. Per il tipo di reazioni e i generi batterici associati alla degradazione aerobica e anaerobica di varie classi di composti del petrolio, v. oltre. A B fig. 2. Immagini al microscopio di cellule batteriche isolate da acque provenienti da giacimenti petroliferi: A, sezione di cellule di Thermotoga; B, cellule di Archaeoglobus fulgidus;, Methanococcus sp. VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 273

4 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM Negli anni Novanta hanno suscitato particolare interesse alcuni microrganismi aerobi specializzati capaci di rimuovere selettivamente composti organosolforati da prodotti petroliferi, quali i distillati più pesanti. I generi batterici più attivi in questo tipo di reazione sono in gran parte limitati a microrganismi quali Rhodococcus, Gordonia e Mycobacterium, un gruppo di batteri ubiquitari sulla superficie terrestre, filogeneticamente vicini tra loro ed estremamente versatili dal punto di vista metabolico. Per le potenziali applicazioni nel campo dell upgrading petrolifero, v. par Reazioni Biotrasformazione aerobica delle principali componenti del petrolio Biodegradazione degli alcani I sistemi biologici di ossidazione aerobica degli alcani differiscono in base al numero di atomi di carbonio che compongono la catena idrocarburica: 1, 2-4 (gassosi), 6 - n (liquidi). Non è ben nota la collocazione di 5 (pentano), in quanto in letteratura spesso questo composto non viene considerato come molecola modello per la sperimentazione. Mentre il metano viene abbondantemente prodotto in natura per via biogenica, non è nota alcuna sintesi biologica di etano, propano o butano. Per questa ragione, la presenza di questi idrocarburi nell ambiente è associabile a rilasci naturali da depositi soggiacenti (microseep) o, in alternativa, da contaminazione dovuta all attività di uso o produzione. Le molecole che più spesso sono presenti nei microseep sono 1-6. L etano viene considerato il migliore indicatore di olio, seguito da propano e butano. I microrganismi in grado di metabolizzare il metano vengono denominati metanotrofi. I metanotrofi maggiormente caratterizzati appartengono a due gruppi distinti che differiscono per caratteristiche sia filogenetiche sia fisiologiche. Le specie note del tipo I appartengono ai generi Methylococcus, Methylomicrobium, Methylobacter e Methylomonas; quelle del tipo II sono Methylosinus e Methylocystis. Numerosi studi hanno dimostrato che i batteri metano-ossidanti sono estremamente diffusi nei più disparati ambienti. La molecola di metano viene attivata e resa disponibile per il metabolismo cellulare attraverso una reazione di ossidazione catalizzata dall enzima metanomonossigenasi. I metanotrofi di entrambi i tipi sono in grado di sintetizzare una metano-monossigenasi detta insolubile (pmm, particulate Methane-Monxygenase) mentre i metanotrofi di tipo II e Methylomonas (tipo I) sono in grado di sintetizzare una seconda metanomonossigenasi detta solubile (smm, soluble Methane- Monxygenase). Le metano-monossigenasi catalizzano la trasformazione di metano in metanolo; il metanolo viene a sua volta trasformato in formaldeide, come è schematicamente rappresentato in fig. 3. La formaldeide entra nel circuito del metabolismo cellulare seguendo diverse vie, caratteristiche delle diverse specie. Le metano-monossigenasi insolubili sono costituite da tre subunità, codificate dai geni pmoa, pmob e pmo. Le tre subunità probabilmente sono associate a formare un dimero (AB) 2 ; pmoa contiene il sito catalitico. La sequenza amminoacidica di pmoa, intera o parziale, è nota per molte specie: essa ha alte omologie con le ammonio-monossigenasi che catalizzano la trasformazione di ammonio in idrossilammina. Le metano-monossigenasi solubili sono costituite da tre componenti principali: una idrossilasi (mmo), una reduttasi (mmor) e una proteina regolatrice detta proteina B (component B, mmob). L idrossilasi, responsabile diretta della ossidazione del metano a metanolo, è costituita a sua volta da più subunità e si trova nella forma smm 2 yt red X 2 yt ox X yt red yt ox pmm fig. 3. ammino metabolico di ossidazione del metano da parte di microrganismi aerobi. NAD, yt ox e X (un generico composto) rappresentano i cofattori enzimatici delle reazioni nella forma ossidata, indicati come NAD, yt red e X 2 nella forma ridotta. 274 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

5 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS dimerica (abl) 2. La subunità a contiene il sito catalitico ed è codificata da un gene denominato mmox: un centinaio di sequenze amminoacidiche, complete o parziali, è stato depositato nelle banche dati pubbliche. Mentre in alcuni casi sono note le sequenze di tutti i geni che codificano le diverse subunità delle metanomonossigenasi e delle altre proteine ancillari, per quanto riguarda le pmm e le smm nella maggior parte delle specie è conosciuta solamente la sequenza della subunità catalitica o di parte di essa. Inoltre le metanomonossigenasi sono enzimi estremamente conservati e tra le sequenze delle diverse specie il livello di omologia è alto, mentre smm e pmm non sono omologhe tra loro. Microrganismi in grado di crescere utilizzando alcani gassosi diversi dal metano, cioè 2-4, sono presenti nell ambiente e sono ritenuti indicatori significativi della presenza di giacimenti di petrolio. Alcuni dei ceppi in grado di crescere su propano e/o butano sono stati isolati: dal punto di vista biochimico e genetico questi sono gli alcano-ossidanti meno conosciuti. Analogamente al caso del metano, gli alcani vengono trasformati in alcoli primari, secondari o di entrambi i tipi dipendentemente dalla specie presa in considerazione. Tra i sistemi studiati è stato ampiamente caratterizzato quello della butano-monossigenasi di Pseudomonas (Thauera) butanovora. In questa specie batterica la monossigenasi che catalizza l ossidazione del butano ha notevoli omologie con le metano-monossigenasi solubili. Recentemente sono stati identificati altri sistemi, non ancora ben caratterizzati, attraverso i quali propano e butano vengono utilizzati come fonti di carbonio. Un ceppo di Gordonia (Gordonia sp., ceppo TY-5) in grado di utilizzare butano contiene enzimi con caratteristiche simili alla famiglia delle diferro-monossigenasi, come nel caso della butano-monossigenasi di P. butanovora. Le omologie con la butano-monossigenasi di P. butanovora, tuttavia, non sono elevate, sebbene evidenti, e sono concentrate nelle porzioni della catena polipeptidica con funzioni specifiche, per esempio quelle che sono in grado di legare ioni Fe 2 /Fe 3, fondamentali per l attività. Le diferro-monossigenasi sono state suddivise in gruppi in funzione sia dei substrati sui quali sono attive, sia delle omologie di sequenza dell enzima. I microrganismi in grado di utilizzare alcani non gassosi hanno frequentemente in comune il sistema enzimatico alk: una alcano-idrossilasi legata alla membrana, alkb, trasforma la molecola di alcano nel suo alcol primario; nella reazione intervengono una rubredossina e una rubredossina-reduttasi. Il sistema è stato studiato a fondo in Pseudomonas putida Gpo1, di cui è presentato uno schema in fig. 4. I geni alk sono presenti in numerose specie batteriche e di alcune sono note le sequenze degli interi operoni che codificano le proteine coinvolte. Tra queste la più studiata è alkb. Alcune specie contengono nel proprio genoma più di una copia del gene codificante, alkb: fino a cinque in alcuni Rhodococcus, due alcano-idrossilasi (alkb) trasporto interno? alkl membrana plasmatica rubredossina (alkg) alkf alkb alkg alkt SoA alkj cammino metabolico alkk alk alkn chemiotassi? citoplasma FAD NAD ciclo b-ossidativo s S alksp1 alksp2 alkst rubredossinareduttasi (alkt) alcani o DPK alkbp alks regolazione alkbfgjkl (alkn) fig. 4. Il sistema enzimatico alk (van Beilen et al., 2001): cammino metabolico di degradazione degli alcani e ruolo dei geni alk. L operone alk codifica l alcano-monossigenasi (alkb), due rubredossine (alkf e alkg), un alcol- e un aldeide-deidrogenasi (alkj e alk), un alchil-oa-sintetasi (alkk) e una proteina esterna di membrana con funzione sconosciuta. DPK (DiycloPropylKetone), induttore genico che mima gli effetti degli alcani. VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 275

