CAPITOLO I INTRODUZIONE

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1 PREMESSA Ad oggi, le ragioni dell importanza dalla caratterizzazione immunofenotipica nel contesto delle patologie onco-ematologiche, risiedono principalmente nel ruolo sempre crescente che essa svolge non solo nella diagnosi e classificazione delle emopatie ma soprattutto nella identificazione, al loro interno, di sottogruppi caratterizzati da prognosi e risposta alla terapia differenti, con la possibilità di individuare importanti bersagli biologici, targets di approcci terapeutici sempre più personalizzati (target therapy). In particolare, la valutazione fenotipica dell espressione di particolari antigeni sulla superficie cellulare, unitamente alla quantizzazione ed allo studio della modulazione della loro intensità di espressione, oltre che permettere la definizione di fasi distinte del processo differenziativo cellulare, sottolinea l importanza dell indagine citofluorimetrica nella identificazione di caratteristiche fenotipiche specifiche che potrebbero indirizzare verso trattamenti che prevedano, ad esempio, l utilizzo di specifici anticorpi monoclonali, ormai divenuti di largo impiego nella pratica clinica. Accanto a ciò, lo studio immunofenotipico in ambito ematologico permette di identificare la presenza di proteine con ormai riconosciuto valore prognostico e che rappresentano dei veri e propri parametri biologici sulla base dei quali è possibile effettuare una scelta terapeutica specifica per ciascun paziente. Un esempio è rappresentato dalla possibilità, mediante saggio citofluorimetrico, di determinare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl in lisati di campioni di leucemia acuta, o dalla possibilità di valutare, mediante metodiche di immunocitochimica, un accumulo aberrante della proteina p53 in campioni di pazienti affetti da leucemia linfatica cronica. Ultimo, ma non meno importante aspetto da considerare, è il ruolo che un ampia e dettagliata caratterizzazione fenotipica in fase diagnostica ricopre nelle fasi di valutazione della malattia minima residua permettendo un accurato monitoraggio dei pazienti affetti da patologie ematologiche mediante metodiche citofluorimetriche. 1

2 CAPITOLO I INTRODUZIONE La Leucemia Acuta Linfoblastica La Leucemia Acuta Linfoblastica (LAL) rappresenta un eterogeneo gruppo di disordini neoplastici dei tessuti linfoidi caratterizzati da una proliferazione monoclonale ed auto mantenuta e da una espansione di cellule linfoidi immature in seguito ad alterata regolazione dei processi di differenziamento, proliferazione e/o sopravvivenza cellulare (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005; Stavropoulou V et al, Swiss Med Wkly 2010). Le LAL costituiscono la neoplasia più frequente in età pediatrica rappresentando circa l 80% delle leucemie acute del bambino con un picco di prevalenza tra i 2 ed i 5 anni di età (Pui CH et al, Lancet 2008). Esse risultano invece meno frequenti nell adulto, con una frequenza complessiva del 20% (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005) e la tendenza ad un successivo incremento intorno ai 50 anni di età (Faderl S et al, Cancer 2010). E nota inoltre una modesta predominanza nel sesso maschile, con un rapporto uomo/donna di circa 2/1. Nella maggior parte dei casi, gli specifici eventi patogenetici che sottendono allo sviluppo di tale forma leucemica restano sconosciuti. E stata però ipotizzata la possibilità che le LAL possano svilupparsi in seguito ad una combinazione di cause ambientali, della presenza di una suscettibilità genetica e dell azione di specifici oncogeni tumorali. Tra le cause ambientali le esposizioni ad elevate dosi di radiazioni ionizzanti, così come a particolari sostanze nell ambito di contesti sociali di maggiore sviluppo ed urbanizzazione, sono ormai riconosciuti come effettivi fattori di rischio nello sviluppo di tale patologia. L associazione tra le LAL e la presenza di alcune delle principali anomalie genetiche deriva dalla constatazione di una incidenza maggiore di leucemia acuta nei pazienti con sindrome di Down o di Klinefelter. Analogamente, l aumentata incidenza di LAL nei bambini con sindrome di Fanconi o di Bloom, oppure nei casi con immunodeficienze primarie come la sindrome di Wiskott-Aldrich o l atassia-teleangectasia, potrebbe rappresentare un sostegno all ipotesi dell influenza della suscettibilità genetica nell eziologia di questa forma leucemica (Pui CH et al, Lancet 2008). Inoltre, l idea che l ereditarietà genetica possa svolgere un ruolo importante nel processo di leucemogenesi, deriva dalle dimostrazioni relative alla comparsa di forme leucemiche in fratelli il cui gemello monocoriale avesse precedentemente sviluppato una leucemia. La più plausibile interpretazione di 2

3 tale constatazione potrebbe essere un passaggio di cellule appartenenti al clone leucemico, dal feto in cui inizia il processo neoplastico all altro tramite vascolatura placentare. A ciò si associa anche l ipotesi che le LAL possano svilupparsi direttamente nell utero materno, considerata la dimostrazione della presenza di specifici riarrangiamenti clonali dei geni del T-cell receptor (TCR), delle immunoglobuline (Ig), o della sequenza di un gene di fusione leucemico, nel sangue prelevato alla nascita in bambini che hanno in seguito sviluppato leucemia (Taub JW et al, Blood 2002). Pertanto, quando uno o più dei fattori precedentemente riferiti provocano un alterazione nell ordinato processo di maturazione della cellula linfoide in senso neoplastico, i linfoblasti perdono la capacità di dare origine a cellule normalmente maturanti. Essi sono in grado di espandersi accumulando una serie di anomalie genetiche e di sostituire via via il midollo osseo raggiungendo successivamente il sangue periferico, infiltrando organi e tessuti linfoidi e non (linfonodi, fegato, sistema nervoso centrale, testicoli, ossa) e dando luogo alla comparsa della leucemia. In particolare, si ritiene che le LAL traggano origine dalle molteplici ed importanti alterazioni genetiche che si verificano a livello dei progenitori emopoietici già commissionati a differenziare in cellule di linea B o T, incluse le mutazioni che conferiscono capacità di un illimitato self-renewal e quelle che determinano un arresto in una fase specifica del processo maturativo linfoide (Armstrong SA and Look AT, J Clin Oncol 2005; Pui CH et al, Lancet 2008). Le cellule implicate nel processo leucemico mostrano come principale caratteristica la presenza di riarrangiamenti clonali nei geni delle Ig o del TCR. Inoltre, nel corso degli ultimi decenni sono aumentate le evidenze che indicano come difetti cromosomici ed anomalie molecolari siano consistentemente presenti nei pazienti affetti da LAL con conseguente perdita del controllo esercitato da geni oncosoppressori ed attivazione di oncogeni o di specifiche proteine di fusione con potenziale attività trascrizionale (Armstrong SA and Look AT, J Clin Oncol 2005; Pui CH et al, Lancet 2008). La caratterizzazione di tali anomalie cromosomiche ricorrenti ha permesso l'identificazione dei relativi geni implicati nel processo di leucemogenesi (Rowley JD, Annu Rev Genet 1998; Greaves MF and Wiemels J, Nature Rev Cancer 2003). In questo contesto, l'utilizzo di metodiche di analisi di espressione genica permette oggi di delineare patterns di espressione specifici per le singole aberrazioni cromosomiche tali da sostenere l idea che una traslocazione cromosomica identifichi un unico e specifico sottotipo leucemico (Haferlach T et al, Semin Hematol 2003; Chiaretti S et al, Clin Cancer Res 2005). Sebbene tali lesioni genetiche sembrerebbero necessarie per scatenare un evento leucemico, nella maggior parte dei casi, esse non risultano da sole sufficienti a generare un fenotipo leucemico completo. Diverse evidenze suggeriscono la necessità del manifestarsi di lesioni genetiche cooperanti a livello di differenti geni e quindi l intervento di eventi patogenetici aggiuntivi 3

4 (Mullighan CG et al, Nature 2007). In proposito, oggi la ricerca nell ambito della patogenesi delle LAL si dirige sempre più verso identificazione di nuove alterazioni genetiche e verso la comprensione degli effetti che esse svolgerebbero sulla proliferazione cellulare, sul differenziamento e sulla sopravvivenza alla luce del fatto che tali lesioni ed i loro prodotti proteici potrebbero costituire potenziali bersagli per lo sviluppo di strategie terapeutiche tese a colpire specificamente la cellula tumorale trasformata. In aggiunta a quanto detto, è sempre più evidente il ruolo dei cambiamenti epigenetici nello sviluppo e mantenimento di uno stato leucemico. Essi includono sia modificazioni biochimiche reversibili a livello della cromatina del DNA, quali ad esempio i processi di metilazione, che modificazioni della cromatina istonica che senza alterare la sequenza primaria del DNA sono in grado influenzare l espressione genica. Le modificazioni a livello degli istoni sono inoltre responsabili del controllo dell attività trascrizionale attraverso il ruolo esercitato sui micro RNAs (mirnas) i quali a loro volta tramite meccanismi posttrascrizionali possono regolare negativamente un serie di geni target e svolgere così un ruolo chiave nella patogenesi delle leucemie acute (Yendamuri S and Calin GA, Leukemia 2009; Stavropoulou V et al, Swiss Med Wkly 2010). Il quadro clinico delle LAL non depone a favore di sintomi o segni clinici specifici della malattia. Spesso i sintomi, diversi da paziente a paziente, sono ad insorgenza improvvisa e complessivamente simili tra pazienti adulti e pediatrici. Generalmente, viene riferita una breve storia di astenia, febbre, sudorazione notturna, calo ponderale e talvolta dolori ossei e manifestazioni emorragiche. Essi rappresentano la diretta conseguenza della proliferazione delle cellule leucemiche nel midollo osseo e nel sangue venoso periferico nonché della possibile compromissione da parte delle stesse cellule leucemiche di altri organi e sistemi quali fegato, milza, linfonodi, mediastino e sistema nervoso centrale (SNC). Le infezioni ricorrenti o prolungate a causa della neutropenia, così come la comparsa di manifestazioni emorragiche diverse dovute alla carenza piastrinica, sono diretta espressione dell insufficienza midollare. Possono essere presenti sintomi come nausea, cefalea o vomito come segno di compromissione del SNC. L esame emocromocitometrico può evidenziare situazioni di anemia, leucopenia o leucocitosi e piastrinopenia, che non risultando però specifiche di tale leucemia, in quanto comuni ad altre patologie di natura ematologica, necessitano di una attenta osservazione microscopica di uno striscio di sangue venoso periferico allo scopo di mettere in evidenza la presenza di blasti. Ad ogni modo, qualora il quadro clinico e l emocromo depongano per un sospetto di una leucemia acuta, è d obbligo effettuare un agoaspirato midollare per l esecuzione della maggior parte delle indagini di laboratorio ed un corretto inquadramento diagnostico-prognostico del caso. Considerato il rapido decorso e l evoluzione clinica di questa forma di leucemia acuta, l attenta caratterizzazione biologica del clone leucemico risulta 4

5 estremamente importante non solo per il corretto inquadramento diagnostico ma soprattutto per l identificazione nell ambito delle LAL di sottogruppi prognostici differenti che potrebbero potenzialmente beneficiare di trattamenti terapeutici specifici. Infatti, alla luce dei progressi ottenuti nel corso degli anni che hanno consentito importanti scoperte in ambito biologico e terapeutico, assistiamo oggi ad un continuo miglioramento dell outcome dei pazienti affetti da LAL con percentuali di sopravvivenza libera da eventi (Event Free Survival, EFS) che nonostante i valori ancora non ottimali nell ambito dei pazienti adulti (circa 40%), raggiungono però percentuali pari alll 80% nei bambini di età compresa tra 1 e 10 anni (Rowe JM et al, Blood 2005). 5

6 Diagnosi Ad oggi, i progressi tecnologici e scientifici raggiunti, rendono imprescindibile una corretta classificazione diagnostica dei pazienti affetti da LAL sulla base delle differenti caratteristiche biologiche. L importanza di un corretto inquadramento diagnostico, è però attribuibile non solo alla possibilità di classificare un eterogeneo complesso di disordini quali possono essere le LAL, ma soprattutto di stratificare al loro interno i pazienti in differenti categorie di rischio che possano beneficiare di trattamenti terapeutici specifici. La diagnostica delle leucemie acute è andata incontro ad un sostanziale cambiamento fin dal 1970 quando citomorfologia e citochimica rappresentavano gli unici mezzi disponibili per effettuare una corretta diagnosi. Da allora, l avanzamento delle tecniche diagnostiche, unitamente alla continua integrazione dei risultati da esse ottenuti, ha consentito una differente visione delle leucemie acute, oggi concepite come eterogeneo complesso di entità citogenetiche e molecolari, risultato di differenti meccanismi di leucemogenesi (Haferlach T et al, Ann Hematol 2007). Dunque, accanto ai primitivi approcci morfologici e citochimici, l analisi citofluorimetrica nelle LAL ha permesso una loro attenta caratterizzazione fenotipica con la possibilità di distinguere il lineage cellulare differenziandone all interno i diversi stadi maturativi della cellula linfoide. Inoltre, le tecniche di bandeggio cromosomico, insieme all analisi FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) hanno fornito informazioni riguardo la presenza di alterazioni genetiche microscopiche e submicroscopiche. Accanto a ciò, la disponibilità di metodiche di biologia molecolare e sequenziamento genico, oltre a dare conferma dei risultati ottenuti dalle analisi citogenetiche ha permesso una più precisa identificazione dei punti di rottura ed un analisi mutazionale di specifici geni consentendo così ulteriori sub-classificazioni con importante valore prognostico. Infine, l utilizzo di tecniche di genome-wide single-nucleotide polymorphism (SNP)-arrays consentono l identificazione di alterazioni genetiche strutturali a livello di specifici geni con ruolo cruciale in importanti pathways cellulari (Mullighan CG and Downing JR, Leukemia 2009). 6

7 Valutazione citomorfologica Il primo step nell iter diagnostico di una LAL è rappresentato dall osservazione al microscopio ottico di strisci di sangue venoso periferico e/o di sangue midollare preparati utilizzando la metodica di colorazione di May-Grunwald-Giemsa. I principali criteri morfologici a cui si fa riferimento nell analisi dei campioni, sono raccomandati dalla classificazione proposta dal French-American-British (FAB) cooperative group secondo la quale una LAL - distinta nelle tre varianti morfologiche L1, L2 ed L3 - si caratterizza per la presenza a livello midollare di elementi immaturi della serie linfoide in una quota uguale o superiore al 30% (Bennet JM et al, Br J Hematol 1976). Poco piùdi un ventennio dopo, l introduzione della classificazione WHO (World Health Organization) sulla base della presenza a livello midollare di una quota di blasti superiore o uguale al 20%, e di un insieme di caratteristiche morfologiche, fenotipiche, citogenetiche e cliniche ha consentito una sempre migliore definizione, soprattutto prognostica, di tale entità patologica (Harris NL et al, J Clin Oncol 1999). In questo contesto, la suddivisione morfologica tra le forme L1 ed L2 non viene quasi più utilizzata, poiché essa non sembra associarsi ad un particolare fenotipico leucemico, nè alla presenza di alterazioni citogenetiche o ad un particolare andamento clinico, senza quindi rivestire alcun significato prognostico. Fanno eccezione le forme di LAL L3 che restano classificate come entità distinte per la presenza di caratteristiche clinico-biologiche ben definite e distinguibili, con una prognosi specifica e la possibilità di beneficiare di trattamenti terapeutici mirati. Riguardo la valutazione citochimica, per la LAL non esiste in realtà un test specifico; tuttavia, per definizione, la cellula leucemica linfoide risulta essere negativa al test per la mieloperossidasi (MPO), che caratterizza invece la maggior parte delle cellule di derivazione mieloide. Le altre reazioni citochimiche, come la colorazione con l acido periodico di Schiff (PAS) o il test per l esterasi non-specifica, possono essere positive in alcuni sottogruppi di LAL, ma non risultano specifiche di tale patologia essendo esse presenti anche in casi di leucemia acuta mieloide (LAM). 7

