Terapia genica. Dipartimento di Medicina Molecolare Università degli Studi di Padova. Dott.ssa Marta Trevisan, PhD

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1 Terapia genica Dipartimento di Medicina Molecolare Università degli Studi di Padova Dott.ssa Marta Trevisan, PhD

2 Terapia genica: parametri Scelta del gene terapeutico: geni che codificano proteine, oligonucleotidi con funzione antisenso, ribozimi e sirna, RNA decoy, RNA con funzione di aptameri. Modalita di somministrazione dei geni terapeutici: trasferimento ex vivo o in vivo.

3 Gene therapy approaches

4 Considerazioni dell approccio in vivo: 1) in vivo molti tessuti sono difficili da raggiungere 2)e difficile evitare di trasferire il gene terapeutico in tipi cellulari diversi dalla cellula bersaglio 3) il vettore quando somministrato direttamente puo essere inattivato o ci puo essere una risposta del sistema immunitario 4) la maggior parte delle cellule nel nostro organismo sono in uno stato di quiescienza replicativa.

5 Terapia genica: parametri Scelta del gene terapeutico: geni che codificano proteine, oligonucleotidi con funzione antisenso, ribozimi e sirna, RNA decoy, RNA con funzione di aptameri. Modalita di somministrazione dei geni terapeutici: trasferimento ex vivo o in vivo. Sistemi di trasferimento genico: metodi fisici o chimici, virus. Targeting cellulare: indirizzamento specifico del gene terapeutico in una determinata cellula bersaglio (anticorpi monoclonali, capsidi virali). Persistenza del gene terapeutico: in dipendenza della patologia e del metodo scelto per il trasferimento (ex. Patologie monogeniche> espressione permanente, tipo di vettore) Espressione del gene terapeutico: livelli di espressione elevati e persistenti. Risposta immunitaria alla terapia genica: suscitata dalla metodologia di trasferimento genico o dal gene terapeutico.

6 Gli elementi necessari sono 2: 1) GENE TERAPEUTICO 2) VETTORE PER IL TRASFERIMENTO Gene terap.

7 Geni codificanti proteine: Proteine sostitutive di proteine cellulari assenti o mutate; Proteine che modulano funzioni cellulari; Fattori di crescita secreti e citochine; Proteine che regolano la sopravvivenza cellulare e l apoptosi; Antigeni per la vaccinazione; Anticorpi e anticorpi intracellulari; Subunita del T-cell receptor (TCR) Acidi nucleici non codificanti: Oligonucleotidi; Oligonucleotidi modificati; Acidi nucleici catalitici; Piccoli RNA con funzione regolatoria (sirna, microrna) Decoy Aptameri

8 Dimensione media dei geni codificanti proteine: 27 kb Dimensione media dei cdna: 2.5 kb Dimensione media della porzione codificante dei cdna: 1.5 kb Mancanza degli elementi regolatori che regolano la stabilita, il trasporto, la localizzazione cellulare e l efficienza di traduzione degli mrna cellulari.

9 Geni codificanti proteine Proteine sostitutive di proteine cellulari assenti o mutate: la proteina da esprimere puo svolgere la sua funzione all interno della cellula (distrofina), o sulla sua superficie (CFTR), o puo essere secreta nell ambiente extracellulare e veicolata nella circolazione (fattori della coagulazione). Proteina che modulano funzioni celluari: es. Proteine in grado di indurre l arresto della proliferazione cellulare o in grado di inbire l azione di proteine virali. Proteine co-stimolatorie, poco espresse nei tumori per evadere il sistema immunitario.

10 Geni codificanti proteine Fattori di crescita secreti e citochine: secreti dalla cellula, esercitano vari effetti su altre cellule vicine o distanti (terapia genica dei tumori, geni che codificano per proteine in grado di attivare le cellule del SI o di malattie neurodegenerative e cardiovascolari). Proteine che regolano la sopravvivenza cellulare e l apoptosi: per patologie neurodegenerative o tumorali. Antigeni per la vaccinazione: somministrazione di geni che codificano antigeni virali o tumorali contro cui si desidera stimolare l attivazione del sistema immunitario.

11 Geni codificanti proteine

12 Geni codificanti proteine Subunita del T-cell receptor (TCR) e Immunoterapia adottiva Una maniera alternativa di modulare le funzioni del SI e quella di trasferire all interno dei linfociti T geni che codificano proteine in grado di indirizzare queste cellule verso antigeni specifici. Si coltivano ex vivo I Lt dei pazienti e si trasferiscono al loro interno i geni che codificano per le catene a e b delle molecole del T-cell Receptor (TCR) derivati dai cloni di cellule T in grado di riconoscere, rispettivamente le cellule tumorali o le cellule infettate da virus.