6 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM in Pseudomonas aeruginosa. All interno dello stesso ceppo i geni alkb, pur essendo omologhi, possono differire tanto quanto quelli appartenenti a specie diverse: non è chiaro se essi siano specifici per alcani a diversa lunghezza oppure se vengano attivati in condizioni differenti. Tutte le proteine alkb sono, comunque, omologhe tra loro. Biodegradazione dei composti aromatici Fino a oggi sono noti almeno cinque sistemi biocatalitici diversi di funzionalizzazione del benzene in microrganismi aerobi. L introduzione di uno o due gruppi idrossilici da parte di ossigenasi specifiche è tipicamente il primo passaggio nella catena di reazioni che portano dal benzene alla sua mineralizzazione parziale o totale ad acqua e 2. Analogamente, il primo attacco biocatalizzato che porta alla trasformazione di anelli policiclici aromatici a crescente complessità è l introduzione di uno o due gruppi, a cui segue l apertura dell anello idrossilato. I microrganismi in cui queste reazioni sono maggiormente studiati appartengono ai generi Pseudomonas, Burkholderia e, negli anni più recenti, Rhodococcus. Vi sono ampie evidenze sperimentali che i geni che codificano le proteine coinvolte nella biodegradazione di composti aromatici siano presenti nell ambiente in modo trasversale, in batteri molto diversi tra loro. Per esempio, sono stati descritti omologhi sia dei geni alk sia dei geni per la degradazione dei composti aromatici in microrganismi marini che utilizzano queste molecole come fonte di carbonio, nei consorzi batterici che evolvono in seguito a rilascio accidentale di petrolio nel mare (arayama et al., 2004). Biodesolforazione ossidativa Alcuni ceppi batterici sono caratterizzati dalla capacità di utilizzare eteroatomi presenti in componenti organiche del petrolio per supplire a concentrazioni limitanti di questi elementi nell ambiente. eppi di Rhodococcus, Nocardia, Gordonia, Mycobacterium, Pseudomonas, Sphingomonas e altri, in assenza di zolfo nel mezzo di coltura possono sfruttare sistemi enzimatici specializzati nell ossidazione di composti organosolforati (quali benzo- e dibenzotiofeni) e nella scissione del legame tra carbonio e zolfo, con conversione di questo in solfito o solfato, facilmente assimilabili dalla cellula batterica. Analogamente sono noti sistemi di utilizzazione dello zolfo presente nei mercaptani. I cammini metabolici di assimilazione dello zolfo sono diversi; negli anni Novanta particolare interesse hanno suscitato i cammini metabolici che preservano lo scheletro carbonioso del composto organosolforato (fig. 5), per processi biocatalitici di rimozione di distillati del petrolio ricchi in zolfo organico (Monticello, 2000). Deazotazione Diverse specie microbiche sono in grado di ossidare composti organici contenenti azoto e utilizzare i gruppi azotati per la propria crescita. I composti modello noti che possono essere utilizzati in questo tipo di reazioni sono pirrolo, pirimidine, indolo, quinolina e carbazolo, selettivamente deazotati da ceppi batterici appartenenti ai generi Pseudomonas, omamonas, Rhodococcus e Nocardia. Biotrasformazione anaerobica delle principali componenti del petrolio È noto che esistono consorzi batterici in grado di ossidare metano in assenza di ossigeno, sebbene non siano ancora disponibili informazioni dettagliate sulle specie batteriche coinvolte e sui possibili meccanismi enzimatici responsabili. Informazioni maggiori si hanno sugli alcani a catena più lunga (non gassosi) e sugli aromatici. A tutt oggi la degradazione anaerobica degli idrocarburi è un fenomeno studiato in relazione alla biodegradazione di idrocarburi nei giacimenti o per applicazioni di carattere ambientale, mentre alcune società commerciali attive nell esplorazione hanno rivolto la propria attenzione ai fenomeni legati all ossidazione aerobica. La letteratura scientifica ha cominciato ad annoverare un numero sempre crescente di articoli riguardanti l ossidazione anaerobica degli idrocarburi solo a partire dagli inizi degli anni Novanta. Grazie al continuo sviluppo tecnologico dei mezzi d indagine è stato possibile isolare e caratterizzare nuovi microrganismi capaci di ossidare fig. 5. ammino metabolico di ossidazione 4-S di composti organosolforati da parte del sistema enzimatico dszabd. DBT, dibenzotiofene; DBT, dibenzotiofensolfone; DBT 2, dibenzotiofensolfossido; BPS, acido sulfinico; 2-BP, 2-idrossibifenile; M, monossigenasi. DBT S DBT M dsz DBT S DBT M dsz DBT 2 S DBT 2 M dsza 2-BP BPS S dszb 276 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

7 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS Lo schema di reazione proposto e generalmente accettato è il seguente: 4 S S 2 5 mm fig. 6. Immagine al microscopio di un consorzio batterico metanotrofo anaerobico isolato da sedimenti ricchi in idrati di metano, marcato mediante ibridazione in situ con sonde specifiche per archeobatteri (cellule in rosso) e solfato-riduttori (cellule in verde; Boetius et al., 2000). svariate molecole presenti nel petrolio, utilizzando nitrati, solfati, metalli ossidati quali ferro(iii) e manganese(iv) e 2 come accettori finali di elettroni. Vengono di seguito illustrati i principali meccanismi noti di attivazione anaerobica degli idrocarburi, a partire dai più semplici fino ad arrivare ai più complessi. Biodegradazione del metano La comprensione dei meccanismi biodegradativi del metano costituisce un significativo elemento di sfida dal punto di vista dell ecologia del sottosuolo. Fino a oggi non è stato ancora isolato alcun microrganismo capace di ossidare in maniera autonoma il metano in assenza di ossigeno molecolare come accettore finale di elettroni. Tuttavia esistono forti evidenze geochimiche sulla possibilità di trasferimento di elettroni dal metano al solfato da parte di popolazioni eterogenee di batteri anaerobi. Queste evidenze, supportate da esperimenti condotti con radioisotopi, sono state confermate di recente mediante mezzi d indagine puramente biologici. Tramite tecniche di ibridazione a fluorescenza in situ (FIS, Fluorescent In Situ ybridization) sono state evidenziate, in associazione a idrati di metano, aggregazioni sintrofiche di archeobatteri circondati da uno strato di microrganismi solfato-riduttori (fig. 6). Sempre in corrispondenza degli idrati di metano nei sedimenti oceanici sono stati rilevati, tramite l impiego di apposite sonde genetiche, ceppi di archeobatteri coinvolti nel metabolismo del metano. Biodegradazione degli alcani La degradazione massiccia e preferenziale degli alcani nei processi di biodegradazione naturale nei giacimenti incide in modo significativo sul valore del materiale di estrazione. Per anni la possibilità di una loro ossidazione biologica in ambienti anossici è stata valutata solo a livello teorico. La dimostrazione sperimentale di quanto ipotizzato è stata possibile grazie alla misurazione quantitativa di consumo degli alcani da parte di batteri solfato-, nitrato- o metallo-riduttori. I meccanismi biochimici responsabili dell attacco agli n-alcani sono tuttora in fase di approfondimento. Fino a oggi sono state discusse tre vie metaboliche principali, due delle quali sono illustrate in fig. 7. n-esano A B 3 [ 2 ] (I) 3 2 (II) (III) b-ossidazione catabolismo ( ) n 2 ( ) n ( ) n (IV) (1-metilpentil)succinato trasformazione degli acidi grassi (per es. allungamento della catena, metilazione del 10 ) fig. 7. Due meccanismi alternativi di degradazione anaerobica di alcani presenti in cellule dei ceppi xn1 (A; Widdel e Rabus, 2001) e xd3 (B; So et al., 2003). VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 277

8 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM La prima, simile a quella descritta per l attivazione del toluene trattata in seguito, vede la formazione di alchilsuccinati come conseguenza dell aggiunta di una molecola di fumarato all alcano. La reazione è stata riscontrata sia in ceppi solfatoriduttori coltivati su n-dodecano, sia nel ceppo nitratoriduttore xn1, capace di crescere su n-esano. La reazione è complessa e non è stato ancora possibile chiarirne tutti gli aspetti. Dalle analisi condotte sugli acidi grassi delle cellule cresciute su alcano come unica fonte di carbonio è emerso che c è un diretto coinvolgimento di un radicale organico e che gli alchilsuccinati sono presenti sotto forma di due diastereoisomeri non racemici. La biochimica che segue all aggiunta di fumarato a formare gli alchilsuccinati non è stata ancora compresa nel dettaglio, anche se si ipotizza che possa essere riconducibile al metabolismo degli acidi grassi. La seconda via metabolica di attacco anaerobico degli alcani è stata sviluppata principalmente su un ceppo solfato-riduttore denominato xd3. Studi condotti con radioisotopi sugli acidi grassi hanno dimostrato che l attacco iniziale potrebbe consistere in una carbossilazione con bicarbonato inorganico in posizione -3 e la contemporanea rimozione di due atomi di carbonio dalla posizione terminale dell alcano a formare un acido grasso, con un atomo di carbonio in meno rispetto alla lunghezza originale. Una terza via metabolica, individuata molto recentemente, è stata osservata nella conversione dell esadecano in metano e 2. Gli esperimenti sono stati condotti non su campioni derivati da un giacimento petrolifero ma a partire da sedimenti anossici contaminati da petrolio e privi di solfati (inferiori a 10 mm), di nitrati (inferiori a 5 mm) e con un contenuto di Fe(III) trascurabile. Mediante ripetuti trasferimenti su terreno fresco è stato possibile ottenere una coltura mista, libera dal sedimento, capace di convertire l esadecano in metano. La produzione di biogas sarebbe stimolata da basse concentrazioni di solfato (inferiore a 2 mm). Gli studi genetici sulla popolazione microbica coinvolta hanno evidenziato almeno tre gruppi di microrganismi: uno di acetogeni sintrofici che degradano l esadecano ad acetato e 2, uno di archeobatteri degradanti l acetato a 4 e 2 e un secondo gruppo di archeobatteri capaci di convertire 2 e 2 in 4. Il processo è stato definito come microbial alkane cracking e viene visto come la potenziale fonte di degradazione in quei giacimenti caratterizzati dalla mancanza dei tradizionali accettori di elettroni. Biodegradazione dei composti aromatici Indagini su popolazioni anaerobie presenti all interno di sedimenti anossici contaminati hanno dimostrato la possibilità di biodegradazione del benzene in condizioni di solfato-, nitrato- e Fe(III)-riduzione. I meccanismi genetici e biochimici che stanno alla base dell attacco e del successivo metabolismo del benzene sono ancora ignoti. Tuttavia durante la fase degradativa è stato osservato un transitorio accumulo di benzoato, fenolo, p-idrossibenzoato, cicloesano, catecolo e acetato come ipotetici intermedi di reazione. Recentemente sono stati isolati due ceppi nitrato-riduttori RB e JJ, appartenenti al genere Dechloromonas, capaci di mineralizzare, in coltura pura, il benzene a 2. Dechloromonas è un tipo di batterio ubiquitario nelle falde acquifere anaerobiotiche. Insieme agli xileni e agli alchilbenzeni il toluene rappresenta la categoria di idrocarburi meglio caratterizzata dal punto di vista della biochimica della biodegradazione anaerobica. L identificazione del benzilsuccinato come intermedio di reazione in colture di batteri solfato- e nitrato-riduttori ha costituito il primo importante passo verso la comprensione di molti meccanismi legati alla degradazione del toluene e di altri idrocarburi: è stato dimostrato che il benzilsuccinato è il primo intermedio di reazione tra il toluene e il fumarato. Per la caratterizzazione degli enzimi responsabili della reazione sono stati adottati approcci sia genetici sia biochimici. Una serie di geni organizzati all interno dell operone bss (benzilsuccinato-sintasi) sono stati isolati in Thauera aromatica, Geobacter metallireducens e Azoarcus sp. e caratterizzati dal punto di vista strutturale e funzionale. Due di questi geni hanno mostrato un alta omologia con altri geni codificanti enzimi conosciuti: la piruvato-formiato-liasi e la ribonucleotide-reduttasi. Queste due proteine sono note per ospitare radicali glicilici all interno della loro catena polipeptidica. L attività dell operone bss è schematizzata in fig. 8. Alla formazione del benzilsuccinato fanno seguito reazioni riconducibili alla b-ossidazione degli acidi grassi che portano alla formazione di acetil-oa e benzoil- oa. Gli enzimi responsabili e i relativi geni (organizzati nell operone bbs) coinvolti nella loro biosintesi sono stati identificati. Lo schema di reazione dal benzilsuccinato a benzoil-oa è riportato in fig. 9. Per la successiva degradazione del benzoil-oa seguono reazioni di dearomatizzazione riduttiva con conseguente rottura dell anello aromatico e reazioni ancora una volta assimilabili alla b-ossidazione degli acidi grassi. Le modalità di attacco anaerobico all etilbenzene finora identificate sono due. Nella prima, caratteristica dei batteri nitrato-riduttori, è evidente la comparsa di 1-feniletanolo e acetofenone come intermedi di reazione. L enzima responsabile della reazione, isolato da un ceppo di Azoarcus, è l etilbenzene-deidrogenasi, una eme/molibdeno/ferro-zolfo proteina periplasmatica, di cui recentemente sono stati isolati i geni. Nei microrganismi solfato-riduttori l ossidazione dell etilbenzene sembra seguire una via completamente 278 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