8 Caratterizzazione immunofenotipica Accanto alle sempre più innovative valutazioni genetico-molecolari ed alla più comune caratterizzazione citomorfologica, lo studio dell immunofenotipo riveste un ruolo estremamente importante nel percorso diagnostico delle LAL. La tipizzazione immunofenotipica mediante citofluorimetria si basa sul riconoscimento di un fenotipo dominante a livello della popolazione leucemica mediante anticorpi monoclonali (AcMo) direttamente coniugati a fluorocromi che, grazie all introduzione di citofluorimetri in grado di analizzare otto o più parametri contemporaneamente, consentono oggi una analisi dettagliata e simultanea della espressione di differenti antigeni. La valutazione della presenza di antigeni di superficie e citoplasmatici rende possibile la caratterizzazione della linea di appartenenza delle cellule presenti nel campione in esame permettendo la distinzione delle forme a fenotipo B che rappresentano la maggioranza delle LAL (75-80% dei casi adulti, 85-90% dei casi pediatrici), da quelle a fenotipo T caratterizzate da una minore frequenza (20-25% negli adulti, 10-15% nei casi pediatrici). Inoltre, in merito al processo differenziativo, sia i precursori linfoidi di linea B che quelli di linea T seguono un percorso maturativo che dalla cellula staminale ematopoietica termina a livello dei linfociti B e T maturi, attraversando stadi diversi distinguibili sulla base della presenza o meno di particolari marcatori e della loro intensità di espressione, consentendo così una precisa definizione immunologica delle LAL (Bene MC et al, Leukemia 1995; Bene MC, Immunol Lett 2005). Tale classificazione descritta dall EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias) (Bene MC et al, Leukemia 1995) basandosi sulla presenza o meno di specifici antigeni di differenziazione, di superficie ed intracitoplasmatici, ha permesso di suddividere sia le LAL di linea B che quelle di linea T in differenti sottogruppi. Le LAL di linea B, definite come tali per la presenza di almeno due degli antigeni di linea quali il CD79a, espresso a livello citoplasmatico, il CD19 ed il CD22 espressi in superficie, possono distinguersi in quattro differenti sottogruppi (Tabella 1). Analogamente, le LAL-T, caratterizzate dalla presenza dell antigene CD3 a livello citoplasmatico ed in una minore percentuale di casi anche in superficie, unitamente all espressione dell antigene CD7, possono distinguersi in quattro diversi sottotipi leucemici (Tabella 1). Con riguardo alle LAL T, un recente studio condotto su 239 pazienti arruolati al St Jude Children s Research Hospital e nel protocollo italiano AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) ha permesso di identificare un quinto sottogruppo caratterizzato dalle Early T-cell Precursors (ETPs) leukemias, che con caratteristiche biologiche peculiari risulta associato ad un elevato rischio di recidiva dopo trattamenti chemioterapici intensivi (Coustan-Smith E et al, Lancet Oncol 2009). Questo studio ha evidenziato, mediante analisi di gene expression profile, un ben preciso pattern di espressione 8

9 genica oltre ad un incrementato numero di lesioni genomiche rispetto alle altre LAL-T come a denotare una elevata instabilità genetica nei pazienti che mostrano tale fenotipo leucemico. Esso risulta caratterizzato dall assenza degli antigeni CD1a e CD8, da una debole espressione del CD5 e dall espressione di uno o più antigeni caratteristici della linea mieloide e/o della cellula staminale ematopoietica (CD117, CD34, CD13, CD33, CD11b, HLA-DR o CD65). Sebbene le attuali potenzialità della caratterizzazione immunofenotipica permettano quindi una accurata distinzione delle LAL di linea B da quelle di linea T con al loro interno una attenta suddivisione immunologica, rimane tuttavia una piccola percentuale di casi in cui non è facile stabilire una diagnosi a causa della concomitante espressione sulla stessa popolazione leucemica (leucemia acuta bi-fenotipica) o su popolazioni differenti (leucemia acuta bi-clonale) di antigeni linfoidi e mieloidi. L EGIL ha suggerito in questi casi, l utilizzo di un sistema di score, basato sull assegnazione di un preciso punteggio in base alla presenza di antigeni di linea B, T o mieloidi e sulle loro associazioni (Bene MC et al, Leukemia 1995). Restano comunque esclusi i casi che non mostrano alcun marker di linea e che secondo tale classificazione vengono definiti come Acute Undifferentiated Leukemias (AUL). Infine, una revisione della classificazione WHO fatta nel 2008 (Vardiman JW et al, Blood 2009) ha rivisitato i requisiti necessari per la diagnosi e classificazione delle leucemie di difficile assegnazione di linea. Quelle forme leucemiche in precedenza designate come bi-fenotipiche e bi-clonali sono state globalmente considerate come Mixed Phenotype Acute Leukemias (MPAL) di tipo B/mieloide o T/mieloide a seconda delle popolazioni coinvolte nel processo leucemico. Non è però ancora ben definito il significato clinico ed il trattamento necessario per tali entità leucemiche. L importanza dello studio fenotipico delle popolazioni leucemiche risiede anche nella possibilità di mettere in evidenza attraverso di esso espressioni antigeniche aberranti (presenza di antigeni appartenenti alla linea mieloide o di natura non ematologica) o asincrone (concomitante presenza di marcatori linfoidi della cellula matura con quelli tipici della cellula immatura) a livello della popolazione in esame che, oltre a definire importanti LAIPs (leukemia associted immunophenotypes) imprescindibili per il monitoraggio dei pazienti durante il follow-up, potrebbero, in alcuni casi, essere indicativi della presenza di una specifica lesione genetica. Il significato prognostico della positività per antigeni definiti aberranti nelle LAL, in quanto tipicamente mieloidi, quali CD13 e/o CD33, risulta essere estremamente controverso. Sebbene, in uno studio condotto dal nostro gruppo (Vitale A et al Haematologica 2007) tale positività non sembrerebbe rappresentare un fattore prognostico sfavorevole anche perché non associata alla presenza di alcuna anomalia citogenetica, studi precedenti avevano dimostrato una correlazione tra l espressione di tali antigeni - unitamente ad un eterogenea espressione del CD38 - e la presenza del 9

10 gene di fusione BCR/ABL (Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Inoltre, l evidenziata reattività di cellule ottenute da pazienti che presentavano il gene di fusione BCR/ABL con espressione della proteina p190, all anticorpo monoclonale KOR-SA3544 (o CD66-c) dimostrava una associazione di tale antigene (la cui presenza è aberrante nelle LAL in quanto sempre negativo nelle normali cellule linfoidi) con la suddetta alterazione cromosomica (Mori T et al, Leukemia 1995). Ad ogni modo, è evidente come la presenza di un fenotipo peculiare, che nell ambito delle LAL-B presenti una positività agli antigeni CD13 e/o CD33, una eterogenea espressione o assenza dell antigene panleucocitario CD38 insieme alla presenza dell antigene CD66c, possa solo rappresentare una ipotesi rispetto alla sua associazione con la traslocazione cromosomica t(9;22). Infatti, da un analisi effettuata nel nostro istituto, su 46 casi affetti da LAL-B con t(9;22), si evidenziava come il 21% di essi pur non mostrando un fenotipo predittivo presentava tale anomalia cromosomica (dati non pubblicati). Discorso analogo se si considera la presenza di altri antigeni mieloidi aberranti quali il CD15 ed il CD33 in associazione all ectopica presenza dell NG2 (antigene di natura non emopoietica), all assenza dell antigene CD10 e degli antigeni mieloidi CD13 e CD33, unitamente ad una frequente bi-modalità nell espressione del CD34. Tale fenotipo infatti, è stato più volte dimostrato come associato alla presenza del gene di fusione MLL1/AF4 sebbene in alcuni casi sia stato riscontrato anche in una piccola percentuale di casi caratterizzati da altri riarrangiamenti di MLL (De Zen L et al, Leukemia 2003; Schwartz S et al, Leukemia 2003). Entrambi i patterns fenotipici descritti, oltre ad evidenziare il ruolo predittivo, anche se non specifico, che lo studio fenotipico può svolgere nella identificazione genetico-molecolare di alcune peculiari aberrazioni cromosomiche, costituiscono firme immunofenotipiche specifiche di ciascun paziente che conferiscono a tale metodica il ruolo di potente strumento nel contesto del monitoraggio della quota di malattia minima residua dopo trattamento terapeutico. Ultimo ma non meno importante aspetto da considerare, nell ambito della caratterizzazione immunofenotipica delle LAL è sicuramente la possibilità di definire le modalità con cui un antigene risulta espresso a livello cellulare, spesso rappresentative dello stadio maturativo e del momento funzionale della cellula (Raponi S et al, Leuk Lymphoma 2011). L intensità di fluorescenza emessa dall anticorpo monoclonale in seguito al riconoscimento antigenico consente infatti una distinzione della cellula leucemica dalla sua controparte normale, oltre a risultare ancora una volta di grande aiuto nella quantizzazione della quota patologica residua dopo terapia. Tale intensità di espressione può essere valutata sia attraverso la MFI (Mean Fluorescence Intensity), che rappresenta la media delle intensità delle fluorescenze per un dato antigene, sia calcolando la misura precisa del numero dei siti antigenici presenti sulla superficie cellulare attraverso l ABC (Antibody Binding Capacity) ovvero la capacità di legame media di una popolazione cellulare per un dato anticorpo monoclonale. 10

11 Tutto ciò risulta estremamente importante anche e soprattutto alla luce della dimostrata efficacia di terapie innovative che sulla base dell intensità di espressione antigenica utilizzano specifici AcMo in associazione a chemioterapici convenzionali consentendo così l ottenimento di sempre maggiori percentuali di remissione completa di malattia (Coleman M et al, Clin Cancer Res 2003; Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004) e migliorando quindi l outcome dei pazienti affetti da LAL. 11

12 Caratterizzazione genetico-molecolare L utilizzo delle metodiche di analisi citogenetica classica e successivamente molecolare, hanno fornito un importante contributo nell identificazione, nell ambito delle LAL, di un ulteriore livello di eterogeneità attraverso l identificazione di riarrangiamenti cromosomici, alcuni dei quali con importante valore prognostico e quindi di particolare rilievo per l utilizzo di specifiche strategie terapeutiche (Mancini M et al, Blood 2005; Moorman AV et al, Blood 2007; Pullarkat V et al, Blood 2008). Le analisi di citogenetica convenzionale consentono l identificazione delle aberrazioni del cariotipo solo in una parte dei pazienti affetti da LAL a causa del basso indice mitotico del blasto leucemico e della scarsa qualità delle metafasi associate a tale patologia. L introduzione di nuove tecnologie, sviluppate su base molecolare, consente oggi di identificare la presenza di anomalie cariotipiche, altrimenti non individuabili, con maggiore accuratezza ed incremento della risoluzione (Speicher MR and Carter NP, Nat Rev Genet 2005). Si tratta di metodologie che vanno dalla FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), alle tecniche SKY/M- FISH (Spectral Kayotyping/Multicolor-FISH), alla CGH (Comparative Genomic Hybridization.). Le alterazioni citogenetiche possono essere di struttura, di numero o in alcuni casi nello stesso paziente possono presentarsi entrambe le tipologie. Le anomalie cromosomiche strutturali risultano le più rappresentate e tra queste le traslocazioni sono le più frequenti. Queste ultime causando un cambiamento di posizione di materiale cromosomico e delle sequenze geniche in esso contenute mostrano come effetto finale la trasformazione di un proto-oncogene in oncogene attraverso due meccanismi. Il primo - dovuto alla giustapposizione del proto-oncogene a sequenze regolatorie di geni ad elevata attività di sintesi quale i promoters dei geni codificanti per le Ig o per il TCR - determina una alterazione quantitativa con conseguente incremento dell espressione dell oncogene. Un classico esempio di questo meccanismo è rappresentato dal riarrangiamento del gene c-myc con il gene della IgH nella t(8;14) che caratterizza le LAL a morfologia L3. Il secondo meccanismo determina, invece, una alterazione qualitativa delle sequenze proto-oncogeniche dovuta alla giustapposizione delle regioni codificanti di due geni diversi con conseguente formazione di una nuova sequenza genica assente nelle cellule normali. Si forma così un gene ibrido, che codificherà una proteina chimerica con alterata attività trascrizionale. Tali lesioni genetiche dalle quali deriva la formazione di specifici geni e delle rispettive proteine di fusione ricorrono nelle LAL con una frequenza che va dal 30 al 50% (Gabert J et al, Leukemia 2003). 12

13 Focalizzando l attenzione sulle LAL-B, una delle più comuni anomalie cromosomiche è rappresentata dalla traslocazione reciproca e bilanciata tra il cromosoma 9 ed il 22 (t[9;22][q34;q11]). Tale traslocazione determina una giustapposizione dei loci BCR (Breakpoint Cluster Region) ed ABL (Abelson kinase gene) con la formazione di un gene di fusione BCR/ABL in grado di codificare differenti tipologie di proteine di fusione con deregolata attività tirosinchinasica (Deininger MWN et al, Blood 2000). La presenza del trascritto BCR/ABL si osserva nel 25-30% degli adulti dove è dimostrato un incremento con il progredire dell età (più del 50% dei casi con età maggiore dei 60 anni), mentre risulta raro nei bambini con una frequenza del 2-5% (Burmesteir T et al, Blood 2008; Szczepanski T et al, Lancet Oncol 2010). Altra traslocazione, presente con uguale frequenza nelle diverse fasce di età coinvolge il gene E2A sul cromosoma 19 ed il gene PBX1 sul cromosoma 1. Tale traslocazione t(1;19)(q23;p13), presente complessivamente nel 3-5% delle LAL, determina la formazione del gene di fusione E2A/PBX1 e della rispettiva proteina con attività aberrante e particolare effetto sui processi differenziativi (Hunger SP et al, Blood 1991). Il valore prognostico di tale alterazione nell adulto è controverso. E stato inizialmente identificato come associato ad una prognosi sfavorevole ma, almeno nei bambini, quando trattati con regimi chemioterapici intensivi, sembrerebbe comportarsi come le principali anomalie citogenetiche associate ad una prognosi favorevole (Pui CH et al, N Engl J Med 2004). Particolarmente importanti, soprattutto per il loro valore prognostico, risultano i riarrangiamenti che coinvolgono il gene MLL generalmente associati con maggiore frequenza alle LAL degli infants (Biondi A et al, Blood 2000), con un immunofenotipo pro-b, organomegalia, iperleucocitosi e coinvolgimento del SNC. La traslocazione t(4;11)(q21;q23) con formazione del gene di fusione MLL/AF4 rappresenta il più frequente riarrangiamento in questo ambito. Esso si associa ad una prognosi sfavorevole sia nei bambini, dove raggiunge una frequenza del 50% nei casi con età inferiore ad un anno, che negli adulti. Altra traslocazione cromosomica importante nell ambito delle LAL-B per il ruolo prognostico che essa riveste è la t(12;21)(p13;q22) che porta alla formazione del gene di fusione TEL/AML1 (ETV6-RUNX1). Con una frequenza del 20-30% nei bambini e meno del 5% negli adulti, fornisce una possibile spiegazione in merito alle maggiori percentuali di sopravvivenza descritte nelle casistiche pediatriche rispetto a quanto si verifica nell adulto (Zalent A et al, Oncogene 2004). Tra le anormalità genetiche riscontrabili in corso di LAL-B non si può certamente tralasciare il ruolo svolto dalle mutazioni dei geni JAK1, JAK2 e JAK3 (Mullighan CG et al, Proc Natl Acad Sci USA 2009) la cui identificazione è diventata di rilevante importanza vista la disponibilità di inibitori del gene JAK2. Inoltre, recenti lavori (Mullighan CG et al, N Engl J Med 2009) hanno descritto sul cromosoma 7 a livello della regione p12 la delezione di IKZF1, che codifica il fattore 13