13 Limitazioni dei TCR Ciascun TCR riconosce in maniera selettiva uno specifico complesso peptide/mhc Quindi ogni vettore che esprime un TCR e funzionale solo negli individui che condividono le stesse molecole MHC Le catene del TCR introdotte per via esogena nelle cellule CD8+ potrebbero complessarsi con quelle endogene, cambiando la specificita di bersaglio. Soluzioni Utlizzo di TCR a singolo filamento, che prevedono il mis-accoppiamento tra le catene a e b. TCR ricombinanti che corrispondono alla fusione di un anticorpo a singolo filamento con la catena z del TCR, in modo da svincolare il riconoscimento dell antigene dalla specificita MHC (Tbody).

14 6 principali categorie: -oliogonucleotidi modificati chimicamente e non; -piccoli RNA e DNA con funzione catalitica (ribozimi e DNAzimi); -piccoli RNA con funzione regolatoria (sirna e microrna); -RNA e DNA con funzione di decoy; -aptameri.

15 Acidi nucleici non codificanti Oligonucleotidi: -oligonucleotidi antisenso che inibiscono l espressione genica: molecola di DNA (17-22 nt) complementare all mrna del gene di interesse, blocco della traduzione, stimolo alla degradazione (Rnasi H); -oligonucleotidi antisenso che modulano lo splicing: si attua un exon skipping trattando con ASO complementari ai segnali che regolano lo splicing del premrna del gene); -oligonucleotidi che stimolano la formazione di strutture a tripla elica (la sequenza bersaglio e nel promotore di un gene, si lega al solco maggiore del DNA impedendone la trascrizione grazie alla struttura a tripla elica); -oligonucleotidi per indurre la correzione di mutazioni puntiformi (sequenza omologa a quella del DNA per sostituire mutazioni puntiformi). Oligonucleotidi modificati: Modificazioni di tipo chimico per ovviare alla rapida degradazione de parte delle DNAsi.

16 Acidi nucleici non codificanti Acidi nucleici catalitici: Ribozimi e DNAzimi Gli RNA di alcuni organismi possiedono attivita enzimatica avendo la capacita di catalizzare il taglio dei legami fosfodiesterici presenti sulla propria o su altre molecole di RNA (Ribozimi). Per questi, il taglio dipende dal precedente appaiamento specifico con l RNA bersaglio, quindi si puo incorporare il core catalitico all interno di una molecola antisenso che ne dirige la funzione enzimatica su specifici mrna cellulari o virali, determinandone la distruzione. A differenza degli ASO I ribozimi sono dotati di vera attivita enzimatica e dopo il taglio vengono riciclati per successivi cicli di appaiamento. Una variante non naturale dei ribozimi sono I DNAzimi, in cui l acido nucleico e DNA invece che RNA. Il vantaggio e legato alla maggiore stabilita del DNA rispetto all RNA.

17 Acidi nucleici non codificanti Piccoli RNA con funzione regolatoria (sirna e microrna) mirna -Generati dalla cellula a partire da RNA cellulari -Codificati da regioni di DNA (introni o regioni intergeniche. -Trascritti dalla RNA polimerasi II (pri-mirna) -Pri-miRNA processati nel nucleo dall enzima Drosha -I Pre-miRNA hanno una struttura a stem loop di circa nucleotidi -Vengono trasportati nel citoplasma e processati da un DICER per generare i mirna maturi

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20 Comparison of sirna and mirna properties

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22 DECOY Piccole molecole di DNA o RNA contenenti un sito di legame per una determinata proteina Quando presenti in alte concentrazioni nella cellula si legano a questa sottraendola alle sue funzioni normali.

23 Aptameri Sfruttano la struttura secondaria degli acidi nucleici anziché la complementarietà della loro sequenza. Corti frammenti di RNA, nt Si legano al bersaglio e lo sottraggono alle funzioni cellulari Sono più semplici da produrre degli anticorpi

24 Gli elementi necessari sono 2: 1) GENE TERAPEUTICO 2) VETTORE PER IL TRASFERIMENTO Gene terap.

25 To integrate or not to integrate?

26 Barriere cellulari al trasferimento genico. -In condizioni normali, il doppio foglietto fosfolipidico, apolare e idrofobico, di cui e composta la membrana plasmatica della cellula, costituisce una barriera impermeabile alle macromolecole polari di grandi dimensioni, quali il DNA o l RNA. -A ph fisiologico, I fosfati dello scheletro fosfo-glucidico degli acidi nucleici sono deprotonati, quindi dotati di un uniforme carica negativa. -L entrata di questi poli-anioni nelle cellule deve essere quindi facilitata: Metodi Fisici Metodi Chimici Virus

27 Delivery di geni con vettori non virali La terapia genica richiede vettori sicuri ed efficienti per il trasporto e il delivery degli acidi nucleici a specifici tipi cellulari. Per la loro indubbia efficienza, i vettori virali sono stati utilizzati in molti studi clinici, con una significativa percentuale di successo. Tuttavia, l uso terapeutico dei virus come sistema di delivery è piuttosto controverso, a causa degli effettivi rischi di ricombinazione e integrazione col DNA ospite, e di reazioni infiammatorie e immunitarie gravi. Inoltre, i vettori virali devono essere in grado di superare le barriere biologiche: eventuali risposte immunitarie innescate da precedenti infezioni o vaccinazioni possono impedire al vettore di raggiungere l obbiettivo. In questo contesto, si stanno studiando strategie alternative per la costruzione di vettori più sicuri, e nuovi sistemi di delivery per i vettori non virali tradizionali.