9 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS 3 toluene xileni etilbenzene propilbenzene etilbenzene naftalene 2-metilnaftalene benzilsuccinato (metilbenzil)succinati 1-feniletanolo 1-fenilpropanolo (1-feniletil)succinati 2-naftoato (2-naftilmetil)succinato fig. 8. Reazioni di attacco ossidativo iniziale di composti aromatici in microrganismi anaerobi (Widdel e Rabus, 2001). diversa, che include la formazione di (1-fenilpentil)succinato come metabolita intermedio specifico. Tale reazione è riconducibile a quella individuata per la degradazione degli n-alcani e del toluene, in cui una molecola di fumarato viene aggiunta all idrocarburo (v. ancora fig. 9). Nonostante la nota resistenza alla biodegradazione da parte degli idrocarburi policiclici aromatici (PA, Polycyclic Aromatic ydrocarbons), studi condotti su comunità di microrganismi solfato-riduttori e nitratoriduttori hanno dimostrato l ossidazione anaerobica di composti quali naftalene, fenantrene, metilnaftalene, fluorene, fluorantrene e bifenile a 2. Tra gli intermedi di reazione identificati, il 2-naftoato e l acido fenantrencarbossilico sono il risultato dell incorporazione di 2 rispettivamente nel naftalene e nel fenantrene. Anche per la degradazione anaerobica dei PA è stata osservata una reazione che coinvolge il fumarato nel processo iniziale di attivazione: a partire dal 2-metilnaftalene, in presenza di una popolazione microbica di solfatoriduttori, è stato isolato l acido naftil-2-metilsuccinico come intermedio della reazione degradativa. Analisi biomolecolari di microrganismi che utilizzano componenti del petrolio nell ambiente Nelle indagini ambientali, quando si studia la distribuzione di specie con proprietà peculiari è possibile effettuare una ricerca mirata a geni specifici: il DNA viene estratto direttamente dai campioni di suolo e, una volta purificato, viene analizzato con l ausilio di sonde di DNA specifiche. Le sonde vengono progettate (e sintetizzate chimicamente) per lo più in base alla conoscenza pregressa 3 toluene fumarato 2[] 1 bssab 2 7 succinato sdh SoA 3 SoA 4 SoA 5 SoA 6 SoA benzilsuccinato succinil-oa bbsef bbsg 2[] 2 bbs bbsd 2[] bbsb benzoil-oa oas succinil-oa fig. 9. ammino metabolico di conversione anaerobica del toluene a opera dei geni bss (Leuthner e eider, 2000). I numeri indicano i passaggi ossidativi della reazione complessiva da toluene a benzoil-oa, catalizzati dagli enzimi bssab e bbsbdefg. Sdh, succinato-deidrogenasi. VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 279

10 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM di geni con funzione e sequenza note, depositati nelle banche dati pubbliche (per esempio, quella presso il National enter for Biotechnology Information o presso lo European Molecular Biology Laboratory - European Bioinformatics Institute). Le sequenze amminoacidiche (proteine) o nucleotidiche (DNA) vengono confrontate tra loro con programmi di allineamento: in tal modo vengono identificate porzioni identiche, o quasi identiche, all interno di famiglie di geni (o proteine). Queste porzioni, con sequenza identica o molto simile, vengono utilizzate per la sintesi chimica di corte molecole di DNA con sequenza specifica o quasi specifica (primer), che fungono da sonde per la ricerca successiva di geni simili (omologhi) nei DNA campionati. La tecnica elettiva per analisi di questo tipo è la PR (Polymerase hain Reaction): i frammenti specifici di DNA, presenti, anche in piccole quantità, nei campioni ambientali, vengono amplificati enzimaticamente in modo da ottenere una quantità adeguata di materiale per applicazioni successive. I prodotti di PR possono essere direttamente sequenziati nel caso in cui i frammenti amplificati appartengano a un singolo gene e quindi presentino una sequenza unica. Se il prodotto di amplificazione viene da un campione ambientale è però probabile che contenga frammenti provenienti da geni omologhi appartenenti a diverse specie: in questo caso la sequenza non è unica e i frammenti specifici devono essere separati. La separazione può essere effettuata attraverso il clonaggio su plasmide (o altro vettore di DNA) oppure mediante l uso di tecniche alternative. La DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) consente di separare elettroforeticamente, in un gel di poliacrilammide, frammenti di DNA che differiscono anche di un solo nucleotide; questa tecnica si fonda sulla presenza di agenti denaturanti nel gel e sull alta temperatura. Una volta separati, i frammenti possono essere clonati o sequenziati direttamente. on un applicazione particolare, denominata PR quantitativa o real time PR, può essere misurata indirettamente la quantità di DNA specifico presente in un campione. La tecnica prevede l utilizzazione di una molecola fluorescente in grado di intercalarsi nella doppia elica, man mano che questa si forma, durante la reazione di amplificazione; la quantità di molecola legata è all incirca proporzionale alla quantità di DNA a doppia elica presente. La costruzione di curve di taratura con quantità note di DNA iniziale permette una quantificazione precisa. Tra le tecnologie che trovano applicazione nel settore della ricerca ambientale, quella legata all uso di microarray a DNA è estremamente promettente: in questo modo è possibile rilevare la presenza di parecchi geni simultaneamente e farne un analisi semiquantitativa. Sebbene i costi attuali siano elevati, in futuro essa diventerà sicuramente una tecnica di routine. Analisi biomolecolare di batteri aerobi alcano-ossidanti Sebbene esistano altre tecniche utilizzabili nelle indagini ambientali, attualmente quelle derivanti dalle applicazioni della PR sembrano essere le più efficaci per un analisi delle popolazioni microbiche legate alla presenza di microseep. La letteratura disponibile fornisce numerosi esempi di come le tecnologie biomolecolari siano state adoperate nella caratterizzazione delle popolazioni microbiche idrocarburo-ossidanti. Il gruppo maggiormente studiato è quello dei batteri metanotrofi, che è stato caratterizzato mediante l impiego di sonde specifiche per i geni degli RNA ribosomali (16S rrna), delle subunità catalitiche delle metano-monossigenasi (geni mmox e pmoa) e della metanolo-deidrogenasi (mxaf). Le sonde di elezione per questi studi sono quelle per le subunità catalitiche delle metano-monossigenasi, specifiche del sistema. Le sonde per le metanolo-deidrogenasi hanno un livello di specificità inferiore, avendo omologie evidenti con altre alcoldeidrogenasi; inoltre esse sono in grado di riconoscere tutti i batteri metanolo-ossidanti (molti metilotrofi), che contano un numero di specie molto superiore rispetto a quello dei metanotrofi. Batteri metano-ossidanti sono stati identificati in acque, sedimenti e suoli asciutti in corrispondenza di laghi, fiumi, coltivazioni di riso, prati, impianti di trattamento e pozzi petroliferi a diverse latitudini, compresi i suoli artici. In molti laboratori sono in corso ricerche volte alla caratterizzazione molecolare dei sistemi implicati nell uso degli alcani gassosi. Fino a oggi non sono stati pubblicati studi ambientali, basati sulle tecniche biomolecolari, in quanto non vi sono ancora sonde considerate sufficientemente universali. È possibile che una parte delle specie contenga sistemi enzimatici omologhi alle metano-monossigenasi solubili (famiglia delle diferromonossigenasi). Nel caso dei batteri in grado di utilizzare gli alcani a catena più lunga (liquidi), le sonde specifiche per i geni alk si sono dimostrate insostituibili essendo questo un sistema ben distribuito tra le specie. All interno del sistema il gene target ottimale è alkb (alcano-idrossilasi), in quanto conservato a livello di sequenza e specifico del sistema. Una delle applicazioni delle sonde basate sui geni alk è stata l analisi delle popolazioni batteriche che si sviluppano in aree contaminate da idrocarburi o in conseguenza di sversamenti (oil spill). Analisi biomolecolare di microrganismi anaerobi associati agli idrocarburi Analogamente alle indagini molecolari delle specie che utilizzano componenti del petrolio nell ambiente di superficie, esistono oggi i presupposti che rendono possibile l identificazione di specie degradative di idrocarburi in assenza di ossigeno. Alcuni sistemi genici di 280 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