14 di trascrizione IKAROS, in molti dei casi positivi per la presenza di BCR/ABL, suggerendo una associazione tra queste due alterazioni genetiche che provocherebbe un arresto nella maturazione delle cellule linfoidi B inducendo la comparsa della leucemia, oltre ad identificare nell ambito delle LAL Ph+, un sottogruppo di pazienti con una prognosi ancor più sfavorevole (Martinelli G et al, J Clin Oncol 2009). Le anomalie cromosomiche risultano, al contrario, meno frequenti nell ambito delle LAL-T. La più comune è rappresentata dalla formazione del gene di fusione SIL/TAL1 derivante da una delezione submicroscopica a livello della regione 1p32, presente nel 5-10% degli adulti e nel 10-20% dei bambini. Inoltre, una over-espressione di TAL1 è stata riscontrata in circa il 40% delle LAL-T con conseguente alterazione dei meccanismi di differenziamento e proliferazione cellulare. Altra traslocazione cromosomica presente in circa il 10% delle LAL-T è la t(10;11)(p13;q23), che risulta nella formazione del gene CALM/AF10 che identifica un sottogruppo di pazienti con uno specifico profilo di espressione genica. Un coinvolgimento del gene ABL1 con la formazione del gene di fusione NUP214/ABL1 è stato riscontrato in circa il 6% delle LAL-T (Graux C et al, Leukemia 2006). In questo contesto, analisi di gene expression profile, hanno dimostrato nei casi con tale anomalia cromosomica una elevata espressione del gene ABL1 (Chiaretti S et al, Haematologica 2007). E stato constatato, inoltre, che la contemporanea presenza del gene di fusione NUP214/ABL1 con EML1/ABL1, quest ultimo derivante dalla traslocazione t(9;14)(q34;q32), spesso si associa alla presenza di altre aberrazioni come ad indicare un contributo multigenico alla leucemogenesi nelle cellule T (Chiaretti S et al, Haematologica 2007). Altra dimostrazione di tale ipotesi è rappresentata dalla possibilità d riscontrare una attivazione costitutiva del gene JAK2 come conseguenza della t(9;12)(p24;p13) con formazione del gene di fusione ETV6- JAK2 (Peeters P et al, Blood 1997). Altre lesioni più recentemente identificate nelle LAL-T includono le mutazioni di Notch1, JAK1 e CEBPA unitamente all overespressione di geni quali TLX1 (HOX11), TLX3 (HOX11L2), TAL1 e LYL1 (Graux C et al, Leukemia 2006; Chiaretti S et al, Haematologica 2007). Piú in generale, diventa oggi sempre piú evidente come unitamente alle alterazioni cromosomiche note, la concomitante presenza di aberrazioni secondarie possa avere una rilevante importanza clinica nel contesto delle leucemie acute. Meno frequenti nelle LAL sono le anomalie numeriche. Le iperdiploidie sono presenti nel 5-10% dei casi adulti e l associazione con una migliore prognosi è meno ovvia rispetto a quanto avviene nei bambini, nei quali con una frequenza del 25%, le LAL iperdiploidi presentano un outcome migliore con l 80% di EFS a 5 anni (Harrison CJ, Blood Rev 2001). I casi con ipodiploidia invece, 14

15 che rappresentano circa il 2-4% delle LAL, sono associati per entrambi i gruppi, adulti e bambini, ad una prognosi sfavorevole. Molte delle più comuni traslocazioni cromosomiche sono state inoltre studiate anche a livello molecolare mediante l utilizzo di tecniche di Q-RT-PCR (Quantitative-Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) che rispetto alle analisi citogenetiche hanno il vantaggio di poter essere utilizzate anche nel monitoraggio dei pazienti dopo terapia essendo in grado di identificare, con elevata sensibilità, il numero esatto di copie di RNA messaggero presenti a livello cellulare (Elia L et al, Haematologica 2003; Beillard E et al, Leukemia 2003). Tali metodiche di Q-RT-PCR sono inoltre molto importanti per identificare la presenza di riarrangiamenti specifici e clonali a livello dei geni delle Ig e del TCR (van Dongen JJ, Leukemia 2003) che caratterizzano gran parte delle LAL, consentendone la distinzione da eventuali proliferazioni linfoidi reattive. Infatti, le analisi del riarrangiamento dei geni delle catene IgH (LAL-B) e del TCR (LAL-T) hanno dimostrato un riarrangiamento identico e clonale nella maggior parte delle patologie linfoidi. Ai siti di giunzione dei segmenti genici VDJ, la delezione e l inserzione random di nucleotidi che avvengono durante il processo di riarrangiamento, determinano la formazione di regioni giunzionali altamente diversificate che contribuiscono significativamente al repertorio totale delle molecole delle Ig e del TCR, conferendo anche una specificità per ciascun paziente analizzato (van der Velden VHJ et al, Leukemia 2003; Cazzaniga G and Biondi A, Haematologica 2005). Oltre a quanto detto in merito alla caratterizzazione genetico-molecolare, è importante sottolineare quanto l introduzione delle tecniche di studio del profilo genico mediante microarrays abbia fornito nuove conoscenze nella caratterizzazione biologica delle leucemie (Haferlac T et al, Semin Hematol 2003). Tale analisi oltre che definire il profilo genico di ciascuna entità patologica è in grado di identificare la presenza di set genici che caratterizzano gruppi di pazienti diversi con altrettanto diverse risposte ai regimi chemioterapici svolgendo quindi un importante ruolo prognostico. Un esempio di ciò è rappresentato da quanto descritto in un recente lavoro (Chiaretti S et al, Haematologica 2010) in cui sono stati valutati i livelli di espressione del mir-223. Da tale analisi emergeva che il 10% circa dei pazienti affetti da LAL-T, mostravano un profilo di espressione genica simil-mieloide. Tra i geni di natura mieloide up-regolati, CEBPA, regolatore del mir-223, risultava altamente espresso. Dunque, poteva evidenziarsi una differenziale espressione di tale mir con una up-regolazione in quei casi con profilo simil-mieloide a dimostrazione del fatto che è possibile isolare specifici sottogruppi di pazienti con diverso comportamento biologico. 15

16 A questo punto, non è irrealistico immaginare come attraverso un attento studio dei patterns di espressione genica di ciascun paziente si possa arrivare ad identificare un profilo diagnostico, prognostico e terapeutico per ogni singola forma leucemica. Tabella 1: Classificazione immunologica delle LAL. LAL-B* (CD19+ e/o CD79a+ e /o CD22+) LAL pro-b CD10-/cIgM- LAL B-common CD10+/cIgM- LAL pre-b cigm+ LAL B-matura CD20+/Igκ+ oppure Igλ+ LAL-T (cy/s CD3+) LAL early-t LAL pro-t LAL pre-t (T-II) LAL-T corticale (T-III) LAL T-matura (T-IV) CD34+/cCD3+/CD4-/CD8-/CD5neg/low/Ag mielodi+ CD34+/cCD3+/CD4-/CD8- ccd3+/cd4 e/o CD8+/CD1acCD3+/CD1a+ scd3+/cd1a- * La maggior parte delle LAL-B, ad eccezione delle LAL B mature, mostra espressione dell antigene TdT. c= citoplasmatico; s= superficie; Ag= antigene 16

17 PROGETTO I: Identificazione citofluorimetrica della proteina Bcr/Abl nella leucemia acuta linfoblastica Raponi S, De Propris MS, Wai H, Intoppa S, Elia L, Diverio D, Vitale A, Foà R and Guarini A. An accurate and rapid flow cytometric diagnosis of BCR-ABL positive acute lymphoblastic leukemia. Haematologica 2009; 94 (12):

18 La traslocazione t(9;22)(q34;q11) e l importanza dell utilizzo dei farmaci inibitori delle tirosin-chinasi Oltre a caratterizzare più del 95% dei pazienti affetti da leucemia mieloide cronica, come già descritto la traslocazione t(9;22)(q34;q11) rappresenta la più frequente anomalia cromosomica nell ambito delle LAL dell età adulta con una frequenza complessiva del 30% circa e la tendenza ad incrementare con l eta fino a raggiungere percentuali del 50-60% nei pazienti con più di 50 anni di età (Szczepański T et al, Lancet Oncol 2010). Al contrario, risulta estremamente rara nell età pediatrica rappresentando meno del 5% delle LAL. E presente inoltre nel 2% circa delle leucemie acute mieloidi (Maekawa T et al, Int J Clin Oncol 2007) ed in circa il 6% delle LAL-T in un riarrangiamento variante t(9;9)(q34;q34) che determina la formazione del gene di fusione NUP214/ABL1 (Chiaretti S et al, Haematologica 2009). Ancor prima della identificazione genetica di tale traslocazione avvenuta solo nel 1973 (Rowley JD, Nature 1973), il cromosoma Philadelphia (Ph), così chiamato dal nome della città in cui furono condotti gli studi, era già stato identificato nel 1960 essere l evento scatenante lo sviluppo di forme di leucemia mieloide cronica (Nowell P and Hungerford D, Science 1960). Dieci anni più tardi giunse la scoperta del coivolgimento nella traslocazione del proto-oncogene c-abl, che rimosso dal cromosoma 9 veniva inserito in un gene allora sconosciuto e più tardi definito BCR (Breakpoint Cluster Region), formando un oncogene chimerico detto BCR/ABL in grado di generare una proteina chimerica che, in quanto costitutivamente attiva, mostrava alterata attività tirosin-chinasica (Bartram CR et al, Nature 1983). Numerosi modelli sperimentali dimostrarono successivamente che negli animali il trapianto di cellule staminali ematopoietiche trasdotte con il gene di fusione BCR/ABL generava l insorgenza di patologie CML-like (Daley GQ et al, Science 1990). La traslocazione reciproca t(9;22)(q34;q11) è conseguente alla rottura sul gene ABL in un punto unico ed interno ad una regione di più di 300 kilobasi e sul gene BCR a livello del quale la rottura può avvenire in 3 differenti regioni definite: major BCR (M-BCR), minor BCR (m-bcr) e micro BCR (µ-bcr). A seconda della regione coinvolta nella rottura a livello di BCR si potrà avere la formazione di differenti mrna che verranno successivamente tradotti in differenti tipi di proteina con diverso peso molecolare, rispettivamente P210, P190 e P230. La prima di queste caratterizza la maggior parte dei pazienti affetti da LMC ed un terzo circa dei pazienti con LAL Ph+, contrariamente alla proteina P190 che si ritrova nella maggior parte delle LAL ed in una piccola percentuale delle LMC ed alla P230 che caratterizza quelle rare forme di leucemia neutrofilica cronica Ph+. 18

19 Indipendentemente dalla tipologia di proteina che si forma, essa si presenta distribuita nel citoplasma legata all actina mediante il dominio C-terminale e con attività tirosin-kinasica costitutivamente attiva. Essa è in grado di alterare numerosi pathways di trasduzione del segnale con risultante de-regolazione a livello dei processi di proliferazione ed adesione cellulare nonche inibizione dei processi di apoptosi (Deininger MWN et al, Blood 2000; Piccaluga PP et al, Cancer 2007) (Figura 1). E inoltre descritto un quarto possibile meccanismo responsabile della trasformazione cellulare indotta da Bcr-Abl legato alla degradazione proteasoma-dipendente di proteine inibitorie della chinasi Abl (Deininger MWN et al, Blood 2000). Sostanzialmente la proteina Bcr-Abl agisce legando l adenosina trifosfato (ATP) e catalizzando il trasferimento di un gruppo fosfato al gruppo idrossilico presente sul residuo di tirosina a livello di fattori proteici partecipanti alle diverse cascate di trasduzione del segnale (Paul MK and Mukhopadhyay AK, Int J Med Sci 2004). La comprensione di tali meccanismi molecolari che sottendono alla trasformazione neoplastica nelle leucemie Ph+ ha permesso la realizzazione del primo ed efficace esempio di terapia molecolare mirata: l imatinib mesilato (Gleevec). Sintetizzato sulla base delle conoscenze della struttura del sito di legame con l ATP, esso sarebbe in grado di agire come inibitore competitivo dell attività enzimatica della proteina Bcr-Abl (TKI: tyrosine kinase inhibitor) (Buchdunger E et al, Cancer Res 1996). Tuttavia, studi sulla struttura cristallografica del dominio catalitico di Abl complessato con un omologo dell Imatinib, hanno dimostrato che il farmaco piuttosto che occupare la tasca di legame dell ATP, si lega alla proteina Bcr-Abl bloccandola in una conformazione inattiva. Essa, non legando ATP non sarebbe in grado di trasferire gruppi fosfato dall ATP ai substrati a valle con conseguente blocco dell attivazione delle rispettive vie di segnalazione (Schindler T et al, Science 2000). Studi clinici di fase I iniziati nel 1998, che prevedevano l utilizzo di Imatinib, dimostrarono una significativa attività antileucemica con una buona tollerabilità nei pazienti affetti da LMC, nei quali era fallito il trattamento convenzionale con IFN-α, permettendone l introduzione nell armamentario terapeutico per il trattamento dei pazienti affetti da LMC. Ciononostante, lo sviluppo di fenomeni di resistenza all utilizzo di tale farmaco indotta da differenti meccanismi, ha reso necessario lo sviluppo di altri composti che fossero attivi nei confronti di tali forme di resistenza per la maggior parte dei casi rappresentate da mutanti di BCR/ABL. Si sono così sviluppati, inibitori di Bcr-Abl cosiddetti di seconda generazione (Dasatinib, Nilotinib, Bosutinib, INNO-406) alcuni dei quali ancora in fase di sperimentazione pre-clinica, con attività molto più potente dell Imatinib nell inibire l attività chinasica di Bcr-Abl. Ciò è stato dimostrato in linee cellulari positive per Bcr-Abl in forma wild-type ed in molti dei mutanti, eccetto che nel mutante T315I (mutante che presenta sostituizione amminoacidica di treonina con isoleucina in posizione 315) (Weisberg E et al, Cancer Cell 2005) per il quale risultava già 19

20 inefficace il trattamento con Imatinib a causa della ridotta affinità del farmaco per il dominio catalitico di Abl dovuta alla sostituzione amminoacidica. Considerata dunque l incapacità dei farmaci di prima e seconda generazione di neutralizzare la resistenza dovuta alla presenza della mutazione puntiforme T315I, sono stati sviluppati farmaci inibitori della chinasi Bcr-Abl di terza generazione, ad oggi valutati però solo in fase pre-clinica, che risulterebbero in grado di agire su cellule che presentano tale mutazione. Un esempio è rappresentato dagli inibitori delle Aurora chinasi che si sono mostrati estremamente efficaci in studi di fase I e II e quando utilizzati in combinazione con Dasatinib, come a suggerire l efficacia di un trattamento combinato nei casi con cloni resistenti a trattamenti di prima linea (Martinelli G et al, Best Pract Res Clin Haematol 2009). Altra molecola appartenente al gruppo degli inibitori di terza generazione è rappresentata dal Ponatinib (AP24534) dimostratosi in grado di inibire i processi di autofosforilazione sia delle forme wilde-type che dei mutanti T315I (Santos FP, et al, Curr Hematol Malig Rep 2011). Dunque alla luce di quanto detto, la valutazione dello stato mutazionale di un paziente che abbia una risposta sub-ottimale ad uno specifico trattamento con TKIs o che addirittura manifesti evidenza di resistenza, sta via via entrando nella pratica clinica considerato il suo prezioso contributo per una più razionale ed appropriata gestione terapeutica ddi tali pazienti. In un più ampio contesto, l identificazione della presenza di tale traslocazione cromosomica ed ancor più della proteina di fusione da essa derivante, fornisce una possibilità terapeutica aggiuntiva in specifiche categorie di pazienti. 20

