Regolazione dell espressione genica in eucarioti

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1 Regolazione dell espressione genica in eucarioti

2 -Regolazione spaziale e temporale dei geni eucariotici -Regolazione a livello trascrizionale -Regolazione a livello traduzionale

3 Alcuni elementi per la regolazione genica negli eucarioti: Promotori: fattori di trascrizione e repressori Enhancer Stabilita dell RNA Splicing alternativo Risposta ormonale Rimodulazione della cromatina Metilazione del DNA

4 tabilita dell RNA: più è stabile e più cicli di traduzione effettua Assicurata dal CAP5 e dalla polya La lunghezza del polya può determinare la stabilità dell mrna (mrna per gli istoni non hanno il polya ed hanno una breve emivita)

5 La struttura della regione 3 UTR non tradotta influenza la stabilita dell mrna (sequenze AUUUA ripetute nella 3 UTR determinano breve emivita dell mrna) Se si trasferisce la sequenza AUUUA ad un mrna stabile, questo diventa instabile

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7 SPLICING ALTERNATIVO determinazione del sesso in Drosophila: gene Sex-lethal Esone incluso Proteina non funzionale Proteina funzionale per lo Esone rimosso

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10 espressione genica indotta da un ormone è mediata da specifiche sequenze sul DNA, chiamate elementi HRE (elementi di risposta all ormone) Risposta ormonale Ormone steroideo Ormone peptidico

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12 Enhancer: vi si legano fattori di trascrizione speciali, che a loro volta interagiscono con i fattori di trascrizione posti sul promotore e con la RNA polimerasi -agiscono a distanze molto ampie -agiscono in entrambi gli orientamenti -effetti indipendenti dalla posizione (a monte o a valle del gene)

13 L enhancer UAS di lievito Attivazione dei geni del metabolismo del galattosio al10 GAL4, fattore di trascrizione che si lega all enhancer UAS (Upstream activating sequence)

14 Gal4 zincfinger è espressa costituti vamente

15 Struttura Gal4 AD DBD

16 DBD TWO-HYBRID SYSTEM COME DETERMINARE L INTERAZIONE TRA 2 PROTEINE E BASATO SULLA COSTRUZIONE DI 2 TIPI DI IBRIDI: 1-DBD-BYTE 2-AD-PREY BYTE (PROTEINA NOTA) AD PREY (PROTEINA

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18 PROTEINA NOTA PROTEINA INTERAGENTE

19 La cellula in cui c e interazione tra le 2 proteine sopravvive su terreno in cui l aminoacido che viene espresso o esprime il marcatore LacZ

20 Saccaromyces Cerevisiae Attivazione del reporter essenziale x la sopravviven za della cellula

21 L attivazione di un gene richiede cambiamenti nello stato della cromatina per avere accesso al DNA Geni attivi eucromatina Geni inattivi eterocromatina Alcuni attivatori trascrizionali modificano gli istoni acetilandoli Alcuni repressori trascrizionali li deacetilano

22 Una volta stabiliti, i cambiamenti cromatinici possono persistere attraverso le divisioni cellulari, creando uno stato epigenetico Eredita della condizione di inattivazione

23 2 tipi di condizioni in cui si trova un promotore eucariotico Se si legano prima gli istoni al promotore la trascrizione è bloccata; se si legano prima i fattori di trascrizione la trascrizione è attiva Stato inattivo del promotore Stato attivo

24 Transcription factors or nucleosomes may form stable structures that cannot be changed merely by changing the equilibrium with free components. Chromatin remodeling

25 Il complesso SWI/SNF permette il rimodellamento della struttura cromatinica e lo slittamento dei nucleosomi lungo il DNA rendendolo accessibile da parte della RNA polimerasi II e dei fattori di trascrizione

26 I cambiamenti cromatinici possono compromettere la funzionalità del promotore, di un intero gene, o di un intero cromosoma I cambiamenti nella struttura della cromatina iniziano attraverso la modificazione degli istoni, nella coda N-terminale, soprattutto degli istoni H3 e H4.