11 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS riferimento sono già noti (i geni bss) e possono essere utilizzati per l identificazione di specie anaerobie degradative (Nivens et al., 2004). Sicuramente l avanzare delle conoscenze nel campo della genomica e della microbiologia della biosfera più profonda consentirà un grande sviluppo delle applicazioni in questo campo Applicazioni Biotecnologie applicate all esplorazione Biosurvey Negli ultimi decenni le compagnie di esplorazione petrolifera si sono orientate verso l impiego di tecniche economiche, da affiancare alle costose tecniche consolidate, nella ricerca di giacimenti sia di petrolio sia di gas. Molti dati si sono accumulati in favore di quelle tecniche che riguardano la cosiddetta surface exploration: l esplorazione superficiale rappresenta un modo più o meno indiretto per rilevare la presenza di giacimenti sottostanti, basandosi sui cambiamenti, denominati anomalie, prodotti nell ambiente superficiale o subsuperficiale dalla migrazione di idrocarburi provenienti dai giacimenti stessi. Tale rilascio può avvenire in forme eclatanti, come nei fenomeni di macroseepage, oppure può essere appena percepibile (microseepage): in quest ultimo caso le molecole che migrano alla superficie, generalmente alcani a catena corta allo stato gassoso, sono rilevabili solo tramite tecniche analitiche sensibili. I metodi di esplorazione superficiale adottati sono svariati e possono essere classificati approssimativamente in diretti o indiretti. I metodi diretti sono quelli che permettono di individuare e quantificare la presenza delle molecole target con analisi, generalmente cromatografiche. on i metodi indiretti si cerca invece di individuare le anomalie indotte nell ambiente a causa della concentrazione inusuale di idrocarburi in determinate aree: tali anomalie possono essere di tipo geologico, chimico, oppure riguardare la presenza di vegetazione particolare, di batteri con caratteristiche peculiari, ecc. Le anomalie vengono rilevate in quanto in alcune aree i valori dei parametri presi in considerazione differiscono significativamente rispetto ai valori basali di riferimento ottenuti in aree adiacenti. In molti casi è stato notato che alla superficie, in corrispondenza di giacimenti di olio o gas, si installano popolazioni batteriche che, presumibilmente, sfruttano la presenza degli alcani gassosi o volatili migrati dai reservoir sottostanti. Queste osservazioni sono alla base delle tecnologie di prospezione microbiologica o biosurvey. La rilevazione di batteri specifici può essere effettuata con mezzi economici e in tempi estremamente ridotti. Attualmente le popolazioni microbiche vengono individuate e caratterizzate dal punto di vista qualitativo e quantitativo grazie alla loro capacità di crescere in coltura utilizzando come fonte di carbonio idrocarburi specifici. Seepage Una volta prodotti nella roccia madre, olio e gas migrano attraverso rocce permeabili in cui pori e microfratture sono interconnessi e creano spazi sufficienti per permettere il movimento dei fluidi. lio e gas sono meno densi dell acqua che riempie gli spazi nella roccia e quindi tendono a dirigersi verso l alto. Essi possono essere intrappolati durante la migrazione se questa viene interrotta o rallentata a causa della presenza di rocce impermeabili (fig. 10). In molti casi i reservoir non hanno tenuta perfettamente stagna e la migrazione può proseguire fino alla superficie, in base alla natura delle molecole in movimento e a quella del suolo che esse attraversano. Tale rilascio (seepage o seep) può essere visibile macroscopicamente in aree di accumulo: in tal caso il fenomeno viene giacimento a olio giacimento a olio e gas profondità (km) temperatura ( ) 1 50 maturità della roccia madre 2 assenza di gas o olio olio giacimento a gas gas olio e gas kerogene: assenza di olio e gas fig. 10. Modello in sezione in cui sono rappresentati giacimenti a olio, gas e gas con olio a diversi stadi di maturazione. VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 281

12 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM definito macroseepage (macroseep). I macroseep generalmente sono localizzati al termine di faglie o fratture. In altri casi il rilascio riguarda una quantità ridotta di idrocarburi a catena corta, allo stato gassoso; tali tracce possono essere rilevate solamente con analisi specifiche: in questo caso si parla di microseepage (microseep). Tra i due estremi vi possono essere manifestazioni intermedie che dipendono dalle caratteristiche del giacimento stesso e dalle caratteristiche geologiche dello strato sovrastante. I seepage sono evidenziabili sia sulla terraferma sia offshore. I seep sono fenomeni noti nelle loro diverse manifestazioni, siano esse molto o poco eclatanti, mentre i meccanismi attraverso i quali vengono generati sono tuttora ampiamente dibattuti. Particolare attenzione viene rivolta ai microseep, in quanto gli idrocarburi gassosi si muovono verticalmente al di sopra dei giacimenti, permettendo di localizzarli, mentre di rado la migrazione può avvenire lateralmente. Sebbene non vi sia ancora un modello in grado di spiegare il modo e la velocità con cui gli idrocarburi arrivano alla superficie, i microseep sono comunemente considerati possibili indicatori della presenza di accumuli di olio o gas. Numerosi sono i casi in cui è stata dimostrata un anomala presenza superficiale di idrocarburi in corrispondenza di giacimenti. In alcuni esempi, queste anomale presenze erano esattamente al di sopra di giacimenti individuati in precedenza con metodi sismici; in altri casi è stata individuata una dispersione laterale di poche centinaia di metri rispetto al giacimento. Anomalie superficiali La presenza di seep determina variazioni alla superficie di diverso genere (anomalie), che sono direttamente o indirettamente dipendenti dalle concentrazioni relativamente alte di idrocarburi nel suolo. Diverse anomalie possono essere indotte dalla presenza di batteri in grado di metabolizzare idrocarburi: per esempio il metabolismo batterico stesso può indurre variazioni nell equilibrio redox dell ambiente e provocare la formazione di precipitati magnetici del ferro, quali magnetite (Fe 3 4 ), maghemite (g-fe 2 3 ), pirrotite (Fe 7 S 8 ) e greigite (Fe 3 S 4 ). La presenza di questi minerali in associazione a seep idrocarburici è stata spesso rilevata in aree sovrastanti accumuli di gas o petrolio. La presenza di seep è d altra parte solo una delle varie possibili cause della formazione di tali precipitati magnetici (Schumacher, 1996). I batteri hanno anche un ruolo nel deposito di calcite (calcite cement), nella formazione, attraverso la produzione di solfuro di idrogeno, di pirite, nell abbassamento del livello di potassio e, in alcuni casi, nell innalzamento del livello dell uranio (misurati con la spettrometria gamma). In fig. 11 si riassumono alcune delle anomalie prodotte. anomalia da rilascio al bordo idrocarburi bloccati dal Delta anomalia apicale interstiziale degli idrocarburi affioramento attivo diretto e rilascio di idrocarburi zona influenzata dall acqua piovana depositi recenti di calcite e siderite con rilascio bloccato di idrocarburi affioramenti bloccati da calcite e siderite anomalia da rilascio al bordo idrocarburi bloccati dal Delta intrappolamento di idrocarburi (in soluzione) (in soluzione) (bloccato) (bloccato) soluzione di minerali di calcio e ferro a( 3 ) 2 (in soluzione) Fe( 3 ) 2 (in soluzione) bicarbonato di calcio e ferro in soluzione biossido di carbonio, solfuro d idrogeno e acqua rilascio gassoso di idrocarburi rilascio di idrocarburi (bloccato) (acqua piovana) (bloccato) (acqua piovana) (in soluzione) (in soluzione) degradazione chimica o batterica degli idrocarburi anaerobia: aerobia: petrolio fig. 11. Modello ipotetico di meccanismi di formazione di anomalie di superficie (Saunders et al., 1999). Delta rappresenta il carbone ferroso. 282 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