21 SCOPO DELLO STUDIO L utilizzo dei farmaci TKIs, ha profondamente modificato il management non solo dei pazienti affetti da LMC ma anche l outcome dei casi con LAL Ph+ in maniera pressoché indipendente dall età (Ravandi F and Kebriaei P, Hematol Oncol Clin North Am 2009; Schultz KR et al, J Clin Oncol 2009; Foa R et al, Blood 2011). Considerata la frequenza di tale anomalia cromosomica nell ambito delle LAL ed in particolare in quelle dell adulto, unitamente alla possibilità di riservare un trattamento terapeutico specifico per questa categoria di pazienti, fino a qualche anno fa considerata a prognosi estremamente sfavorevole, risulta necessaria una rapida identificazione dei casi Ph+ in fase di esordio di malattia. Attualmente, l identificazione di tale lesione genetica viene eseguita attraverso l utilizzo di metodiche di Q-RT-PCR (Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction), citogenetica convenzionale ed analisi FISH. La necessità di avere a disposizione laboratori altamente specializzati per l esecuzione di tali metodiche che necessitano, in alcuni casi, di tempi di esecuzione molto lunghi, ha suggerito la messa a punto di un dosaggio citofluorimetrico che permetta una più rapida identificazione dell oncoproteina di fusione Bcr-Abl nel campione in esame. Sulla base di ciò, lo scopo di questo studio è stato quello di testare la validità di un innovativo dosaggio citofluorimetrico - il Cytometric Bead Assay (CBA) - su una casistica di 101 pazienti affetti da leucemia acuta valutati in maniera consecutiva all esordio di malattia. L intento e stato quello di valutarne applicabilià, specificità e rapidità di esecuzione confrontando i risultati ottenuti con quelli relativi alla valutazione mediante tecniche di biologia molecolare della presenza del gene di fusione BCR/ABL, eseguita in tutti i pazienti presi in considerazione 21

22 MATERIALI E METODI Pazienti e caratterizzazione della malattia La valutazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl è stata eseguita in 101 campioni afferenti consecutivamente alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Di questi campioni, tutti lavorati a fresco ed entro le 24 ore dal prelievo, 81 provenivano da sangue midollare e 20 da sangue venoso periferico. Sono stati valutati 91 pazienti adulti e 10 bambini con una eta mediana di 45 anni (range: 1-81) ed un rapporto maschi/femmine di 59/42. La diagnosi di leucemia acuta e stata stabilita in accordo con i criteri morfologici, citochimici ed immunologici stabiliti dalla classificazione FAB e WHO. Per quanto riguarda la diagnosi immunofenotipica, i campioni di sangue midollare e sangue periferico sono stati incubati con diverse combinazioni costituite da differenti anticorpi coniugati con i fluorocromi FITC (fluorescin isothiocyanate), PE (phycoerythrin), PerCP (peridin-clorophyll protein), APC (allophycocyanin) e diretti verso i seguenti antigeni di superficie: CD1a, CD10 (Dako, Glostrup, Denmark), CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11b, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD34, CD38, CD45, CD56 (BD, Biosciences, San Jose, CA), CD7, CD33, CD65, CD66c, CD117 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France), CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). In aggiunta a questi, altri anticorpi sono stati utilizzati per identificare antigeni citoplasmatici quali MPO, CD3, CD79a (Dako), IgM (Southern Biotech, Birmingham, AL) ed antigeni nucleari quali la TdT (deossinucleotidil trasferasi terminale) (Dako). Dei 101 pazienti analizzati, 89 si presentavano in fase di esordio di malattia. Sulla base della caratterizzazione immunofenotipica essi potevano ulteriormente dividersi in: 53 casi di LAL-B (8 pro-b, 38 B-common e 7 pre-b), 5 LAL-T, 30 casi di LAM ed 1 caso di MPAL. Sono stati inoltre valutati 5 casi in recidiva di malattia (1 caso di LAL-T, 3 LAL B-common ed 1 caso di LAM) e 7 casi in fase di crisi blastica di LMC (4 LAL-B e 3 LAM). Come controllo ed a conferma dei risultati ottenuti dal saggio citofluorimetrico, tutti i pazienti analizzati per la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl, sono stati studiati in doppio anche tramite analisi molecolare allo scopo di identificare la presenza del rispettivo gene di fusione o di altri geni mediante RT-PCR (Elia L et al, Haematologica 2003). Nell ambito dei pazienti con diagnosi di LAL, l analisi molecolare identificava la presenza dei seguenti trascritti di fusione: 32 casi di BCR/ABL (19 casi p190, 4 casi p210 e 9 casi p190/p210), 3 casi di MLL/AF4, 2 casi di MLL/ENL, 2 casi di E2A/PBX1 ed un caso con presenza del gene di fusione SIL/TAL1. Tra i casi 22

23 con diagnosi di LAM, in 6 si evidenziava la presenza del gene di fusione PML/RARα ed 1 caso risultava positivo al gene NUMA/ RARα. 23

24 Il saggio CBA (Cytometric Bead Assay) Il Cytometric Bead Assay (CBA) rappresenta un saggio citofluorimetrico che, mediante il BCR/ABL Protein Kit (BD Biosciences), è in grado di identificare qualitativamente la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl nei lisati di sangue midollare o periferico intero prelevato da pazienti affetti da forme leucemiche recanti tale alterazione genetica. Il test permette il riconoscimento di tutte le varianti della proteina di fusione Bcr-Abl in quanto gli anticorpi anti-bcr ed anti-abl utilizzati riconoscono epitopi localizzati rispettivamente al 5 della regione m-bcr e a valle della regione di rottura sul gene ABL. Esso può inoltre essere eseguito anche dopo aver effettuato una separazione delle cellule su gradiente di densità (Ficoll); la procedura migliore è però risultata quella eseguita su sangue intero soprattutto in presenza di una scarsa quantità di materiale processabile. Lavorando su campione intero il protocollo prevede una lisi cellulare che permette il rilascio nella sospensione cellulare della proteina di fusione che viene a sua volta riconosciuta e captata da un anticorpo anti-bcr coniugato ad una biglia e successivamente da un anticorpo anti-abl coniugato con il fluorocromo PE (Weerkamp F et al, Leukemia 2009). Si formerebbe in questo modo un complesso proteina-biglie-anticorpo PE-coniugato identificabile mediante lettura al citofluorimetro (Figura 2). Lisati cellulari ottenuti da sangue venoso periferico di donatori sani e dalla linea cellulare K562, quest ultima positiva alla proteina P210, sono stati utilizzati rispettivamente come controlli negativi e positivi. La presenza delle proteine Bcr ed Abl normali non dà luogo ad alcun segnale di fluorescenza. In accordo con le istruzioni indicate dalla ditta produttrice, è necessario incubare 1-2 ml di sangue intero o midollo osseo contenenti circa 25x10 6 cellule totali con 50 ml di soluzione lisante 1X BD Pharm Lyse (BD Biosciences) per 10 minuti a temperatura ambiente, affinchèci sia la lisi dei globuli rossi presenti. Successivamente a due lavaggi effettuati con PBS al 5% in FBS, le cellule vengono pre-trattate utilizzando 250 ul di Pretreatment Buffer ottenuto diluendo il Pretreatment A 1X ed il Pretreatment B 1X (BD Biosciences) ed incubate in ghiaccio per 10 minuti. In questo modo ha luogo un iniziale processo di rallentamento dell attivita delle proteasi contenute nei granuli cellulari. A cio segue un lavaggio in PBS al 5% in FBS ed una successiva incubazione per 15 minuti con 100 ul di un cocktail di inibitori delle proteasi, BD Lysate Treatment Reagent 1X (BD Biosciences). Tale trattamento risulta necessario continuare l azione del Pretratment Buffer evitando il clivaggio proteico ad opera delle proteasi contenute nei granuli delle cellule mieloidi residue che rilasciate nel surnatante in seguito al trattamento del campione con soluzione lisante i globuli rossi, potrebbero interferire con l identificazione della presenza della proteina di fusione 24

25 Bcr-Abl nei lisati cellulari. A questo punto le cellule vengono centrifugate ad elevata velocità (20,000 g) per 10 minuti a +4 o C. L elevata velocità in questo caso permetterebbe una totale sedimentazione delle cellule e dei detriti cellulari, che potrebbero altrimenti interferire con la reazione antigene-anticorpo, con l ottenimento di un surnatante appropriato per poter procedere alla determinazione della presenza della proteina di fusione. Eliminato il pellet, si effettua una incubazione di 2 ore con 50 ul di lisato cellulare con altrettanto quantitativo dell anticorpo anti-bcr biglia-coniugato (BD Biosciences) e dell anticorpo anti-abl PE-coniugato (BD Biosciences). Al termine dell incubazione dopo lavaggio con CBA Wash Buffer (BD Biosciences) i campioni vengono acquisiti utilizzando il citofluorimetro FACSCanto (BD Biosciences) ed analizzati con il software FACSDiva (versione 6.0) previo settaggio strumentale con le apposite biglie Cytometer Setup and Tracking (CS&T) in accordo con quanto indicato nelle istruzioni operative (BD Biosciences). Per ciascun campione valutato, la determinazione citofluorimetrica veniva eseguita in parallelo anche su un campione di sangue venoso periferico normale (controllo negativo) ed un campione di linea cellulare K562 (controllo positivo) a conferma che il risultato ottenuto, sia esso positivo o negativo, non fosse influenzato da alcuna variabilità procedurale e/o strumentale. 25

26 Analisi citofluorimetrica della proteina Bcr/Abl Il dosaggio CBA consente una identificazione qualitativa della proteina di fusione Bcr-Abl senza permetterne una esatta quantizzazione. Esso fornisce un risultato positivo o negativo a cui corrisponderà un ben preciso segnale di fluorescenza derivante dall utilizzo dell anticorpo anti-abl PE-coniugato. Tale segnale è associabile ad un valore di MFI che verrà poi relazionato ai valori di MFI ottenuti dai controlli negativi e positivi analizzati (Figura 3). L assenza della proteina di fusione e stata definita utilizzando un cut-off di laboratorio pari al valore medio ± 2DS dei valori di MFI emessi dal fluorocromo PE coniugato all anticorpo anti-abl, ottenuto in seguito all esecuzione del saggio su 20 campioni di sangue venoso periferico ottenuti da donatori sani. Ciò risulta estremamente importante in quanto nonostante nella maggior parte dei casi analizzati si e registrato un segnale citofluorimetrico di netta positività o negatività, il cut-off di riferimento è risultato estremamente utile nella definizione dei casi border line e nella identificazione del livello di sensibilità del metodo. Sulla base di ciò sono stati considerati positivi tutti quei casi che mostravano un valore di MFI superiore a 124±16 con una sensibilità pari al 10% e la disponibilità di almeno 25x10 6 cellule totali. 26

27 RISULTATI L analisi citofluorimetrica mediante CBA della proteina di fusione Bcr-Abl eseguita su 101 campioni ha evidenziato un segnale di positività in 30 casi (29.7%) di cui 24/30 valutati da campioni di sangue midollare e 6/30 da campioni di sangue venoso periferico. Considerando il valore mediano del numero di cellule leucemiche presenti in tali campioni esso risultava essere pari a 17.6x10 6 (range: ) con un valore mediano di MFI che in questo gruppo di pazienti risultava pari a 6326 (range: ). La caratterizzazione immmunofenotipica della malattia ha permesso di evidenziare tra questi 30 campioni positivi al CBA, 23 casi di LAL-B e 7 casi in fase di crisi blastica di LMC. All analisi molecolare mediante RT-PCR, che forniva risultato positivo in tutti i casi risultati positivi al saggio CBA, i campioni analizzati mostravano la presenza di differenti tipologie di trascritto (P190, P210 e P190/P210) ad eccezione del trascritto relativo alla proteina P230 (Tabella 1). In due dei casi risultati positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione BCR/ABL (P190), entrambi LAL B-common, il saggio CBA risultava essere negativo. Infatti, considerando il cut-off di riferimento per i valori di MFI che risultava pari a 124±16, in questi due campioni si evidenziavano valori di MFI rispettivamente di 81 ed 87, ovvero nettamente inferiori al valore di riferimento. Tali risultati discordanti risultavano dipendenti dalle cellule leucemiche a disposizione per l analisi citofluorimetrica che risultavano pari a 5.9x10 5 in un caso e 5.1x10 5 nell altro, ovvero valori notevolmente inferiori al limite di sensibilità, (pari a 2.5x10 6 cellule patologiche) descritta per questo test. Entrambi i pazienti al momento dello studio risultavano però in trattamento con farmaci steroidei. Altri due casi, positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione sono stati valutati in concomitanza del trattamento steroideo. Essi risultavano però positivi al saggio CBA, con valori di MFI pari a 436 e 221 e con un numero di cellule totali ed una percentuale di cellule leucemiche superiori al limite di sensibilità del metodo. In tre dei casi risultati positivi al CBA per la presenza della proteina di fusione, il dosaggio è stato ripetuto dopo conservazione del campione a temperatura ambiente rispettivamente per 48 e 96h. In questi casi l analisi citofluorimetrica ha evidenziato un risultato comunque positivo anche se con una lieve diminuzione dei livelli di intensità di fluorescenza e quindi inferiori valori di MFI rispetto al campione valutato entro le 24h dal prelievo (Figura 4). Simili risultati sono stati ottenuti eseguendo il test su lisati cellulari criopreservati a -80 o C e valutati dopo 4, 18 e 22 giorni dal congelamento. Dei 101 casi analizzati, 71/101 (70.3%) sono risultati negativi al test CBA, 51/71 valutati da prelievo eseguito su sangue midollare e 14/71 da sangue venoso periferico. Il valore mediano del 27

28 numero di cellule leucemiche presenti in questo gruppo di pazienti era pari a 17.5x10 6 (range: ) mentre il valore mediano di MFI risultava pari a 88 (range: ). All analisi immunofenotipica questi pazienti si dividevano come segue: 32 LAL-B, 5 LAL-T, 30 LAM, un caso di MPAL e tre casi valutati in recidiva di malattia (1 LAL B-common, 1 LAL T ed una LAM) (Tabella 1). Nell ambito dei 32 casi di LAL-B, 5 mostravano un immunofenotipo pro-b e di questi all analisi molecolare 3 risultavano positivi per il gene di fusione MLL/AF4 e 2 per il gene MLL/ENL. Analogamente, dei 30 casi di LAM presi in considerazione, l analisi molecolare evidenziava 6 casi con trascritto PML/RARα ed un caso con trascritto NUMA/RARα. 28