27 Tipi di modificazione degli istoni

28 Tutti gli istoni possono essere acetilati: l acetilazione è incrementata nei geni trascrizionalmente attivi e la cromatina acetilata è più sensibile alla DNA-asi I

29 L acetilazione è un fenomeno reversibile Enzimi HAT (acetiltransferasi) Enzimi HDAC (deacetiltransferasi)

30 ODULAZIONE DELLA CROMATINA La struttura dei nucleosomi influenza la trascrizione Il dna più trascritto è più facilmente attaccato dalle nucleasi Acetilazione attivazione Acetilazione degli istoni da parte di HAT Apertura della cromatina accessibile alla trascrizione

31 La metilazione è associata ad inattivita trascrizionale La metilazione avviene sugli istoni (lisina 9 dell istone H3) ad opera di metiltransferasi Avviene sul DNA a livello delle isole CpG sia di promotori sia di sequenze geniche codificanti, ad opera di metilasi

32 METILAZIONE DEGLI ISTONI BLOCCO DELLA TRASCRIZIONE AD OPERA DELLE METIL- TRASFERASI (DNMT)

33 L attivazione del promotore richiede il legame di diversi fattori

34 La formazione di eterocromatina on è rigorosamente definita dalla sequenza Quando un gene è trasferito, per traslocazione, trasfezione o integrazione, in una posizione adiacente all eterocromatina, può diventare inattivo, eterocromatinizzandosi Effetto epigenetico o variegazione per effetto da posizione

35 -L inattivazione si diffonde dall eterocromatina alle regioni adiacenti per una distanza variabile -In genere l inattivazione di un gene avviene durante le prime fasi dello sviluppo embrionale e successivamente il gene è ereditato come tale dalle cellule discendenti Fasi dell eterocromatinizzazione: -nucleazione (inizia in sequenze specifiche) -propagazione imprecisa lungo il cromosoma

36 Le proteine leganti la cromatina hanno domini comuni Cromo-domini HP1, hanno come target l eterocromatina Bromo-domini Presente in una varietà di proteine che interagiscono con la cromatina aperta, in particolare con le istone acetilasi e fattori di trascrizione

37 La proteina HP1 H3 deacetilato metilato legato ad HP1

38 Inattivazione del cromosoma X emminile:compensazione da dosaggio Si riattiva durante l oogenesi Inattivazione random di un X, ereditata dalle cellule discendenti Aumenta I 2 X degli l espressione ermafroditi dell X maschile esprimono in cromosomi modo ridotto politenici iperattivi

39 Il cromosoma X Elementi LINE Sequenze Alu ricche di GC Sequenze ripetute invertite e LTR Ricco di geni sesso-specifici, come geni espressi nel muscolo, nel cervello, e geni della prima spermatogenesi

40 Inattivazione dell X nei mammiferi -Il centro dell inattivazione di uno dei 2 cromosomi X è il locus XIC o centro dell inattivazione dell X -Se questo locus viene inserito in un autosoma, questo viene inattivato -Xic è un locus cis-agente da cui parte l eterocromatinizzazione che si estende su tutto il cromosoma in entrambe le direzioni -Di tutto il cromosoma X inattivo c è il gene Xist (X inactive specific transcript) che è attivo solo nel cromosoma inattivo

41 -Xist codifica un trascritto privo di schemi di lettura, quindi un RNA che non produce proteina (ncrna) -L Rna di Xist si trova solo sul cromosoma inattivo -Studi condotti sulle cellule di topo, hanno dimostrato che Xist e prodotto precocemente da entrambi i cromosomi, ma essendo l RNA molto instabile, viene facilmente degradato,e solo sul cromosoma in cui viene stabilizzato, va a ricoprire il cromosoma poi inattivato -Il cromosoma inattivo e visibile durante l interfase come corpuscolo scuro associato alla membrana nucleare, detto Corpo di Barr - Il cromosoma X inattivo si replica piu lentamente degli altri a causa della sua cromatina molto condensata, ricca di istoni H3 e H4 ipoacetilati