13 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS L esplorazione petrolifera richiede uno sforzo coordinato, basato sull integrazione delle conoscenze geologiche, geofisiche e geochimiche. La prospezione geologica di superficie rappresenta un utile strumento per ridurre i rischi esplorativi, portando a una diminuzione dei costi e dei tempi. L analisi dei gas nei suoli e le tecniche di prospezione sismica permettono soprattutto di: a) valutare rapidamente il potenziale produttivo di regioni inesplorate; b) differenziare tra aree del giacimento che producono olio o gas; c) integrare i dati geofisici di prospezioni precedenti; d) seguire l evoluzione di siti già sfruttati. Nei seep, con le tecniche dirette, vengono rilevati principalmente, e in quantità decrescenti, metano, etano, propano e butano, di cui gli ultimi tre vengono considerati maggiori indicatori di olio. Alcani con catena superiore a 4 sono rari, sebbene i volatili, come pentano o esano, possano essere presenti in quantità misurabili. Il metano ha lo svantaggio di essere prodotto da diverse specie microbiche ed è quindi diffuso nell ambiente (origine biogenica). Anomalie nella quantità di metano possono essere comunque utilizzate per la ricerca di giacimenti di gas. Fino alla prima metà degli anni inquanta i metodi gravimetrici, magnetometrici e di sismica a rifrazione erano quelli utilizzati dalle grandi compagnie petrolifere. Successivamente, grazie anche a una serie di innovazioni tecnologiche, il metodo di esplorazione geofisica che è progressivamente diventato di gran lunga più utilizzato è quello della sismica a riflessione. La sismica a riflessione fornisce un immagine del sottosuolo che può essere a due dimensioni, distanza e profondità, o tridimensionale. Le indagini sismiche sono considerate indispensabili per l identificazione delle strutture in cui si trovano olio e/o gas. Altre tecniche indirette vengono comunemente affiancate alla sismica, specie nella fase iniziale della prospezione; alcune di queste vengono utilizzate in base alle condizioni ambientali mentre per altre non è ancora nota la reale applicabilità. Prospezione microbiologica La prospezione microbiologica utilizza l applicazione delle comuni tecniche microbiologiche per l individuazione indiretta di microseep. ome detto precedentemente, la presenza di batteri determina una modificazione dell ambiente con la conseguente insorgenza di anomalie. Piuttosto che le anomalie prodotte, è più facile individuare direttamente le specie batteriche che le producono o, in modo ancora più mirato, quelle che utilizzano i gas presenti a livello dei seep come fonte di carbonio per il proprio metabolismo. La MST (Microbial il Survey Technique) e la MPG (Microbial Prospection for il and Gas) sono tecniche analoghe, introdotte da società concorrenti, basate sulla ricerca diretta di batteri in grado di utilizzare alcani a catena corta (gassosi o molto volatili). Tali specie batteriche sono presenti a livello dei microseep dove gas come metano, etano, propano e butano giungono alla superficie. Gli alcani vengono ossidati, in presenza di ossigeno, ai loro rispettivi alcoli (per esempio il metano a metanolo). Gli alcoli entrano nel circuito del metabolismo batterico e le cellule ne traggono energia e carbonio per il proprio ciclo vitale. Batteri alcano-ossidanti sono normalmente presenti nell ambiente e non solamente associati alla presenza di idrocarburi superficiali; è stato però verificato che laddove vi siano anomalie nella presenza di idrocarburi viene segnalata anche un anomalia nella presenza di batteri idrocarburo-ossidanti, tanto da poter individuare una correlazione positiva tra la concentrazione di idrocarburi e la densità di tali popolazioni batteriche. Durante le survey microbiologiche vengono raccolti campioni di terreno a cm al di sotto della superficie (sia onshore sia offshore). Il campionamento viene fatto generalmente in base a una griglia, l ampiezza delle cui maglie dipende dalle caratteristiche geofisiche e geografiche dell area oppure dalla finalità del campionamento stesso: nel caso di prospezioni preventive in ampie aree sconosciute, la distanza tra un campione e l altro può essere superiore a 1 km; nel caso di una caratterizzazione fine di un sito, già noto dal punto di vista geofisico, eventualmente in corso di sfruttamento, i punti di campionamento distano anche poche decine di metri. In fig. 12 sono mostrati i risultati derivati da griglie con diversa spaziatura. Sia la MST sia la MPG prevedono la coltivazione delle cellule batteriche presenti nel campione di suolo. Metano, propano, butano oppure una miscela di gas vengono utilizzati come unica fonte di carbonio; in queste condizioni crescono selettivamente le specie in grado di nutrirsi con le molecole specifiche. Le cellule batteriche vengono raccolte lavando una quantità standard di suolo con un volume fisso di un liquido di eluizione. Dalla sospensione iniziale vengono preparate diluizioni seriali; una piccola quantità di ciascuna diluizione può essere seminata su un terreno di coltura solido, dove ogni cellula darà origine a una colonia: la conta delle colonie fornirà un indicazione della quantità di cellule iniziali presenti nel suolo. In alternativa le diluizioni vengono fatte direttamente nel terreno di coltura: dopo incubazione per un tempo adeguato tutte le diluizioni in cui è presente almeno una cellula vivente daranno origine a una coltura visibilmente cresciuta. Alcune delle diluizioni, non contenendo nemmeno una cellula, non daranno crescita. Replicando opportunamente ciascuna diluizione (almeno in triplo) si otterrà una stima del numero iniziale di cellule presenti nel campione di suolo. La tecnica MST prevede anche un analisi dell attività alcano-ossidante delle popolazioni VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 283

14 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM fig. 12. Rappresentazione grafica di dati raccolti da una campagna di prospezione ed esemplificati per campionamenti a griglie di dimensioni diverse. spaziatura campioni: spaziatura campioni: spaziatura campioni: m m m batteriche: le cellule raccolte in un area in cui sono presenti idrocarburi superficiali esprimono l attività ossidante con una rapidità superiore a quelle che sono state campionate in zone prive di livelli significativi di gas. I risultati dell analisi microbiologica vengono visualizzati, come per i dati geochimici, su mappe bidimensionali in cui vengono mostrate l area di distribuzione e la densità delle popolazioni dei batteri idrocarburo-ossidanti (eventualmente separati in classi metaboliche in funzione delle specifiche molecole usate come fonte di carbonio); i dati vengono trattati similmente a quelli geochimici e geofisici. La casistica riportata in letteratura generalmente mostra una notevole efficacia delle tecniche microbiologiche nell individuazione di giacimenti. Sono stati riportati, per esempio, i risultati di un indagine che, tramite prospezione microbiologica in zona inesplorata, ha individuato come produttivi 13 pozzi su 18 trivellati: il successo in questo caso è stato del 72%; gli autori hanno ammesso che in assenza di MST il successo sarebbe stato del 30%. In un secondo caso è stato riportato lo studio effettuato su 225 pozzi, di cui 101 in produzione (olio o gas) e 124 non produttivi. In corrispondenza di 83 pozzi produttivi sono state individuate anomalie, mentre 119 pozzi improduttivi sono risultati in aree prive di anomalie: in questo caso, il successo nella predizione basata sui metodi microbiologici ha oscillato attorno al 90%. Le tecniche microbiologiche hanno alcuni importanti vantaggi rispetto ad altre tecniche di prospezione superficiale, tra cui: a) l acquisizione dei campioni non richiede particolare strumentazione e l impatto ambientale è pressoché nullo; b) i costi sono estremamente limitati, per esempio con una delle tecniche proposte il costo complessivo ammonta a dollari per miglio lineare; c) l assenza di limiti di carattere geologico o geografico; d) la scarsa dipendenza dalla geologia dei suoli al di sotto della superficie e la possibilità di fare previsioni sulle caratteristiche del giacimento relativamente alla qualità degli idrocarburi presenti. Di contro non è possibile avere informazioni sulla collocazione e la consistenza dei giacimenti. Per questi motivi la prospezione microbica viene considerata un alternativa efficace ed economica rispetto ad altre tecniche in una fase precedente alla esplorazione sismica. In una recente survey in Guyana sono state localizzate 22 anomalie microbiche per un area totale di 250 km 2 ; una successiva indagine sui gas (sorbed gas analysis) ha dimostrato che queste anomalie erano associate a microseepage di idrocarburi: differentemente dall indagine microbiologica l analisi chimica dei seep ha avuto un efficacia limitata, a causa della natura particolarmente acida dei suoli che non ha consentito un campionamento esteso sull intera area. È prevedibile che nei prossimi anni vengano sviluppati strumenti biomolecolari per l esplorazione terrestre e offshore, sia per la rapidità nell acquisizione delle informazioni, sia per la possibilità di analizzare in dettaglio le popolazioni microbiche senza la necessità della coltivazione. on le metodologie avanzate appropriate è inoltre possibile tracciare in un ambiente la presenza di un singolo gene mediante l uso di sonde specifiche. La possibilità di misurare la quantità dei geni responsabili dell ossidazione degli alcani presenti in un campione mediante le tecniche di amplificazione o, in futuro, grazie all uso di microarray, potrebbe rendere queste tecnologie preferenziali in indagini esplorative o presuntive da integrare con le irrinunciabili analisi sismiche. 284 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