29 DISCUSSIONE Le LAL rappresentano la più frequente neoplasia dell età pediatrica costituendo circa l 80% di tutte le leucemie acute del bambino (Pui CH et al, Lancet 2008). Esse risultano invece più rare in età adulta, con una frequenza complessiva del 20% (Jabbour EJ et al, Mayo Clin Proc 2005) e la tendenza ad un incremento intorno ai 50 anni di età. E ormai ampiamente descritta la frequenza della anomalia cromosomica t(9;22)(q34;q11) nell ambito di tale forma leucemica, così come il suo incremento con l avanzare dell età. Le nuove acquisizioni ottenute in campo terapeutico, hanno permesso un netto miglioramento della prognosi associata ai casi presentanti tale aberrazione, prima caratterizzati da scarse possibilità di guarigione. L avvento dei farmaci inibitori delle tirosin-chinasi (TKIs) di prima e seconda generazione, nonchè sperimentazioni pre-cliniche in atto per quelli di terza generazione, oltre che modificare drasticamente la storia naturale della LMC, ha profondamente migliorato l outcome dei pazienti affetti da LAL Ph+ (Ottmann OG et al, Blood 2002; Ottmann OG et al, Blood 2007; Vignetti M et al, Blood 2007, Foà R et al, Blood 2011). Le metodologie ad oggi disponibili ed utilizzate per definire biologicamente questa categoria di pazienti, sono rappresentate dall analisi mediante FISH della presenza del cromosoma Ph e quindi della traslocazione e dall identificazione del gene di fusione BCR/ABL mediante metodiche di Q- RT-PCR con la possibilità di quantizzare esattamente il numero esatto di copie di mrna presenti nel campione in esame. Tali metodologie però, oltre a necessitare di strutture laboratoristiche specializzate richiedono anche un dispendio temporale di non poco rilievo nella fase di definizione diagnostica di un paziente affetto da LAL, laddove la tempestiva identificazione di tale traslocazione risulta essere estremamente importante se si considera la possibilità di poter utilizzare farmaci specifici, meno invasivi e con ottimi risultati rispetto ai chemioterapici convenzionali. Per questo motivo è andata via via emergendo la necessità di avere a disposizione un metodo più semplice e soprattutto più rapido per l identificazione della presenza della proteina di fusione derivante da tale traslocazione. In questo contesto l introduzione del saggio citofluorimetrico CBA, ha rappresentato un notevole progresso in quanto in grado di identificare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl che, a causa dell elevato peso molecolare e della sua estrema instabilità non potrebbe altrimenti essere indagata con le convenzionali metodologie per l analisi proteica. L identificazione proteica in questo contesto rappresenta un concetto estremamente importante in quanto la sua presenza documenta l effettiva traduzione del trascritto chimerico oltre a rappresentare il reale ed effettivo bersaglio dei farmaci TKIs. 29

30 Immediatamente successivo alla pubblicazione di Weerkamp e colleghi (Weerkamp F et al, Leukemia 2009), questo rappresenta il primo studio condotto su un ampia serie di casi affetti da leucemia acuta. I risultati mostrano una elevata specificità di questo metodo nella identificazione della proteina di fusione. E stata infatti dimostrata una assoluta correlazione tra la presenza/assenza di proteina e la positività/negatività del gene di fusione all analisi molecolare. A conferma di ciò sono stati inclusi nello studio anche casi che all analisi molecolare risultavano positivi per altri geni di fusione noti, con l ottenimento di risultati senza dubbio negativi al test CBA. Al contrario, tutti i casi risultati positivi all analisi molecolare per la presenza del gene di fusione BCR/ABL lo erano anche all analisi citofluorimetrica. Nell insieme questo dosaggio proteico si è dimostrato estremamente fattibile, con risultati riproducibili ed in particolar modo di semplice esecuzione. Esso è risultato rapido, con risultati ottenibili in 3-4 ore di lavoro e con la possibilità di essere facilmente integrato nell ambito dell inquadramento diagnostico di un paziente affetto da LAL. Inoltre, i risultati ottenuti in seguito ad esecuzione del test dopo 48 e 96 ore dal prelievo del campione e dopo congelamento per diversi giorni a -80 o C hanno dimostrato la fattibilità del test anche dopo qualche giorno dal prelievo, senza importanti differenze in termini di segnale di fluorescenza rispetto al test eseguito entro 24 ore e soprattutto con persistenza dei criteri di specificità. Ad ogni modo, in merito alla valutazione proteica dopo congelamento del materiale, risulta cruciale la lavorazione immediata del campione dopo scongelamento per evitare che il rilascio delle proteasi dai granuli dei neutrofili residui che durante il processo di congelamento vanno incontro a rottura, possa interferire con la determinazione citofluorimetrica (Lucas CM et al, Haematologica 2011). I risultati di questo studio sono in accordo con quanto descritto da Weerkamp e colleghi (Weerkamp F et al, Leukemia 2009) eccetto che per quel che riguarda la sensibilità del metodo. In realtà, il valore di sensibilità del test resta tuttora un concetto abbastanza dibattuto e con risultati spesso tra loro contrastanti. Fondamentalmente, tutti gli studi eseguiti utilizzando questo nuovo test citofluorimetrico, riportano livelli di sensibilità con riferimento ad esperimenti condotti su linee cellulari con valori che vengono poi trasferiti al dosaggio eseguito sui campioni provenienti da pazienti (Weerkamp et al, Leukemia 2009; Yujie W et al, Leuk Lymphoma 2012). In altri casi poi si fa riferimento solo al limite di cellule totali necessarie senza alcun riferimento a numero o percentuale di cellule patologiche presenti (Lucas CM et al, Haematologica 2011), concetto invece estremamente importante in quanto, anche se raramente, è possibile avere una bassa conta di blasti in esordio di malattia. Inoltre, in merito al concetto di sensibilità sulle linee cellulari, difficilmente risulta possibile esportare i valori ottenuti, allo stesso test eseguito sui pazienti. E noto, infatti, il differente comportamento delle linee cellulari rispetto ai campioni di cellule leucemiche primarie 30

31 considerato il valore maggiore di numero di copie di mrna BCR/ABL per cellula. A conferma di ciò, dalla nostra esperienza è emerso che, seppur riscontrando valori di sensibilità per la K562 pari all 1% e sovrapponibili quindi a quanto riportato in letteratura, lo stesso non poteva dirsi quando il test veniva eseguito sui campioni di cellule leucemiche ottenute dai pazienti. In due pazienti in trattamento con steroidi e con un numero di cellule leucemiche pari a 5.9x10 5 e 5.1x10 5, ovvero con valori inferiori al limite di sensibilità del metodo, positivi all analisi molecolare per il gene di fusione BCR/ABL, il test CBA risultava negativo. Allo scopo di indagare in merito alla possibilità che il trattamento steroideo potesse interferire direttamente con la corretta identificazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl nei lisati cellulari, il test CBA è stato eseguito in altri due casi, ugualmente positivi all analisi molecolare, in trattamento steroideo, ma con una adeguata conta di cellule leucemiche: il test CBA forniva risultati positivi per la presenza della proteina di fusione. Ciò a suggerire che piuttosto che l assenza di trattamento steroideo al momento dello studio, risulta estremamente importante la disponibilità di un adeguato numero di cellule per l ottenimento di risultati attendibili e concordi con quanto riscontrato all analisi molecolare. Ciononostante, in un unico caso nell ambito dei 101 campioni analizzati in questo lavoro, è stata riscontrata positività della proteina di fusione anche in presenza di un numero di cellule leucemiche inferiore al limite di sensibilità descritto e pari a 2.5x10 6. La sporadicità di tale risultato ha reso però impossibile considerare valori < 2.5x10 6 come cut-off di riferimento per la sensibilità del test. Rimanendo nel contesto della sensibilità del metodo, in un lavoro recentemente pubblicato (D Alessio F et al, Leuk Res 2011), viene proposta la possibilità di eseguire un miniaturized CBA, da loro condotto su campioni di liquido cerebro-spinale di pazienti Ph+ che mostravano coinvolgimento del sistema nervoso centrale. Tale studio dimostra come sia possibile individuare la presenza della proteina di fusione Bcr-Abl anche in presenza di una bassissima conta cellulare mediante modificazione dei quantitativi di anticorpi anti-bcr ed anti-abl in rapporto alla cellularità del campione con l ottenimento di risultati di positività in corrispondenza di un numero di cellule 178 volte inferiore al limite necessario per l utilizzo del BCR/ABL Protein Kit (BD Biosciences) (2.5x10 6 cellule leucemiche). Nonostante la rarità con cui ci si trova di fronte ad un così basso numero di cellule quando si analizzano campioni provenienti da pazienti in fase di esordio di malattia e senza alcun trattamento farmacologico, in linea teorica, i risultati ottenuti da questo studio potrebbero suggerire la possibilità di utilizzare il test opportunamente modificato in presenza di basse conte cellulari ed ancor più nelle fasi di valutazione della malattia minima residua. Ad ogni modo, nonostante i limiti di sensibilità, questo metodo permette una rapida identificazione di tutte le varianti della proteina di fusione Bcr-Abl (P190, P210, P190/P210) fornendo importanti 31

32 informazioni in merito alla possibilità di utilizzare terapie molecolari mirate volte ad inibire l attività chinasica di tale proteina. Alla luce degli entusiasmanti risultati ottenuti in seguito a trattamento dei pazienti Ph+ con farmaci TKIs (Vignetti M et al, Blood 2007; Ottmann OG et al, Cancer 2007, Foà R et al, Blood 2011), tutto ciò potrebbe rappresentare in primo luogo un aspetto di primaria importanza in particolare in quelle regioni geografiche che mancano della disponibilità di laboratori specializzati di biologia molecolare o che presentano una organizzazione tale da non permettere l ottenimento dei risultati di biologia molecolare in tempi utili per l inizio del trattamento con farmaci mirati. Infatti, previa identificazione della presenza della proteina di fusione Bcr-Abl, con l utilizzo di tali farmaci, è possibile ottenere potenzialmente in tutti i pazienti, senza alcun limite di età, siano essi di nuova diagnosi o in recidiva di malattia, il raggiungimento di una completa remissione ematologica senza chemioterapia, con una terapia per via orale e pressochè senza necessità di ospedalizzazione, condizioni queste estremamente importanti se si considera l elevata frequenza dei casi di LAL Ph+ dopo i 60 anni di età (Szczepanski T et al, Lancet Oncol 2010). Il futuro di tutto quanto detto si sta dirigendo verso il tentativo di incrementare i livelli di sensibilità tale da permettere l utilizzo di questo dosaggio nell ambito del monitoraggio della MMR dei pazienti affetti da LAL Ph+. Infine, i risultati ottenuti in seguito all utilizzo del metodo CBA per l identificazione della proteina di fusione Bcr-Abl, hanno reso possibile applicare il razionale alla base del disegno di tale saggio, per l identificazione citofluorimetrica di altre proteine derivanti da geni di fusione di cruciale importanza prognostica nell ambito di differenti patologie ematologiche (Dekking E et al, Best Pract Res Clin Haematol 2010). 32

33 Figura 1: Interazioni cellulari della proteina di fusione brc-abl. La sua alterata attività tirosinchinasica può determinare trasformazione cellulare principalmente attraverso tre meccanismi: alterata adesione cellulare (dovuta a fosforilazione di proteine del citoscheletro), attivazione mitogena (mediante attivazione dei pathways delle MAP chinasi) ed inibizione dei processi di apoptosi (mediante il pathway PI3K/AKT) (Deininger MWN et al, Blood 2000). 33

34 Fugura 2: Principio del saggio CBA. Figura 3: Modalità di espressione del segnale di positività o negatività del campione al saggio citofluorimetrico CBA. 34

35 Tabella 1: Confronto dei risultati ottenuti dal saggio citofluorimetrico con quelli ottenuti mediante analisi di biologia molecolare. Campioni valutati (n=101) Bcr-Abl (CBA) BCR/ABL (PCR) Casi Casi Casi p190 p210 p190/p210 negativi positivi negativi LAL B-common (n=38) 21 * * LAL B (n=56) LAL pre-b (n=7) LAL pro-b (n=8) Recidive di LAL-B common (n=3) LAL-T (n=6) Diagnosi (n=5) Recidive (n=1) LAM (n=31) Diagnosi (n=30) Recidive (n=1) Leucemie acute bi-fenotipiche (n=1) Crisi blastiche di LMC (n=7) LAL-B (n=4) Mieloidi (n=3) * Campioni negativi al test CBA contenenti solo 5.9x10 5 e 5.1x10 5 cellule leucemiche e provenienti da pazienti in trattamento steroideo al momento dello studio. 35

36 Figura 4: Confronto dei risultati ottenuti in due differenti pazienti con LAL B common P190 positivi in seguito ad esecuzione del test citofluorimetrico a fresco e dopo 48 e 96 ore dal prelievo. 36

37 PROGETTO II: Analisi citofluorimetrica di antigeni target di terapia con anticorpi monoclonali: un esperienza di 552 casi di leucemia acuta linfoblastica valutati in fasi di diagnosi Raponi S, Stefania De Propris M, Intoppa S, Laura Milani M, Vitale A, Elia L, Perbellini O, Pizzolo G, Foá R, Guarini A. Flow cytometric study of potential target antigens (CD19, CD20, CD22, CD33) for antibody-based immunotherapy in acute lymphoblastic leukemia: analysis of 552 cases. Leukemia & Lymphoma 2011; 52(6):

38 L importanza dell intensità di espressione antigenica nelle LAL Come già precedentemente introdotto, l analisi immunofenotipica insieme alla valutazione citomorfologica ed alle analisi genetico-molecolari, svolge un importante ruolo nel contesto dell inquadramento diagnostico delle LAL non solo per quanto concerne la caratterizzazione della patologia ma anche per la definizione di fattori prognostici con rilevanti risvolti in campo terapeutico (Vitale A et al, Curr Opin Oncol 2006; Gokbuget N and Hoelzer D, Rev in Clin Exp Hematol 2002). Il sempre crescente numero di anticorpi monoclonali (AcMo) ad oggi disponibili per lo studio immunofenotipico di cellule emopoietiche insieme alla possibilità di combinare tra loro differenti markers cellulari in un ampio pannello anticorpale, permette, infatti, una esatta distinzione dei differenti stadi maturativi della cellula nonchè l identificazione di importanti aberrazioni fenotipiche presenti nel campione in esame (Benè MC, Immunol Letters 2005). Oltre a ciò un importante aspetto da considerare nel contesto delle potenzialità della caratterizzazione immunofenotipica delle cellule leucemiche, è il ruolo che essa svolge nella identificazione dei differenti livelli di espressione con i quali uno specifico antigene è presente a livello cellulare. Oltre che produrre misure percentuali che ne definiscono la presenza è infatti possibile, attraverso l analisi citometrica, valutare le modalità di espressione antigenica, indice dei differenti stadi differenziativi e funzionali delle cellule. Quest ultimo aspetto è ormai divenuto ampiamente utilizzato, fino quasi a sostituire le modalità di espressione sotto forma di percentuale, in particolare grazie al tentativo che è stato fatto di fornire valide raccomandazioni metodologiche (2006 Bethesda International Consensus Recommendations) che avessero lo scopo di standardizzare il più possibile le modalità con cui esprimere la presenza di un antigene, rendendo i dati sempre più riproducibili in contesti laboratoristici differenti (Wood BL et al, Cytometry 2007). L espressione antigenica a livello cellulare può essere oggi definita in maniera qualitativa o quantitativa attraverso la valutazione di due parametri citofluorimetrici: rispettivamente la MFI e l ABC. Il primo di questi rappresenta un parametro derivante dal calcolo strumentale del valore medio del segnale di fluorescenza emesso dall anticorpo fluorocromo-coniugato dopo riconoscimento e legame con il rispettivo antigene all interno della popolazione cellulare in esame. Una più precisa quantizzazione dell espressione antigenica si può ottenere valutando l ABC, ovvero la capacità di legame anticorpale. Attraverso l utilizzo di un sistema QuantiBRITE (BD) basato sulla misurazione della fluorescenza del fluorocromo PE (phycoerythrin) coniugato all anticorpo è possibile definire il numero esatto di siti antigenici per un dato antigene presente sulla superficie cellulare. L utilizzo di tali parametri diventa particolarmente utile ed importante nei casi in cui l espressione antigenica non risulta bimodale - con la possibilità cioè di identificare, con valori percentuali ben 38