42 l locus XIST da solo non basta, ma servono elementi ch percepiscono il numero dei cromosomi X e della scelta del cromosoma da inattivare L elemento della conta sembra essere ocalizzato a valle di Xist (3 ) L elemento della scelta sembra risiedere nel locus XIC E veramente random la scelta dell X da inattivare? embra che nei marsupiali e nei tessuti extraembrional di topo l inattivazione dell X e imprinted (o paterno o materno), Importante un elemento a valle di Xist, che modifica il rapporto 50:50 dell inattivazione

43 Geni che sfuggono all inattivazione dell X Sono geni che hanno dei loro omologhi nel cromosoma Y Il loro escape dipende dalla sequenza genica e non dalla loro posizione I geni che sfuggono all inattivazione dell X hanno una regione 5 meno ricca di CpG I geni attivi nell X inattivo sono circondati da INSULATORS

44 Insulator Sequenza di DNA agente in cis, che previene il passaggio di effetti attivanti o inattivanti

45 Le isole CpG -Lo 0.7% del genoma umano contiene doppietti CpG -Il 2-7% delle citosine del DNA dei mammiferi sono metilate -La maggior parte dei gruppi metile si trovano nelle isole CpG - La metilazione avviene ad opera di Metilasi e demetilasi del DNA

46 La metilazione ha vari tipi di targets CpG di promotori, che sono metilati quando il gene e inattivo o demetilati nel gene attivo CpG di DNA satellite, che, metilato, stabilizza il DNA centromerico

47 Le metilazioni del DNA sono responsabili di: -IMPRINTING -patologie -espressione tessuto-specifica -Differenziamento cellulare -Vecchiaia -Carcinogenesi (ipometilazione di promotori di oncogeni o ipermetilazione di promotori di oncosoppressori riprogrammazione dello stato cromatinico) -Inattivazione dell X

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49 IMPRINTING Alleli materni o paterni sono ereditati metilati o no differente comportamento tra gli alleli ereditati da ogni genitore Se l allele paterno attivo porta una mutazione l embrione presenta il fenotipo malato Se l embrione e femmina il gene viene metilato nei gameti durante la gametogenesi Se l embrione e maschio il gene materno deve essere demetilato

50 L IMPRINTING e regolato dallo stato di metilazione di una sequenza cis-agente vicina al gene, chiamata DMD o ICR (imprinting control region); la sua delezione rimuove l imprinting Geni con opposto imprinting regolati dallo stesso ICR, che funziona da insulator

51 IL REPRESSORE Kox1 che porta il dominio KRAB Proteine che contengono domini zinc-finger e Domini di repressione trascrizionale Kruppel-associated boxes Domini di legame al DNA

52 Domini di repressione trascrizionale attivi sulle RNA polimerasi I,II e II Come funziona la repressione trascrizionale operata da Krab? Condensazione reversibile della cromatina

53 Sistemi ibridi TetR-KRAB per accendere e spegnere l espressione genica eucariotica Repressore TetR che blocca l espressione dell operone Tet La tetraciclina stacca il repressore da TetO e attiva l operone TetO TetA TetR Proteina di efflusso della tetraciclina Proteina repressore

54 Proteina di fusione KRAB-TetR Geni eucariotici inducibili e reprimibili basati sul repressore procariotico TetR-TetO Repressore KRAB KRAB ttr Repressore della tetraciclina tetr

55 QUALI SONO LE MUTAZIONI GENICHE RILEVANTI NELLO SVILUPPO E MANTENIMENTO DEL TUMORE? STUDIO DELLA GENESI DEL MELANOMA DIPENDENTE DALL ESPRESSIONE DI H-Ras V12G IN TOPI INK4a -/-, QUINDI PRIVI DELL ATTIVITA DI SOPPRESSIONE DEL TUMORE

56 ANIMALE TRANSGENICO tutte le cellule nucleate contengono il transgene MICROINIEZIONE NEI PRONUCLEI

57 ANIMALI CHIMERICI e le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI

58 a b Progenie con cellule germinali portatrici del transgene Eredita mendeliana del transgene Cellule germinali aploidi

59 KRA B ttr TetO P RasV12G RISOMMINISTRAZIONE DI DOXICICLINA

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