15 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS Analisi del rischio di biodegradazione del greggio Nell ambito dell esplorazione e produzione petrolifera, uno dei maggiori fattori di rischio è costituito dalla possibilità di imbattersi in un giacimento contenente un olio la cui qualità sia fortemente compromessa dall attacco microbico alle sue componenti più pregiate, con significative ricadute dal punto di vista sia economico sia operativo. Particolare attenzione viene posta su giacimenti poco profondi e relativamente freddi, caratterizzati da temperature che non superano º. In questi ambienti, nonostante le condizioni ecologiche e le popolazioni batteriche possano differire significativamente tra un sito e un altro, la probabilità di riscontrare un forte indice di biodegradazione degli idrocarburi estraibili è estremamente alta. Tipicamente, la sequenza degradativa dei composti presenti nel petrolio vede al primo posto gli n-alcani seguiti dai ramificati saturi, dai ciclici saturi, dagli aromatici ciclici e policiclici, da sterani, hopani e cerani (fig. 13). L azione microbica può dunque incidere sensibilmente su parametri fondamentali della qualità dell olio estraibile, quali: l abbassamento del grado API (American Petroleum Institute), l aumento della viscosità e della concentrazione di elementi indesiderati come metalli pesanti (soprattutto nichel, vanadio e ferro), asfalteni, cere e zolfo. Un olio con queste caratteristiche ha un basso valore commerciale a causa delle basse rese di distillazione e del conseguente aumento dei residui di lavorazione, per la presenza consistente di acidi naftenici livello di biodegradazione gas 1-5 metano etano propano isobutano n-butano pentani molto basso basso moderato alto molto alto n-alcani idrocarburi 6-15 idrocarburi isoalcani isoprenoidi aromatici BTEX alchilcicloesani n-alcani, isoalcani isoprenoidi naftaleni ( 10+ ) fenantreni, DBT criseni sterani regolari hopani biomarker hopani sterani triaromatici sterani monoaromatici gammacerano oleanano sterani terpani triciclici diasterani diahopani 25-nor-hopani* sec-hopani* *comparsa, piuttosto che diminuzione, dei livelli (si ritiene che queste molecole siano prodotte durante la degradazione) fig. 13. Livelli di biodegradazione del greggio basati sulla concentrazione relativa di diversi composti presenti nel petrolio (Wenger et al., 2002). BTEX, benzene-toluene-etilbenzene-xileni; DBT, dibenzotiofene. VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 285

16 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM (fonte di corrosione e di emulsioni) e per i molteplici problemi di raffinazione conseguenti alla presenza di metalli pesanti e zolfo. Negli oli degradati lo zolfo è presente sia in forma organica (a causa della sua resistenza all attacco microbico), sia in forma inorganica come 2 S, che costituisce il prodotto finale della solfato-riduzione microbica. Il solfuro di idrogeno è tossico, causa gravi problemi di corrosione e forma precipitati di solfuro di ferro che rendono difficoltosa la separazione delle emulsioni olio/acqua e riducono la permeabilità delle rocce del giacimento qualora venga iniettata acqua in fase di estrazione. Inoltre, l alta viscosità incide negativamente sulla produttività dei pozzi e sul fattore di recupero dal giacimento, riducendone la convenienza rispetto a un accumulo di olio leggero. Attività di ricerca e sviluppo tipicamente legate all industria del settore petrolifero vengono focalizzate sulla possibilità di comprendere i meccanismi di azione, gli attori biologici coinvolti e le condizioni ambientali necessarie per l attivazione dei microrganismi anaerobi idrocarburo-clastici, al fine di poter sviluppare dei modelli matematici capaci di prevedere, a livello di semplice prospezione, l eventuale livello di degradazione dell olio con la massima accuratezza possibile. Lo sviluppo di uno strumento di questo tipo potrebbe consentire di valutare meglio le aree esplorative, con un importante sgravio degli onerosi costi di perforazione. L obiettivo è sicuramente ambizioso, dal momento che la nicchia ecologica occupata dai batteri capaci di sfruttare gli idrocarburi come fonte di carbonio ed energia per la propria crescita è strettamente correlata a un ambiente la cui esplorazione presenta molti elementi problematici dal punto di vista tecnico (come la reperibilità dei campioni e il loro trattamento) e che è, a oggi, in gran parte sconosciuto. Fino alla fine degli anni ttanta la comunità scientifica concordava sul fatto che l ossidazione degli idrocarburi potesse avvenire esclusivamente in condizioni aerobiche, tramite il costante apporto di ossigeno molecolare veicolato da acque meteoriche. Tale principio è stato poi smentito, dal punto di vista sia geochimico sia biologico, con la scoperta di giacimenti profondi (quindi non soggetti a esposizione ad acque fresche ossigenate) ad alto grado di biodegradazione e l isolamento, a partire dai primi anni Novanta, di microrganismi capaci di ossidare gli idrocarburi in assoluta anaerobiosi. Quest ultima scoperta ha avuto un importante impatto sui criteri applicati dai geochimici e ha aperto le porte a nuovi studi per i numerosi ricercatori e tecnici che si occupano di microbiologia del sottosuolo e dell ancora poco noto ecosistema del giacimento. Nel modello ExxonMobil (Wenger et al., 2002) l ipotesi della biodegradazione del petrolio per via anaerobica è accettata con favore perché ben si concilia con situazioni sperimentate nell esplorazione offshore. Tra i fattori limitanti della biodegradazione sono riconosciute non solo la temperatura (convenendo sul limite di circa 80 ) e la disponibilità di ossidante per esempio 2, Fe(III), S 4 2, 3 e nutrienti (N, P, K), ma anche la salinità (possibile limite a 150 g/l, Total Dissolved Solids), l acidità, la porosità (area superficiale) e la permeabilità delle rocce. In particolare, è presa in seria considerazione la possibilità che la biodegradazione possa svilupparsi in giacimento oltre la zona del contatto con la tavola d acqua, grazie all acqua comunque presente nei pori. Wenger et al. hanno inoltre elaborato una propria scala di biodegradazione crescente per gli oli. Tale scala si basa sulla presenza di composti di riferimento, visualizzati come picchi in analisi scelte a seconda della natura di tali composti: G (Gas romatografia) per gli idrocarburi, G/MS (Mass Spectrometry; gas cromatografia abbinata alla spettrometria di massa), e G/MS/MS per i biomarker. È particolarmente interessante il confronto con la scala di Peters e Moldowan (1993), rispetto alla quale quella di Wenger et al. si distingue per la semplificazione dei livelli di degradazione (cinque contro dieci) e, allo stesso tempo, per il maggior numero di specie idrocarburiche e di biomarker considerati e il maggior dettaglio nella definizione delle componenti idrocarburiche. La sequenza di crescente resistenza alla biodegradazione delle specie chimiche rimane nei tratti generali sovrapponibile a quella di Peters e Moldowan (n-paraffine isoprenoidi sterani hopani e diasterani steroidi aromatici), ma l attenzione è ora decisamente spostata sulle fasi iniziali della biodegradazione. Infatti, a differenza della scala di Peters e Moldowan, per definire il confine del primo stadio di biodegradazione si suggerisce l utilizzazione degli isoalcani leggeri 6-15 (oltre agli isoprenoidi più leggeri), mentre l attacco differenziato ad alcuni idrocarburi ciclici e aromatici (insieme agli isoprenoidi più pesanti) segna e distingue i livelli di biodegradazione intermedia (per esempio: BTEX alchilcicloesani, naftaleni fenantreni e dibenzotiofeni criseni). L attacco ai biomarker definisce lo stadio di biodegradazione più severa, con possibili distinzioni tra le diverse specie, anche se ritenute meno rilevanti per applicazioni in produzione (v. oltre). La comparsa della serie dei 25-nor-dimetilhopani è considerata un prodotto della biodegradazione nello stadio più avanzato, quindi un importante marker per riconoscere, per esempio, situazioni di refreshing (rinnovo della fase liquida con nuovi fluidi) di giacimenti biodegradati in ere precedenti. ome sempre, la sequenza descritta non viene interpretata rigidamente, perché si riconosce una certa specificità ai meccanismi di biodegradazione per tipi diversi di oli. L utilizzazione degli indici di biodegradazione rimane comunque critica, in relazione al possibile succedersi nel tempo su scala geologica di processi quali il recharging (ricarica della fase liquida con nuovi fluidi) dei giacimenti, il dilavamento del petrolio, la 286 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