39 precisi, due popolazioni nette, l una positiva l altra negativa - ma unimodale ovvero caratterizzata dall assenza del picco dei negativi che si confondono con le cellule positive. In questo contesto la differenza tra un caso e l altro è data piuttosto che dalla percentuale di positività antigenica - difficile da stabilire per la necessità di posizionare in maniera alquanto arbitraria un left che definisca la regione positiva - dai differenti livelli di espressione antigenica (MFI e ABC). Tutto l interesse che ruota attorno alla possibilità di quantizzare le modalità con cui un antigene viene espresso a livello cellulare, deriva oltre che dall importanza che essa ricopre nella distinzione delle cellule normali da quelle patologiche e nell identificazione dei differenti sottotipi immunologici di LAL, anche dalle implicazioni prognostiche e terapeutiche che ne derivano grazie allo sviluppo di AcMo per utilizzo clinico nel trattamento di un numero sempre maggiore di patologie onco-ematologiche (Thomas DA et al, Blood 2009). Infatti, lo sviluppo di AcMo che riconoscono specifici antigeni cellulari permette oggi di attuare una vera e propria target therapy applicabile nel contesto di svariate patologie ematologiche e non. Molti degli antigeni per i quali si sono sviluppati AcMo specifici, svolgono importanti ruoli a livello cellulare essendo spesso coinvolti nei pathways di trasduzione del segnale o nei meccanismi di trasporto ionico all interno della cellula. La modulazione di tali processi indotta dall utilizzo dello specifico AcMo, determinerebbe un blocco o una de-regolazione dei pathways di sopravvivenza cellulare che unitamente all intervento dei meccanismi immunologici di ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) e CDC (complement-dependent cytotoxicity) sarebbe in grado di indurre morte cellulare programmata a livello delle cellule patologiche (Cartron G et al, Blood 2004; Castillo J et al, Exp Hematol 2008) (Figura 1). Ad oggi, gli AcMo disponibili possono essere utilizzati: i) da soli come agenti singoli ovvero in forma non coniugata (come ad esempio l AcMo anti-cd20, Rituximab); ii) coniugati con immunotossine o agenti chemioterapici che grazie all AcMo possono essere internalizzati a livello cellulare (come ad esempio il l AcMo anti-cd33, Gemtuzumab Ozogamicin); iii) coniugati a molecole radioattive con l intento di consentire un trasporto selettivo della radioattività alle cellule patologiche esprimenti quel determinato antigene; iv) come anticorpi bi-specifici, ovvero caratterizzati da una duplice specificità legata al fatto che essi possono riconoscere due antigeni target oppure indurre l attività delle cellule immunologicamente attive nei confronti delle cellule leucemiche (Gokbuget N and Hoelzer N, Best Pract Res Clin Haematol 2006). Indipendentemente dalla tipologia di AcMo utilizzata, l utilizzo di tale forma di terapia mirata ha come obiettivo principale la riduzione della tossicità indotta da chemioterapia nonchè l incremento dell efficacia terapeutica in quei sottogruppi di pazienti eleggibili per tali terapie (Kuriakose P, Cancer 2005). Esse sono di particolare interesse nei casi in cui risulta praticamente impossibile l intensificazione 39

40 dei regimi chemioterapici convenzionali, come si verifica spesso nei pazienti più anziani o nei casi in cui il clone leucemico risulta estremamente resistente al trattamento con farmaci citostatici. Nel contesto delle LAL tutto quanto detto trova applicazione grazie al fatto che esse sono caratterizzate dall espressione di antigeni per i quali sono disponibili specifici AcMo quali il CD19, CD20, CD22 e CD33. Seppure ancora nelle prime fasi di sperimentazione clinica (Schindler J et al, Br J Haematol 2011), si sono sviluppate negli anni diverse tipologie di AcMo anti-cd19 che risultano per lo più coniugati con immunotossine (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004). Tra questi, il Blinatumomab, anticorpo bi-specifico anti-cd19/anti-cd3, ha fornito risultati particolarmente incoraggianti nei casi con linfoma non-hodgking B e nel trattamento dei casi di LAL-B che presentano quote residue di malattia (D Argouges S et al, Leuk Res 2009). Considerati i risultati ottenuti in questi contesti, anche se ancora non pienamente inseriti nella pratica clinica, l utilizzo di AcMo anti-cd19 potrebbe risultare estremamente utile ad esempio in quei casi che risultano essere CD20 negativi. L antigene CD20 risulta altrettanto importante nel contesto delle LAL-B per i ruoli cruciali che esso svolge nella regolazione del ciclo cellulare e nei processi differenziativi (Thomas DA, Blood 2009) e per la disponibilità in commercio di numerosi AcMo con ormai dimostrata efficacia clinica. In particolare l utilizzo del Rituximab in concomitanza ai regimi chemioterapici convenzionali nei pazienti adulti affetti da LAL ha fatto registrare netti miglioramenti nella qualità di vita di tali pazienti (Thomas DA et al, Blood 2005). Analogamente agli antigeni CD19 e CD20, anche il CD22 è un antigene ristretto alla linea linfoide B e positivo nella gran parte delle LAL in relazione allo stadio maturativo cellulare; esso risulta presente a livello citoplasmatico nelle cellule più immature per divenire poi molecola di superficie del linfocita B una volta che esso esprime le immunoglobuline IgD. Rappresenta una glicoproteina trans-membrana con ruolo centrale nei processi di adesione cellulare, di regolazione dell homing dei linfociti B e di modulazione dell attivazione delle cellule B che, una volta riconosciuto da un AcMo per esso specifico, viene internalizzato a livello cellulare (Stanciu-Herrera C et al, Leuk Res 2008). Diversi studi in vitro riguardanti l utilizzo di AcMo che riconoscono tale antigene, sono stati condotti nell ambito dei linfomi (Dijoseph JF et al, Blood 2004). In alcuni casi l attività di tali anticorpi è stata valutata in vitro anche nell ambito delle LAL-B (Herrera L et al, Leukemia 2002), unitamente agli studi condotti sia in vitro che in vivo su linee cellulari di LAL pre-b che hanno dimostrato un aumento dell efficacia della chemioterapia quando accompagnata dalla simultanea somministrazione di AcMo anti-cd22 ed anti-cd19 (Stanciu Herrera C et al, Leuk Res 2008). Infine, una non piccola percentuale di LAL, sia di linea B che di linea T, risulta positiva all antigene CD33. L espressione di tale antigene nella quasi totalità delle leucemie acute mieloidi e gli incoraggianti risultati ottenuti 40

41 in questo ambito in seguito all utilizzo del Gemtuzumab Ozogamicin (GO), AcMo anti-cd33, hanno fornito un valido spunto per l introduzione di tale AcMo nel trattamento dei casi di LAL che esprimono questo antigene (Cotter M et al, Br J Haematol 2003; Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Alla luce di quanto detto, la determinazione citofluorimetrica della presenza o assenza di questi specifici antigeni unitamente alla valutazione della loro intensità di espressione, potrebbe essere di grande aiuto nella definizione di strategie terapeutiche in quei pazienti affetti da LAL che possono potenzialmente beneficiare dell utilizzo di specifici AcMo somministrati da soli o in combinazione con farmaci specifici. Un prerequisito ormai considerato importante per l utilizzo di tali terapie è rappresentato dalla presenza dell antigene verso il quale l AcMo è diretto in almeno il 20-30% delle cellule patologiche presenti nel campione in esame (Vitale A et al, Curr Opin in Oncol 2006; Gokbuget N and Hoelzer D, Ann of Hematol 2004; Chevallier P et al, Leukemia 2009) tenendo presente che la presenza di una più elevata percentuale di cellule positive all antigene, potrebbe associarsi ad una maggiore probabilità di risposta a tali forme di trattamento terapeutico. 41

42 SCOPO DELLO STUDIO Il futuro nella gestione dei pazienti ematologici è ormai diretto verso la possibilità di disegnare approcci terapeutici sempre più personalizzati (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004). Mentre nelle forme leucemiche croniche, quali la leucemia linfatica cronica ed i linfomi non- Hodgking, così come in quei casi di LAM con espressione dell antigene CD33 è ampiamente dimostrato il ruolo di alcuni degli AcMo descritti, il loro utilizzo nell ambito delle LAL è ancora molto dibattuto (Dworzak MN et al, Blood 2008; Thomas DA et al, Blood 2009). E ormai chiaro il ruolo prognostico svolto dall età nei pazienti affetti da LAL laddove nonostante le elevate percentuali di guarigione nei bambini di età compresa tra 1 e 10 anni, che raggiungono ormai più dell 80%, meno del 40% dei soggetti adulti affetti da LAL vanno incontro a guarigione (Rowe JM et al, Blood 2005; Vitale A et al, Curr Opin in Oncol 2006). Con il fine ultimo di incrementare tali percentuali diventa importante la disponibilità di approcci terapeutici il più possibile paziente-specifici, non chemioterapici e quindi con minore tossicità in particolare per i casi in cui l eccessiva tossicità indotta dai regimi convenzionali potrebbe rappresentare un ostacolo o nei casi in cui il clone leucemico risulterebbe resistente ai trattamenti chemioterapici standard. Terapie con AcMo diretti verso specifici antigeni espressi sulla superficie delle cellule leucemiche, quali anti-cd19, anti-cd20, anti-cd22, anti-cd33, anti-cd52 (Gokbuget N and Hoelzer D, Ann Hematol 2004), potrebbero rappresentare approcci promettenti in sottogruppi particolari di pazienti che presentano specifiche caratteristiche fenotipiche. Infatti, sebbene nelle LAL non siano moltissime le esperienze in merito all utilizzo di tali farmaci cosiddetti biologici, è sempre più evidente come l efficacia di tali trattamenti possa dipendere dal grado di espressione dello specifico antigene a livello cellulare (Vitale A et al, Curr Opin in Oncology 2006; Dworzak MN et al, Blood 2008; Chevallier P et al, Leukemia 2009). Sulla base di tali considerazioni, l obiettivo di questo studio è stato quello di valutare qualitativamente e quantitativamente, l espressione di quattro importanti antigeni espressi in corso di LAL (CD19, CD20, CD22 e CD33) e per i quali sono attualmente disponibili AcMo per essi specifici, in 552 casi affetti da LAL. Si è voluto inoltre valutare criticamente la possibilità che la loro espressione potesse o non essere associata ai differenti sottotipi immunologici, alle diverse classi di età e/o alla presenza di particolari trascritti di fusione identificati mediante metodiche di biologia molecolare. 42

43 MATERIALI E METODI Pazienti L analisi dell intensità di espressine antigenica è stata condotta retrospettivamente su un gruppo di 552 casi con diagnosi di LAL afferenti alla Divisione di Ematologia del Dipartimento di Biotecnologie Cellulari ed Ematologia della Sapienza di Roma. Di questi, 516 casi sono stati analizzati in fase di diagnosi mentre i rimanenti 36 al momento della recidiva di malattia. L analisi comprendeva indistintamente pazienti adulti e bambini, con un range di età compreso tra i 2 e gli 86 anni. In tutti i casi presi in considerazione la diagnosi di leucemia acuta veniva stabilita sulla base di criteri morfologici, citochimici ed immunologici in accordo con le classificazioni FAB e WHO. Tutti i campioni sono stati analizzati prima di essere sottoposti a qualsiasi trattamento terapeutico, incluso l utilizzo di farmaci steroidei. Nell ambito dei 552 casi totali, in 527 (95,5%) è stata valutata, mediante metodiche di RT-PCR, anche la presenza di particolari geni di fusione derivanti da traslocazioni cromosomiche note (Elia L et al, Haematologica 2003). Tutti i pazienti analizzati in questa sede, hanno fornito il consenso informato per l esecuzione di tali studi biologici. Con particolare riguardo all età, in accordo con quanto già noto in merito alle differenze biologiche relazionabili ad essa, i pazienti sono stati suddivisi in 4 differenti sottogruppi: 2-14, 15-21, 22-59, anni. Nella Tabella 1 è riportata la distribuzione dei casi per fasce di età, parametro disponibile in 538 dei 552 casi presi in considerazione. Valutazione citofluorimetrica In accordo con quanto già riportato in merito alla valutazione citofluorimetrica specifici quantitativi di sangue midollare o sangue venoso periferico sono stati incubati con appropriate combinazione di AcMo coniugati con fluorocromi FITC, PE, PerCP, APC, in grado di riconoscere i seguenti antigeni espressi sulla superficie cellulare: CD1a, CD10, catene leggere delle immunoglobuline kappa (Igκ) e lambda (Igλ) (Dako, Glostrup, Denmark), CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD13, CD15, CD19, CD20, CD22, CD33, CD34, CD38, CD45, CD56, HLA-DR, TCR α/β, TCR γ/δ (BD, Biosciences, San Jose, CA), CD7, CD58, CD65, CD66c, CD117, NG2 (Immunotech Coulter Company, Marseille, France), CD99 (BD Biosciences, Pharmigen, San Diego, CA), CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany), CD52 (AbD Serotec, Oxford, UK). Altri anticorpi sono stati utilizzati per la determinazione della presenza di antigeni citoplasmatici quali MPO, CD3, CD79a (Dako), catena pesante µ delle immunoglobuline (cyigm) (Southern Biotech, Birmingham, AL), e 43

44 nucleari quali la TdT (Terminal deoxynucleotidyl Transferase) (Dako). Per la determinazione degli antigeni presenti sulla superficie cellulare è stata eseguita la procedura di lisi dei globuli rossi mediante l utilizzo della FACS Lysing Solution 10X (BD Biosciences) mentre soluzioni fissanti e permeabilizzanti le cellule (Fix & Perm, Invitrogen, Carlsbab, CA) sono state utilizzate per la valutazione degli antigeni citoplasmatici e nucleari. Combinazioni contenenti, tra quelli elencati, quattro differenti anticorpi fluorocomo-coniugati sono state preparate ed acquisite utilizzando il citofluorimetro FACSCalibur (BD Biosciences) con un salvataggio di almeno 30,000 eventi per tubo. L analisi dei dati è stata eseguita utilizzando i softwares CELLQuest e PAINT-A-GATE (BD Biosciences). In particolare, l espressione degli antigeni CD19, CD20, CD22 e CD33 nelle LAL-B e del solo antigene CD33 nelle LAL-T è stata stimata in primo luogo valutando la proporzione delle cellule positive per ciascuno di essi con un cut-off pari al 20%. Successivamente sono stati determinati i livelli di espressione antigenica sulla base dei valori di MFI ricavati mediante l utilizzo del software CELLQuest e sulla base dei valori di ABC ottenuti attraverso il sistema QuantiBRITE per mezzo del software QuantiCALC. Il sistema QuantiBRITE disegnato per la valutazione di antigeni riconosciuti da un AcMo PE-coniugato, permette di stabilire per ciascuna cellula, l esatto numero di molecole PE adese alla superficie cellulare attraverso l utilizzo di un sistema di regressione lineare (Iyer SB et al, Cytometry 1998; Davis KA et al, Cytometry 1998). I valori di MFI ed ABC relativi a ciascuno degli antigeni analizzati sono stati determinati utilizzando le stesse combinazioni anticorpali per ognuno dei casi analizzati (Tabella 2) in quanto eventuali differenze di combinazione avrebbero potuto determinare variazioni di intensità di espressione antigenica non paziente-specifica ma combinazione-dipendente con difficoltà nello stabilire reali differenze di espressione antigenica all interno di specifici sottogruppi di pazienti. 44