17 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS separazione di fase, la segregazione gravitazionale, la precipitazione asfaltenica o il cracking termico. Sviluppi futuri prevedono un analisi degli acidi organici, soprattutto gli acidi naftenici (ben noti e temuti prodotti della biodegradazione), per definire nuovi indicatori di bioalterazione in corso nei giacimenti. Appare evidente lo sforzo di migliorare l applicabilità delle scale di biodegradazione all ambito produttivo. In effetti, la progressiva scomparsa di intere classi idrocarburiche (come quella degli n-alcani o degli isoprenoidi, per non parlare dei biomarker) è in genere rilevata per via gascromatografica quando la biodegradazione ha già da tempo intaccato la qualità dell olio, ovvero quando le proprietà di interesse produttivo sono già state almeno in parte compromesse. È però importante anche il contesto produttivo, perché nel caso delle acque profonde (deep water) i gradienti geotermici sono piccoli e differenze di pochi gradi API indotte da uno stadio ancora iniziale di biodegradazione spesso comportano il superamento delle soglie di economicità nello sfruttamento di un giacimento. Per altro verso, una moderata biodegradazione può invece migliorare significativamente alcune caratteristiche degli oli a elevato contenuto di paraffine, come il punto di scorrimento (pour point) e la tendenza alla formazione di cere (situazione comune nei campi petroliferi del Sud-Est asiatico). Per quanto riguarda la biodegradazione del gas naturale, il modello prevede che, nella fase iniziale, i batteri attacchino principalmente il propano, che viene degradato preferenzialmente rispetto all n-butano, determinando effetti misurabili sotto diversi parametri: diminuzione del GR (Gas/il Ratio) per l olio associato; incremento della concentrazione relativa di metano e, spesso, di 2 (sottoprodotto di biodegradazione); frazionamento isotopico (il gas non ancora biodegradato tipicamente il propano viene via via ad appesantirsi nella frazione più ricca di 13, mentre i sottoprodotti tipicamente 2 mostrano un arricchimento in 12 ). Più recentemente, in ambito offshore e deep water, sono emersi elementi importanti per lo sviluppo di sistemi di riferimento su cui fondare analisi di rischio, basati sulla biodegradazione degli idrocarburi che costituiscono affioramenti sui fondali marini. La biodegrazione in tale ambiente ha caratteristiche differenti rispetto a quella degli affioramenti terrestri e dei sottostanti giacimenti (per esempio, non è mai stata rilevata la serie dei 25-nor-hopani, nemmeno nei casi di biodegradazione ultrasevera). Nel caso degli affioramenti sottomarini occorre sempre distinguere l apporto di materia organica recente e indigena ai sedimenti; tuttavia, l identificazione di serie biodegradative proprie dei fondali ha permesso la calibrazione di parametri molecolari (biomarker) utilizzabili con largo anticipo come affidabili indicatori di origine, maturità e proprietà degli oli presenti in giacimenti sottostanti. La calibrazione ha carattere locale perché vi è evidenza di attività da parte di ceppi batterici diversi, con vie di biodegradazione differenti per famiglie diverse di oli. È stato inoltre osservato che il livello di biodegradazione sui fondali interessati dagli affioramenti cresce con la quantità totale di idrocarburi nei sedimenti e, forse, con l entità delle stesse riserve sottostanti; è anche ipotizzata l esistenza di una soglia del flusso di idrocarburi al di sotto della quale i processi biodegradativi diventano insostenibili. L attività batterica è poi chiaramente influenzata dalla tipologia stessa dei sedimenti (porosità e permeabilità). I fattori più significativi per lo sviluppo di nuovi modelli di biodegradazione, definiti nel corso di studi e progetti industriali recenti, possono essere riassunti come segue: la biodegradazione degli idrocarburi nel giacimento è un processo principalmente anaerobico e pertanto non sono necessarie esposizioni ad acque ossigenate; i flussi di degradazione sono stati stimati nell ordine di 10 4 kg/m 2 /a e variano al variare della temperatura del giacimento, con valori prossimi a zero intorno agli 80 ; più del 50% della frazione dell olio superiore ai 12 atomi di carbonio può essere utilizzato a diversi livelli di biodegradazione; la biodegradazione dell olio in giacimenti relativamente freddi e affiorati dagli strati profondi è un processo che può essere evitato con una precedente pastorizzazione del petrolio, avvenuta quando l olio occupava strati più profondi dove le temperature superavano gli 85 ; l interfaccia olio/acqua sembra essere il punto più probabile per l attività degradativa: i donatori di elettroni vengono forniti dall olio e gli accettori finali, insieme ai nutrienti, dall acqua. Gli sviluppi conoscitivi recenti in questo campo, che riguardano principalmente la scoperta di nuovi microrganismi anaerobi attivi nel sottosuolo nell ossidazione di idrocarburi, i relativi cammini metabolici di degradazione e le interazioni tra geochimica e fisiologia microbica del sottosuolo, avranno un impatto importante nella formulazione di nuovi modelli predittivi. Il recente ritrovamento di intermedi di reazione nei percorsi ossidativi di idrocarburi in ambienti anaerobiotici (Aitken et al., 2004) è un esempio di sviluppo di nuovi indicatori utili nella valutazione delle zone identificate per l esplorazione petrolifera. Biotecnologie applicate alla produzione Prevenzione da produzione e accumulo di solfuro di idrogeno (souring) nei giacimenti La presenza di solfuro di idrogeno nei pozzi petroliferi è stata rilevata fin dal 1920 e solo nel 1926 si è capito che, a temperature inferiori a 100, essa può essere VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 287

18 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM fatta risalire all attività di batteri solfato-riduttori presenti nei pozzi stessi. Esiste anche un meccanismo termogenico di produzione di 2 S negli strati più profondi della crosta terrestre, ma in generale, nei giacimenti più freddi, l origine di questo gas è prevalentemente biogenica. I notevoli danni che interessano reservoir e impianti di produzione contaminati da popolazioni batteriche solfato-riduttrici attive nella produzione di 2 S devono essere contenuti tramite onerose operazioni di manutenzione e trattamenti ad alto costo che richiedono l uso di biocidi e di anticorrosivi. Il solfuro di idrogeno è un composto pericoloso per la salute umana, induce corrosione metallica e la sua presenza in associazione al greggio in fase produttiva ne abbassa notevolmente la qualità e richiede tecnologie di rimozione specializzate. Questo composto viene prodotto da una varietà notevole di microrganismi solfato-riduttori (SRB, Sulphate-Reducing Bacteria), in assenza di ossigeno e in seguito alla trasformazione enzimatica di solfati, solfiti e tiosolfati. Questi microrganismi possono essere autoctoni del giacimento, o provenire dall acqua iniettata in fase di estrazione secondaria, che può contenere sia i batteri sia le quantità di solfato necessarie per sostenerne l attività. I meccanismi che governano i fenomeni di souring e la loro propagazione nel giacimento non sono stati ancora chiariti ed esistono modelli contrastanti per la predizione delle cinetiche di sviluppo di 2 S nella vita produttiva dei giacimenti interessati dal fenomeno. Due modelli alternativi sono schematizzati in fig. 14. Le tecnologie tradizionali di controllo dei fenomeni di souring prevedono l utilizzazione di biocidi ad ampio spettro o di inibitori della solfato-riduzione a carico degli SRB. Il trattamento con agenti chimici quali l, aldeidi, ammine è costoso, spesso poco efficace, soprattutto a lungo termine, e poco ecocompatibile. Inoltre, i prodotti di degradazione delle stesse sostanze biocide possono fornire substrati addizionali per gli SRB. Tecnologie alternative prevedono la rimozione mediante nanofiltrazione del solfato presente nell acqua utilizzata nel processo di flussazione con acqua (water flooding). A causa dell alto costo, questo metodo è applicato solo di rado, principalmente quando la filtrazione è necessaria per prevenire problemi di formazione di incrostazioni (scaling). Negli anni Novanta sono state utilizzate sperimentalmente nuove tecnologie di controllo e prevenzione dell attività sulfidogenica, basate sul trattamento dell acqua con nitrati. oncentrazioni adeguate di nitrato inducono cambiamenti nella composizione delle popolazioni microbiche dell ambiente del giacimento e l instaurarsi della cosiddetta esclusione biocompetitiva, cioè la competizione tra SRB e NRB (Nitrate-Reducing Bacteria). Sono stati ipotizzati diversi meccanismi concorrenti che rendono possibile il fenomeno di esclusione biocompetitiva: l attività degli SRB è inibita direttamente dalla produzione di intermedi tossici derivanti dalla riduzione del nitrato (per esempio N 2, N 2 ); acqua marina mixing zone acqua di formazione iniettore produttore zona di reazione (SRB attivi) 2 S concentrazione (kmol/m 3 ) 0,04 0,03 0,02 0,01 acqua marina acqua di formazione mixing zone DX solfati origine di 2 S acidi grassi 2 S prodotto iniettore zona di reazione convezione, diffusione, adsorbimento produttore 0 x a distanza x dall'iniettore biofilm gli SRB non migrano nel mezzo poroso senza attività SRB con attività SRB simulatore A B fig. 14. onfronto tra due modelli alternativi di souring del giacimento: A, il modello a mixing zone (Lingthelm et al., 1991); B, il modello a biofilm (Sunde et al., 1993). La zona colorata in giallo indica la regione di attività dei batteri solfato-riduttori e di sintesi di 2 S. 288 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