45 RISULTATI Caratterizzazione immunofenotipica Sulla base del profilo immunofenotipico, i casi analizzati venivano suddivisi in 451 casi di LAL-B e 101 casi di LAL-T. Nell ambito delle LAL-B si distinguevano 54 casi di LAL pro-b, 295 casi di LAL B-common, 91 casi di LAL pre-b e 7 casi di LAL-B matura (Tabella 1). In 4 casi non essendo stata valutata l espressione citoplasmatica delle IgM è risultato impossibile effettuare una classificazione immunologica. Analogamente, dei 101 casi di LAL-T identificati, 7 risultavano classificabili come early T, 20 casi come LAL pro-t, 57 come LAL-T corticali, 15 come LAL pre- T ed infine 2 casi come LAL-T mature (Tabella 1). Nel gruppo delle LAL-B l età mediana risultava pari a 36 anni (range 2-86) e la conta mediana della percentuale dei blasti pari all 82% (range 20-98%). Considerando i casi immunologicamente identificabili come LAL T, essi si presentavano con un età mediana di 31 anni (range 5-72) ed una mediana della percentuale dei blasti pari all 89% (range 37-99%). L analisi di biologia molecolare eseguita mediante RT-PCR in 527/552 casi identificava, nell ambito delle LAL-B, 137 casi BCR/ABL positivi (di cui 94 casi p190, 34 p210 e 9 casi p190/p210), 23 casi MLL/AF4 positivi, 13 E2A/PBX1 positivi, 4 casi positivi per il gene di fusione MLL/ENL e 14 positivi per TEL/AML1. I rimanenti casi di LAL-B risultavano negativi all analisi molecolare per la presenza di trascritti di fusione noti. Tra i casi immunologicamente distinguibili come LAL-T venivano identificati 8 casi con il gene di fusione SIL/TAL, 2 casi NUP/RAP positivi, 1 caso SET/CAN positivo, 2 casi positivi per BCR/ABL ed 1 caso positivo per MLL/ENL; i rimanenti casi non mostravano presenza di alcun trascritto di fusione noto. 45

46 Espressione antigenica Dall analisi dell espressione antigenica in associazione alle differenti sottoclassi di età non è emersa alcuna differenza statisticamente significativa. Analogamente, la valutazione in 36 casi sia dei campioni di esordio che di quelli relativi alla fase di recidiva di malattia, non ha evidenziato alcuna differenza sostanziale in merito all intensità di espressione per nessuno dei quattro antigeni presi in considerazione. Espressione dell antigene CD19 In quanto antigene di linea per le LAL-B, il CD19 è risultato positivo in tutti i 451 casi di LAL-B analizzati con un valore mediano di percentuale di positività pari all 82% (range 20-98%) e con modalità di espressione omogenea sull intera popolazione leucemica senza alcuna differenza tra i diversi sottogruppi immunologici identificati (Tabella 3a). Prendendo in considerazione i parametri per la valutazione dell intensità di espressione, i valori di MFI ed ABC sono risultati rispettivamente valutabili in 247/451 casi (54.8%) ed in 49/451 casi (10.9%). Sulla base di tali parametri, l analisi dell espressione di questo antigene in associazione ai differenti sottogruppi immunologici, non ha evidenziato alcuna differenza quando venivano confrontati fra loro i casi di LAL pro-b, con quelli di LAL B-common, pre-b e B matura (Tabella 3b). Espressione dell antigene CD20 La presenza dell antigene CD20 è stata valutata in 450 dei 451 casi di LAL-B analizzati con una positività rilevata in 137/450 casi (30.4%). I casi risultati positivi potevano a loro volta suddividersi in due differenti sottogruppi sulla base della percentuale delle cellule CD20+ nell ambito della popolazione di cellule patologiche. Tale caratteristica è risultata ricorrente anche quando veniva esaminata la presenza di tale antigene nell ambito delle differenti sottoclassi immunologiche. In particolare, mentre tutti i casi di LAL pro-b risultavano essere negativi per la presenza del CD20, tutti i 7 casi di LAL-B matura presentavano una positività a tale antigene con una espressione sull intera popolazione di cellule patologiche. Nei rimanenti due sottogruppi immunologici, i casi CD20 positivi mostravano una espressione bimodale come riflesso di una eterogeneità antigenica (Figura 2, Tabella 3a). In 91 dei 137 casi positivi alla valutazione del CD20 (66.4%) è stata valutata anche l intensità di espressione antigenica in termini di MFI relazionandola ai differenti sottotipi immunologici. 46

47 Da tale analisi è emerso un incremento nei livelli di espressione dell antigene CD20 in accordo con il processo maturativo linfoide B con valori di MFI inferiori nel sottogruppo delle LAL B-common quando comparati con i valori di MFI rilevati nei casi con LAL pre-b e LAL B matura (Figura 3, Tabella 3b). In una più piccola coorte di pazienti CD20 positivi (24/137, 17.5%) è stata valutata l intensità di espressione antigenica analizzando i valori di ABC. Sebbene l analisi ha riguardato gruppi numericamente esigui di pazienti (22 casi di LAL B-common e 2 casi di LAL pre-b), essa ha fornito risultati che confermavano quanto emerso dall analisi dei valori di MFI: il gruppo delle LAL B-common presentava valori mediani di ABC inferiori a quelli ottenuti nel più maturo sottogruppo delle LAL pre-b (Tabella 3b) Espressione dell antigene CD22 La presenza dell antigene CD22 è stata analizzata in 427 dei 451 casi di LAL-B con una positività evidenziabile in 397/427 casi (93%). Così come riportato per l antigene CD20, i casi positivi per l espressione del CD22 potevano essere a loro volta suddivisi in due sottogruppi. L uno predominante e costituito da quei casi che esprimevano l antigene sull intera popolazione di cellule leucemiche e l altro costituito dai casi che esprimevano tale antigene solo su una percentuale della popolazione patologica (Figura 2, Tabella 3a). Analogamente a quanto osservato per il CD20, stesse considerazioni possono essere effettuate con rispetto all espressione del CD22 in associazione ai differenti sottotipi immunologici, con un registrato incremento della percentuale dei casi positivi dal gruppo delle LAL pro-b fino alle LAL-B mature in accordo con il processo maturativo delle cellule linfoidi B (Figura 3, Tabella 3a). Riguardo la valutazione dell intensità di espressione antigenica, i valori di MFI sono stati analizzati in 206 dei 397 casi positivi a tale antigene (51.9%) con un incrementato livello di espressione dallo stadio pro-b a quello B-maturo (Tabella 3b). Inoltre, in 81/397 casi CD22 positivi (20.4%) sono stati valutati anche i valori di ABC. Tali dati risultavano però disponibili solo per casi di LAL pro-b, B-common e pre-b mentre in nessuno dei casi di LAL- B matura era stato possibile valutare tale parametro. Ciononostante i risultati ottenuti riflettevano l andamento riscontrato dall analisi dei valori di MFI (Tabella 3b). Espressione dell antigene CD33 La valutazione dell espressione dell antigene CD33 nell ambito dei 451 casi di LAL-B è stata eseguita in 440 pazienti; esso è risultato positivo in 112/440 casi (25.5%). Così come già sottolineato per gli altri antigeni - eccetto che per il CD19 i casi positivi potevano a loro volta 47

48 suddividersi sulla base della proporzione di cellule leucemiche ad esso positive rispetto al totale della popolazione leucemica (Figura 2, Tabella 3a). Prendendo in considerazione i sottotipi immunologici, quello delle LAL B-common comprendeva la più elevata percentuale di casi positivi per l antigene CD33 (29.5%) mentre frequenze inferiori si registravano nell ambito delle LAL pre-b (16.7%) ed ancor più delle LAL B mature dove nessuno dei 7 casi risultava positivo al CD33. Così come per gli altri antigeni, anche per il CD33 sono stati valutati i livelli di intensità di espressione sia in termini di MFI che di ABC rispettivamente in 51/112 casi (45.5%) ed in 34/112 casi (30.3%), senza però alcuna evidenza di espressione differenziale tra i differenti sottogruppi immunologici (Tabella 3b). L antigene CD33 è stato inoltre esaminato anche nell ambito delle LAL-T, in 97 dei 101 casi di LAL-T identificati (96%) con una piccolissima percentuale di casi positivi a tale antigene. Esso risultava espresso sulla intera popolazione leucemica solo in 6 dei 97 casi valutati (6.2%) che comprendevano 3 early-t, 1 caso di LAL pro-t ed 1 caso di T-corticale. Altri 6/97 casi (6.2%), comprendenti 4 casi di early-t, 1 caso di LAL pro-t ed 1 caso di T-corticale, esprimevano invece tale antigene solo su una percentuale della popolazione patologica totale (Figura 2). Nell insieme, la presenza dell antigene CD33 è stata riscontrata nel 12.4% delle LAL-T analizzate, con una positività sempre presente in tutte le LAL pro-t e mai riscontrata nell ambito del sottogruppo delle early-t. Infine, rispettivamente in 8 (66.6%) ed in 7 (58.3%) dei 12 casi CD33 positivi sono stati valutati i livelli di espressione antigenica in termini di MFI ed ABC senza alcuna differenza evidenziabile in associazione ai differenti sottogruppi immunologici. Espressione antigenica ed alterazioni molecolari L espressione antigenica valutata sia come incidenza che come intensità, è stata correlata in questo studio anche con l eventuale presenza di alterazioni cromosomiche specifiche presenti in corso di LAL. Da questa analisi è emerso come l antigene CD19 sempre espresso nelle LAL-B, non mostri particolari patterns di espressione antigenica. Analogamente, nessuna differenza in termini di frequenza ed intensità valutata mediante valori di MFI è stata osservata in merito all espressione dell antigene CD20 rispetto alla presenza o meno di specifici trascritti di fusione. In questo ambito, quando venivano però considerati i livelli di espressione antigenica come valori di ABC, nell ambito delle LAL B-common, si evidenziava una differenza di espressione tra i casi positivi per i geni di fusione (ed in particolare quelli con trascritto BCR/ABL ed E2A/PBX1) e quelli senza trascritti noti con livelli significativamente maggiori di ABC nei casi positivi (p=0.05). Con 48

49 riferimento all espressione dell antigene CD22 da questa analisi è emerso come nell ambito del sottogruppo delle LAL pro-b nel quale ricadevano tutti i 23 casi positivi per il gene di fusione MLL/AF4, solo 3 di questi esprimevano il CD22 sull intera popolazione patologica mentre i rimanenti 20 casi risultavano negativi o esprimevano l antigene solo su una piccola percentuale delle cellule leucemiche totali. Risultati differenti si ottenevano quando venivano considerati i 31 casi di LAL pro-b negativi per il gene di fusione MLL/AF4. Essi infatti esprimevano per la maggior parte l antigene CD22 su tutta la popolazione leucemica e solo in 6 casi si registrava una espressione parziale dell antigene. In aggiunta a ciò, sempre nel contesto della valutazione dell espressione del CD22, quando venivano estrapolati solo i casi positivi per il gene di fusione BCR/ABL, veniva meno l incremento di espressione antigenica osservata quando si analizzava l intera serie di casi di LAL-B, in relazione al profilo maturativo linfoide B. Infatti, i valori mediani di MFI risultavano maggiori nel gruppo delle LAL B-common rispetto al gruppo delle più mature LAL pre-b: 70.5 (range ) e 44.5 (range ) rispettivamente. L intuizione sul fatto che la presenza del gene di fusione BCR/ABL potesse influenzare l espressione dell antigene CD22 è stata ulteriormente confermata dai risultati ottenuti nei casi che non presentavano aberrazioni cromosomiche. Infatti, in questo gruppo di pazienti si osservava un incremento dell intensità di espressione dell antigene CD22 in accordo con il processo maturativo linfoide B con valori mediani di MFI pari a 63.5 (range ) nel sottogruppo delle LAL B-common e pari a (range ) nel sottogruppo delle LAL pre-b. Le stesse differenze, non si evidenziavano però quando venivano comparati i valori di ABC con le alterazioni molecolari presenti. Infine, una differente percentuale di casi positivi all antigene CD33 veniva evidenziata nell ambito dei differenti sottogruppi con specifici trascritti di fusione. Il 34% dei casi CD33 positivi si collocava all interno dei casi BCR/ABL positivi, il 7% tra i casi E2A/PBX1 positivi ed il 7% tra i casi TEL/AML1 positivi mentre nessun caso CD33 positivo ricadeva nei gruppi positivi ai geni di fusione MLL/AF4 ed MLL/ENL (Figura 4). Inoltre, se venivano comparati fra loro i casi geneticamente negativi con quelli geneticamente positivi, si riscontravano significative differenze in termini di MFI ed ABC con più elevati livelli di espressione antigenica nei casi che non presentavano traslocazioni cromosomiche note (MFI: p=0.05; ABC: p=0.02). Al contrario, nessuna differenza di espressione antigenica, valutata sia come MFI che come ABC, veniva osservata quando si consideravano le caratteristiche genetiche nell ambito dei casi con diagnosi di LAL-T. 49

50 DISCUSSIONE L utilizzo di terapie che prevedono la somministrazione di AcMo sta via via ricoprendo un ruolo sempre maggiore nella gestione di pazienti con patologie ematologiche e non. Nell ambito specifico delle leucemie acute, l utilizzo di AcMo ha svolto e continua a svolgere un ruolo estremamente importante in particolare nel trattamento dei casi affetti da LAM. Alla luce degli entusiasmanti risultati ottenuti in questo ambito, un interesse sempre maggiore è rivolto verso la possibilità di un loro utilizzo anche nell ambito delle LAL. Ciononostante, resta ancora molto da comprendere circa l efficacia di questi agenti e la chiara definizione dei meccanismi attraverso i quali essi esplicano la loro attività. E ormai chiaro come terapie che prevedano la somministrazione del solo AcMo possano determinare una remissione completa di malattia solo in rari casi (Morris ES and Vora A, Br J Haematol 2007), come a suggerire l importanza di una loro associazione con regimi chemioterapici specifici per ciascuna patologia. In questo contesto, una approfondita conoscenza di come particolari antigeni, per i quali sono disponibili AcMo, vengano espressi a livello cellulare, può essere estremamente utile per una più precisa caratterizzazione della popolazione leucemica in ciascun paziente e quindi per un più razionale inserimento di tali AcMo in un ben preciso algoritmo terapeutico. A questo scopo si è voluta valutare, in una ampia serie di casi con diagnosi di LAL, l espressione di specifici antigeni, per i quali sono disponibili AcMo per utilizzo clinico, correlandola con l età dei pazienti presi in considerazione, con i differenti sottotipi immunologici, nonché con la presenza o meno di eventuali aberrazioni cromosomiche note. Tra i diversi antigeni presi in considerazione, il CD19 rappresenta un interessante target nell ambito delle patologie ematologiche se si considera la sua diffusa espressione sia nelle forme leucemiche che linfomatose (Horton HM et al, Cancer Res 2008). In merito ad esso, i dati emergenti da questo studio mettono in evidenza una positività in tutti i casi presi in considerazione senza alcuna differenza di espressione nell ambito dei vari sottogruppi di pazienti. Ciononostante, l utilizzo di AcMo anti-cd19 potrebbe comunque rappresentare una opzione terapeutica di rilievo in quei casi affetti da patologie linfoidi B indifferenziate che non mostrando alcuna positività per l antigene CD20, non potrebbero beneficiare di trattamenti con AcMo anti-cd20. Ad oggi, è riconosciuta l attività e l efficacia di diversi AcMo anti-cd19 e tra questi, quelli dotati di attività bi-specifica sembrerebbero fornire risultati particolarmente incoraggianti. In particolare, i primi risultati positivi ottenuti con l anticorpo bi-specifico, anti-cd19 anti-cd3, Blinatumomab, nei pazienti affetti da linfoma non-hodgkin B recidivati dopo terapie standard (D'Argouges S et al, 50

51 Leuk Res 2009), fanno di tale anticorpo un promettente candidato per il trattamento di altre patologie a carico delle cellule linfoidi B. Infatti, studi di fase II condotti utilizzando tale AcMo hanno dimostrato una completa remissione molecolare di malattia in pazienti affetti da LAL-B dei precursori, che risultavano in fase di remissione ematologica completa ma con persistente o altalenante presenza di malattia minima residua dopo terapia di consolidamento (Topp M et al, ASH 2010, Abstract # 174; Topp M et al, EHA 2009, Abstract # 0482). Con riguardo agli antigeni CD20 e CD22, da questa analisi sono emerse percentuali complessive di positività, rispettivamente pari al 93% ed al 30% dei casi analizzati, esattamente in linea con quanto già precedentemente pubblicato (Thomas DA et al, Blood 2009; Stanciu-Herrera C et al, Leuk Res 2008). Un importante concetto emerso da questa analisi riguarda la relazione esistente tra la percentuale di positività delle cellule per un dato antigene ed i valori di MFI. E stato infatti osservato come i casi che presentavano un espressione degli antigeni CD20 e CD22 solo su una percentuale della popolazione leucemica mostravano anche più bassi valori di MFI quando comparati con i casi che invece esprimevano tali antigeni su tutta la popolazione patologica. In particolare, per entrambi gli antigeni considerati, è stata evidenziata una stretta associazione tra il loro livello di espressione, inteso sia come percentuale dei casi positivi che come valori di MFI ed ABC, ed il profilo maturativo linfoide delle cellule B con un incrementato livello di espressione registrato nel passaggio dal gruppo dei casi con LAL pro-b a quelli con LAL B-matura. Sebbene l impatto che tale trend di espressione possa ricoprire nell ambito della potenziale efficacia di trattamenti immunoterapici con AcMo anti-cd20 o anti-cd22 non sia ancora ben chiaro, tali osservazioni potrebbero svolgere un ruolo rilevante nel contesto di uno specifico utilizzo di tali agenti in momenti particolari del processo maturativo cellulare. A riguardo, studi in vitro ed in vivo effettuati utilizzando linee cellulari di LAL pre-b hanno dimostrato un incremento dell efficacia della chemioterapia quando si utilizzavano AcMo anti-cd22 combinati con anti-cd19 (Stanciu- Herrera C et al, Leuk Res 2008). Analogamente, in un altro lavoro condotto su una casistica pediatrica, si dimostrava come il trattamento con Epratuzumab in fase di reinduzione in aggiunta alla chemioterapia standard, risultava fattibile, ben tollerato e con buoni risultati nei casi in recidiva di LAL-B con espressione dell antigene CD22 (Raetz EA et al, J Clin Oncol 2008). Accanto a ciò, l aggiunta di AcMo anti-cd20, quali il Rituximab, alla chemioterapia intensiva in soggetti adulti affetti da LAL, sembrerebbe incrementare la sopravvivenza libera da malattia (disease-free servival, DFS) nonchè l outcome dei casi positivi all antigene CD20 (Thomas DA et al, ASH 2007, Abstract # 2824; Hoelzer D et al, EHA 2009, Abstract # 0481; Hoelzer D et al, ASH 2010, Abstract # 170). Ad ogni modo, con l eccezione dei casi con linfoma di Burkitt dove è ampiamente descritta l efficacia di tali agenti (Thomas DA et al, Cancer 2006), non sono presenti 51

52 altri dati sull utilizzo specifico di AcMo anti-cd20 nei casi di LAL-B in associazione ai differenti livelli di espressione o allo stadio maturativo cellulare. Al contrario, la dimostrazione della presenza di una up-regolazione dell espressione dell antigene CD20 in seguito a trattamento con farmaci corticosteroidi, potrebbe fornire un importante razionale per l inclusione di AcMo anti-cd20 eventualmente nelle fasi successive all esordio di malattia, laddove alla diagnosi il paziente risultava negativo a tale antigene o lo esprimeva con minore intensità (Dworzak MN et al, Blood 2008; Watt TC et al, ASH 2010, Abstract # 2124; Dworzak MN et al, Cytometry Part B 2010). L analisi dell espressione dell antigene CD33 nella serie oggetto di tale studio, ha fornito risultati in linea con quanto già riportato dal nostro gruppo (Vitale A et al, Haematologica 2007). Tale antigene risultava maggiormente espresso nei casi di LAL-B con una frequenza del 25% rispetto ai casi di LAL-T dove la frequenza risultava pari al 12%, con valori di MFI che, così come evidenziato per gli antigeni CD20 e CD22, riflettevano la percentuale di cellule leucemiche CD33 positive. Inoltre, è stata osservata una maggiore espressione del CD33 nel sottogruppo delle LAL B-common come a suggerire una correlazione tra l espressione antigenica e la classificazione immunologica dei pazienti affetti da LAL. Con riguardo al gruppo delle LAL-T, gli unici casi risultati positivi erano i 7 pazienti con early-t, mentre tutti gli altri risultavano negativi all antigene CD33. Sulla base di tali dati, l utilizzo dell AcMo Gemtuzumab Ozogamicin (GO), un anti-cd33 ampiamente utilizzato nel trattamento dei casi di LAM, potrebbe potenzialmente mostrare una significativa attività ed efficacia anche nei casi di LAL positivi all antigene CD33. A tal proposito, risultati incoraggianti sono stati riportati in casistiche pediatriche di LAL CD33 positive (Cotter M et al, Br J Haematol 2003; Zwaan CM et al, Leukemia 2003) mentre restano ancora scarse le esperienze in merito alla fattibilità della somministrazione di GO in combinazione con farmaci chemioterapici nei pazienti adulti (Chevallier P et al, Int J Hematol 2008). Ad ogni modo, considerata anche la recente sospensione dal commercio di tale farmaco a causa dei suoi potenziali effetti tossici, molti studi restano necessari per meglio chiarire l impatto clinico derivante dal suo utilizzo. L assenza in letteratura di studi che descrivono eventuali correlazioni tra età, importante fattore prognostico nell ambito delle LAL, e presenza di particolari profili di espressione antigenica, ha reso ancor più interessante l analisi dei pazienti sotto tale profilo. Da questa analisi è emerso che l espressione di tutti gli antigeni considerati, sia come incidenza che come livello di intensità di espressione, non mostrava alcun pattern specifico in relazione all età dei pazienti analizzati. Oltre ciò, è ben noto come uno dei fattori prognostici importanti utilizzati per l identificazione di gruppi di pazienti con rischio biologico diverso, sia la presenza di particolari aberrazioni geneticomolecolari. Per queste ragioni, in questo studio è stata anche verificata l eventuale associazione tra presenza/assenza di specifiche traslocazioni cromosomiche e valutazione citofluorimetrica 52

53 dell espressione antigenica. I risultati hanno evidenziato, in merito all antigene CD22, una parziale espressione o totale assenza in tutti i casi con presenza del gene di fusione MLL/AF4. Al contrario, la maggior parte dei casi CD22 positivi senza traslocazioni cromosomiche note, esprimevano tale antigene su tutta la popolazione patologica, come a suggerire una possibile associazione tra le LAL MLL/AF4 positive ed uno specifico trend di espressione del CD22. Inoltre, essa sembra essere influenzata anche dalla presenza del gene di fusione BCR/ABL. Infatti, l incremento dell intensità di espressione osservato in associazione al profilo maturativo linfoide B quando venivano analizzati tutti i casi complessivamente, non veniva più rispettato se si estrapolavano solo i pazienti positivi per il gene di fusione BCR/ABL con livelli di espressione del CD22 maggiori nel gruppo delle LAL B-common rispetto alle più mature LAL pre-b. Sulla base di tali risultati, l utilizzo di AcMo anti- CD22 non sembrerebbe indicato nei casi positivi per il gene di fusione MLL/AF4 mentre potrebbe essere seriamente considerato nel trattamento dei casi di LAL B-common BCR/ABL positivi. Con riferimento all antigene CD33, questa analisi ha evidenziato una maggiore percentuale di casi positivi (34%) nell ambito dei casi BCR/ABL positivi rispetto ai casi caratterizzati da altri geni di fusione noti, ribadendo la già descritta associazione tra la presenza di tale antigene e la presenza della t(9;22)(q34;q11) (Tabernero MD et al, Leukemia 2001). Presi insieme, i risultati provenienti dall analisi di una così vasta serie di casi pur non avendo evidenziato particolari differenze fenotipiche associate alle diverse fasce di età, hanno messo in evidenza per la prima volta specifici trends di espressione antigenica in associazione al processo differenziativo linfoide e/o alla presenza/assenza di aberrazioni cromosomiche note suggerendo la possibilità di considerare tali differenze per il possibile utilizzo clinico di specifici AcMo. Ulteriori studi saranno necessari per comprendere a fondo l ipotizzata correlazione tra l espressione antigenica e l efficacia terapeutica di tali molecole. 53

54 Figura 1: Esempio del meccanismo d azione degli anticorpi monoclonali. Nella figura sono rappresentati i principali pathways attivati da anticorpi anti-cd Essi sono in grado di indurre apoptosi mediante attivazione delle caspasi e di proteine ad attività pro-apoptotica. 2. Diversi studi in vitro hanno inoltre dimostrato l abilità di tali molecole di indurre una lisi complemento-mediata delle cellule patologiche. 3. Infine, essi sarebbero in grado di reclutare cellule effettrici esprimenti recettori Fcγ, le quali eserciterebbero funzione citotossica nei confronti della cellula tumorale (Cartron G et al, Blood 2004). 54

55 Tabella 1: Suddivisione dei pazienti nelle quattro differenti fasce di età (dati disponibili in 538/552 casi). Fascia di età LAL-B LAL-T (anni) n=441 n= (16%) 10 (10%) (14%) 16 (17%) (59%) 66 (68%) (11%) 5 (5%) Tabella 2: Combinazioni di AcMo utilizzate in questo studio per determinare i valori di MFI ed ABC per ciascuno degli antigeni presi in considerazione. L ordine di ciascun anticorpo nella combinazione rispetta la coniugazione con i rispettivi fluorocromi: FITC, PE, PerCP, APC. Antigene MFI ABC CD19 CD38/CD10/CD34/CD19 CD45/CD19/CD34/LDS CD20 CD10/CD20/CD34/CD19 CD10/CD20/CD34/CD19 CD22 CD10/CD22/CD34/CD19 CD10/CD22/CD34/CD19 CD33 (LAL-B) CD10/CD33/CD34/CD19 CD10/CD33/CD34/CD19 CD33 (LAL-T) CD7/CD33/CD34/CD5 CD7/CD33/CD34/CD5 55

56 Tabella 3: a) Espressione antigenica quantitativa (percentuali di espressione) in associazione ai differenti sottotipi immunologici; b) espressione antigenica qualitativa (valori di MIF ed ABC) in relazione ai differenti sottotipi immunologici. a) CD19 Numero di casi CD20 Numero di casi CD22 Numero di casi CD33 Numero di casi Casi positivi/casi esaminati Espressione antigenica totale 451/451 53/450 (11.8%) 341/427(79.9%) 39/440 (8.9%) Espressione antigenica parziale - 84/450 (18.6%) }30.4% 56/427 (13.1%) }93% 73/440 (16.6%) }25.5% Casi negativi/casi esaminati LAL pro-b - 313/450 (69.6%) 30/427 (7%) 328/440 (74.5%) Espressione antigenica totale 54/54-28/54 (52%) 9/52 (17%) }83% Espressione antigenica parziale /54 (31%) 3/52 (6%) }23% LAL B-common Casi negativi - 54/54 9/54 (16.7%) 40/52 (76.9%) Espressione antigenica totale 295/295 26/294 (8.8%) 236/277 (85.2%) 23/288 (8%) }29.5% }96.4% Espressione antigenica parziale - 61/294 (20.7%) 31/277 (11.2%) 62/288 (21.5%) }29.5% LAL pre-b Casi negativi - 207/294 (70.4%) 10/277 (3.6%) 203/288 (70.5%) Espressione antigenica totale 91/91 20/91(22%) 72/86 (83.8%) 7/90 (7.8%) Espressione antigenic aparziale - 22/91 (24.2%) }46.2% 7/86 (8.1%) }91.9% 8/90 (8.9%) }16.7% LAL B-mature Casi negativi - 49/91 (53.8%) 7/86 (8.1%) 75/90 (83.3%) Espressione antigenica totale 7/7 7/7 5/6 (83.3%) - }100% Espressione antigenica parziale - - 1/6 (16.7%) - LAL B non classificabili Casi negativi /6 Espressione antigenica totale 4/4 1/4 (25%) - - Espressione antigenica parziale Casi negativi - 3/4 (75%) 4/4 4/4 56

57 b) CD19 CD20 CD22 CD33 LAL-B LAL pro-b LAL B-common LAL pre-b LAL B-mature MIF Casi studiati/ casi positivi totali (%) 247/451 (54.8%) 91/137 (66.4%) 206/397 (51.9%) 51/112 (45.5%) ABC Casi studiati/ casi positivi totali (%) 49/451 (10.9%) 24/137 (17.5%) 81/397 (20.4%) 34/112 (30.3%) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 29/54-23/45 5/12 MIF Valore mediano di MIF (range) 97 (25-263) (12-109) 97 (32-209) ABC MIF ABC MIF ABC MIF ABC Casi studiati/ casi positivi totali (%) 7/54-6/45 - Valore mediano di ABC (range) 2784 ( ) ( ) - Casi studiati/ casi positivi totali (%) 157/295 52/87 131/267 39/85 Valore mediano di MIF (range) 101 (18-400) 66 ( ) 69.5 (11-374) 32 (9-128) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 30/295 22/87 59/267 27/85 Valore mediano di ABC (range) 3606 ( ) 1640 ( ) 2356 ( ) 1094 ( ) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 59/91 36/42 50/79 7/12 Valore mediano di MIF (range) 112 (38-258) 96.5 ( ) 99 (11-951) 32 (19-176) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 12/91 2/91 16/79 7/15 Valore mediano di ABC (range) 3135 ( ) ( ) ( ) 2128 ( ) Casi studiati/ casi positivi totali (%) 2/7 3/7 2/6 - Valore mediano di MIF (range) 98 (46-150) 114 (90-264) ( ) - Casi studiati/ casi positivi totali (%) Valore mediano di ABC (range)

58 Figura 2: Espressione degli antigeni CD20, CD22 e CD33. Sulla prima linea sono rappresentati esempi di casi negativi; sulla seconda casi con espressione antigenica parziale; sull ultima riga casi esprimenti l antigene sull intera popolazione leucemica. I valori di MFI riportati riflettono esattamente le percentuali di cellule leucemiche positive all antigene. Figura 3: Espressione degli antigeni CD20 e CD22 come valore mediano di MFI, in relazione al profilo maturativo linfoide B. 58

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