19 BITENLGIE APPLIATE ALL ESPLRAZINE, PRDUZINE E NVERSINE DI IL & GAS i batteri nitrato-riduttori competono efficientemente con i solfato-riduttori per i comuni donatori di elettroni, così come per le possibili fonti di ; la presenza di NRB zolfo-ossidanti (NR-SB, Nitrate-Reducing Sulfide xidizing Bacteria) produce un effetto inibitorio sulla crescita degli SRB, e dunque sulla produzione di 2 S, probabilmente dovuto all aumento del potenziale redox ambientale (gli SRB necessitano di un potenziale redox molto negativo per una crescita ottimale); in presenza di nitrato sufficiente, l 2 S già presente viene riossidato per via chimica, in parte a zolfo elementare e in parte a solfato. La presenza di attività nitrito-reduttasica può rappresentare un fattore di resistenza delle popolazioni batteriche trattate, eliminando uno dei possibili intermedi che inibiscono attività e crescita della popolazione SRB. I meccanismi del fenomeno sono quindi piuttosto ben studiati in sistemi modello in condizioni controllate, ma il risultato dei trattamenti reali può dipendere in modo rilevante dalla diversa composizione dei consorzi presenti nel giacimento e dalle condizioni nell ambiente circostante (concentrazione di solfato e di acidi grassi volatili). Per queste ragioni le applicazioni nel campo della tecnologia sono spesso legate alle situazioni contingenti del sito. Dopo le prime evidenze sperimentali, sono stati condotti o sono in corso numerosi trattamenti sperimentali con nitrato in campo e in sistemi modello, di cui si riportano alcuni esempi (itzman e Dennis, 2004). Statoil-Norsk ydro. Esperimenti di laboratorio su un modello in piccola scala avevano dimostrato la possibile inibizione della formazione di 2 S dopo l immissione del nitrato. Quest esperimento è stato quindi effettuato in campo, a Veslefrikk nel Mare del Nord, dopo l utilizzazione di water flooding, sostituendo i trattamenti biocidi di gluteraldeide con nitrato. Dopo qualche mese dall immissione sono stati osservati una riduzione dell attività degli SRB (misurata come produzione di 2 S) di volte e simultaneamente un aumento dei batteri NRB. La corrosione di provini metallici è variata da 0,7 a 0,2 mm/a. Trattamento a Skjold. Questo campo a gas in Danimarca ha una produzione associata di 2 S che negli anni è salita da 100 a 700 kg/d. Per tenere sotto controllo questo fenomeno è stato usato il TPS Tetrakis(ydroxymethyl)Phosphonium Sulfate, battericida che riesce a ridurre anche del 40% la quantità di 2 S prodotto e a diminuire i fenomeni di contaminazione e danneggiamento dovuti alla crescita di microrganismi (biofouling) nel sistema di iniezione. Il battericida è stato sostituito con nitrato a mg/l per uno o due mesi in due diversi pozzi iniettori dello stesso campo. Il trattamento ha portato alla riduzione di circa 10 kg/d di 2 S prodotto. Una volta terminato il trattamento, riprende l attività degli SRB. Trattamenti più prolungati potrebbero avere un effetto più marcato sull intero campo. Trattamento di Phillips Petroleum. Il campo di oleville in anada è stato sottoposto a trattamento in continuo per 50 giorni con 500 ppm di nitrato e ne è risultato il controllo totale della produzione di 2 S in un pozzo e del 50-60% nei due pozzi adiacenti. Generalmente si stima che le condizioni più favorevoli ai trattamenti possano essere legate a una situazione preventiva dello sviluppo microbiologico di solfuro di idrogeno, che rende importante l esistenza di modelli predittivi affidabili del fenomeno di souring dei giacimenti. Processi di rimozione di 2 S da miscele gassose I processi biologici di rimozione di 2 S da miscele gassose nell ambito della produzione sono basati sulla capacità di alcuni ceppi aerobi di ossidare lo zolfo secondo la reazione 2 S 1 /2 2 S 2. Il solfuro di idrogeno, disciolto in acqua sotto forma di S, viene ossidato dai microrganismi a zolfo elementare e come tale si accumula fuori dalle cellule e viene separato fisicamente dal mezzo acquoso. Le varianti del processo si differenziano in base alle caratteristiche metaboliche dei ceppi utilizzati come biocatalizzatori (Thiobacillus, Thioalkalivibrio e Thioalkalimicrobium). Per una discussione dettagliata sull applicabilità di questi processi di recente realizzazione, v. cap Microbial enhanced oil recovery Il MER (Microbial Enhanced il Recovery) consente lo sfruttamento di attività microbiche per facilitare il recupero della frazione di petrolio non prodotta da giacimenti giunti alla fine del periodo di produzione primaria e secondaria. Queste tecniche, proposte fin da qualche decennio fa, sono applicate raramente su larga scala, per l ampio margine di rischio di insuccesso stimato a causa della scarsa comprensione dei meccanismi che ne sono alla base. Nonostante questo, negli ultimi anni il MER incontra rinnovato interesse da parte degli operatori, soprattutto in ina, in America Meridionale e nei mari del Nord, probabilmente anche a causa dell avanzamento nelle conoscenze della microbiologia di ambienti estremi quali sono i giacimenti petroliferi. Il MER comporta la gestione delle popolazioni microbiche presenti nel giacimento mediante stimolazione con nutrienti o aggiunta di colture batteriche di tipo appropriato, è potenzialmente poco costoso rispetto ad altri tipi di trattamento terziario e ha impatto ambientale nullo (Brown et al., 2002). Il funzionamento ipotetico del MER si basa generalmente su meccanismi complessi e diversificati: secondo uno dei meccanismi più attendibili (allo stato delle conoscenze attuali) la crescita di biomassa negli strati VLUME III / NUVI SVILUPPI: ENERGIA, TRASPRTI, SSTENIBILITÀ 289

20 NUVE TENLGIE PER UPSTREAM più permeabili del reservoir, associata o meno alla produzione di esopolimeri cellulari (alginati, polisaccaridi, pullulani), può facilitare il plugging (intasamento o ostruzione) selettivo di strati permeabili. Sistemi controllati in vitro basati sull attività di ceppi selezionati quali Leuconostoc hanno dimostrato la possibilità di questi fenomeni. D altra parte, gli stessi esopolimeri cellulari prodotti da cellule coltivate in superficie, per esempio la resina xantano, sono stati utilizzati tradizionalmente, e con successi alterni, in trattamenti di iniezione di acqua addizionata con polimeri (polymer flooding) per indurre modificazione dei profili di permeabilità del giacimento. Un meccanismo alternativo e potenzialmente vincente è basato sulla produzione di biosurfattanti da parte di microrganismi residenti, in grado di indurre un aumento della produzione basato sullo spiazzamento dell olio residuo dai pori, mediante abbassamento della tensione interfacciale olio/acqua. Questo è un fenomeno interessante a livello teorico, ma è stata messa in dubbio la reale possibilità sia numerica sia fisiologica delle popolazioni batteriche residenti in situ di poter sintetizzare quantità sufficienti di surfattanti (Bryant e Lockhart, 2000). D altra parte, in alcuni report le caratteristiche chimico-fisiche delle miscele prodotte dopo stimolazione MER sembrano avvalorare modifiche compatibili con queste ipotesi. Altri prodotti del metabolismo cellulare batterico che possono teoricamente influenzare la mobilitazione del greggio residuo sono i gas ( 2, metano) e gli acidi che in condizioni favorevoli possono indurre solubilizzazione di matrici contenenti carbonati e indurre modificazioni nei profili di mobilitazione acqua/olio. ome per i trattamenti di rimozione di composti inquinanti dalle falde acquifere del sottosuolo mediante stimolazione delle popolazioni microbiche autoctone, è presumibile che occorra adattare i trattamenti alle caratteristiche del sito (o del giacimento) in esame. Questo impone limiti notevoli all applicabilità della tecnologia che richiederebbe studi importanti di caratterizzazione e prefattibilità. Nel tentativo di migliorare le prospettive dei trattamenti MER, le attività di ricerca in corso, sia in laboratorio sia in campo, sono basate sulla definizione di schemi di iniezione di nutrienti limitanti, che usualmente scarseggiano nel sottosuolo, quali azoto e fosforo, per stimolare in modo generalizzato la crescita e l attività microbica, e/o sulla coltivazione e la caratterizzazione di ceppi selezionati in situ per caratteristiche favorevoli ad attività desiderabili, quali: a) diminuzione della viscosità dell olio; b) produzione di biosurfattanti; c) produzione di esopolimeri; d) produzione di acidi organici dall olio. Una proposta recentemente presentata dalla Statoil si basa sulla stimolazione dell attività microbica nativa o residente dopo iniezione di acqua di mare mediante ossigenazione dell acqua iniettata. Un approccio diverso prevede infine l ingegnerizzazione di batteri produttori di surfattanti per adattarne le modalità di espressione genica alla fase di recupero dopo iniezione nel reservoir. Qualsiasi metodo di trattamento che si basi sull aggiunta di popolazioni non autoctone deve comunque prevedere le problematiche aggiuntive legate alla sopravvivenza del ceppo batterico iniettato nelle condizioni ambientali del reservoir e nella competizione con le popolazioni residenti, oltre alle limitazioni dei fenomeni di trasporto dei batteri nei mezzi porosi. Dopo alcuni decenni di interventi MER piuttosto empirici e poco controllati è possibile che il potenziamento dei metodi di caratterizzazione delle popolazioni microbiche nell ambiente possa portare a una nuova fase conoscitiva dei fenomeni implicati nei meccanismi di interazione dei sistemi acqua/olio con le popolazioni microbiche del sottosuolo, anche se le difficoltà intrinseche nella gestione di biomasse complesse, poco caratterizzate fisiologicamente e probabilmente diversificate anche all interno dello stesso sito, rimangono comunque notevoli. Upgrading Metanazione in situ La difficoltà di recupero della maggior parte del greggio residente nel giacimento ha stimolato proposte e progetti di tecnologie nuove nello sfruttamento secondario e terziario dei giacimenti. Tra queste un gruppo selezionato di tecnologie, presentate sotto forma di comunicazioni e brevetti, si basa sullo sfruttamento di microrganismi che possono trasformare componenti idrocarburici del petrolio (ma anche di sabbie bituminose, rocce argillose o carbone) in metano. Anderson e Lovley (2000) hanno proposto l esistenza nella biosfera profonda, e in particolare nei giacimenti, di meccanismi di trasformazione di alcani, ma anche di idrocarburi aromatici, in metano a opera di comunità batteriche che comprendano batteri produttori di metano (metanogeni). In generale la coesistenza di batteri fermentativi che possono trasformare gli idrocarburi in molecole più piccole, quali alcoli, acidi, idrogeno, 2, con batteri metanogeni porta alla trasformazione di parte del greggio in metano, con velocità di conversione che sono materia di dibattito (Anderson e Lovley) ma che si stima possano variare da estremamente lente a gestibili su scala di sfruttamento. ome per altri processi biotici, le trasformazioni microbiche sono spesso limitate da basse concentrazioni di nutrienti o da dinamiche di competizione con altri gruppi trofici, per cui rimane la possibilità teorica di manipolare il sistema giacimento e di governarlo su basi razionali allo scopo di favorire la produzione accelerata 290 ENILPEDIA DEGLI IDRARBURI

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