28 INOCULAZIONE DIRETTA DI DNA E RNA DIVERSI TIPI CELLULARI SONO IN GRADO DI INTERNALIZZARE SPONTANEAMENTE CORTE MOLECOLE DI RNA O DNA (ASO, DECOY, sirna), MEDIANTE UN PROCESSO DI ENDOCITOSI ATTIVA MEDIATA DAGLI ENDOSOMI RIVESTITI DI CLATRINA. GLI SVANTAGGI SONO LEGATI AD UN EFFICIENZA MOLTO MODESTA, EFFETTO TRANSITORIO, INTERNALIZZAZIONE LIMITATA AD ALCUNI TIPI CELLULARI (CELLULE MUSCOLARI SCHELETRICHE E CARDIACHE, APC).

29 ELETTROPORAZIONE GENE GUN JET INJECTION METODI FISICI:

30 ELECTROPORATION Elettroporazione L elettroporazione è stata sviluppata in ambito di ricerca per la veicolazione di materiale genico a un ampia gamma di cellule animali e vegetali che sono refrattarie alla trasfezione con altri metodi. Il DNA entra quando le cellule sono esposte a un campo elettrico pulsato che presumibilmente disorganizza i lipidi di membrana e crea dei pori transitori senza danneggiare la struttura di membrana. Successivamente e stata anche usata in vivo per il trasferimento genico nella cute, muscolo e nel fegato. Piu recentemente anche in altri tessuti quali rene, polmone, cuore e retina. Una delle limitazioni e legata al danno che subisce il tessuto dopo l applicazione degli impulsi elettrici. L espressione del DNA plasmidico poi e transitoria e viene persa in pochi giorni.

31 Ex vivo electroporation cells are reinjected cells obtained from skin biopsy genetically engineered cells are propagated gene introduced into cells by electroporatio n

32 GENE GUN: Il gene gun è una metodica che prevede l accelerazione ad alta velocità di particelle d oro o di tungsteno ricoperte di DNA, che penetrano così nel tessuto bersaglio. Le particelle d oro hanno dimensioni di 1-3 μm, mentre quelle di tungsteno sono leggermente più grandi (circa 4 μm); vengono ricoperte col DNA e sono in grado di attraversare la membrana plasmatica e nucleare rilasciando il DNA nel nucleo. Trova applicazione nella terapia genica in vivo di tessuti facilmente accessibili, quali la cute.

33 Vantaggi del Gene gun Indipendenza dalla formazione di un complesso biologico Indipendenza da un recettore Capacità di trasferire DNA di dimensioni diverse Indipendenza dalla presenza di DNA esogeno Possibilità di trattamenti ripetitivi

34 JET INJECTION: Consiste nell applicazione di una soluzione contenente l acido nucleico di interesse mediante un getto ad alta pressione. Capacita piu penetrante rispetto al gene gun (1 cm) Puo essere applicata per il trasferimento genico transitorio alla cute e ai tessuti sottostantil.

35 METODI CHIMICI: LIPOSOMI E LIPIDI CATIONICI POLIMERI CATIONICI

36 Liposomi liposome complex DNA endocytosis membrane fusion nucleus

37 Liposomes DNA liposome complexes

38 Lipidi cationici. Introdotti come carrier genici nel Sono molecole anfifiliche costituite da una o due catene laterali alchiliche o aciliche, un linker ed un gruppo amminico idrofilo, che interagiscono col DNA carico negativamente grazie a legami elettrostatici Un esempio è l 1,2-dioleoil-3-trimetilammonio-propano (DOTAP), che contiene due catene laterali aciliche insature, legate con legame estereo a un gruppo propilammonico. La parte idrofobica può contenere anche unità derivate dal colesterolo, o ancora si possono usare lipidi cationici multivalenti che condensano il DNA in modo molto efficiente.

39 Struttura Catena idrofobica Gruppo linker testa polare caricata positivamente (generalmente ammonio)

40 DOTMA DOTAP DMRIE Testa polare monovalente Tendenza a formare vescicole Dc-Chol DOGS DOSPA Testa polare multivalente Tendenza a formare micelle Maggior efficienza a condensare il DNA

41 In un mezzo acquoso, i lipidi cationici si assemblano in una struttura chiusa a doppio strato, il liposoma. I liposomi si organizzano spontaneamente in strutture multilamellari; vescicole unilamellari si possono ottenere per sonicazione, o con altri metodi. Il complesso liposomi/dna è solitamente indicato come lipoplesso. Alcuni studi indicano che il DNA è inserito tra le strutture liposomiali; essendo carico negativamente, esso va a neutralizzare i liposomi cationici determinandone l aggregazione e rimanendo così intrappolato. A causa della loro scarsa stabilità, i liposomi vanno somministrati subito dopo la loro formazione.

42 Liposomi cationici Caratteristiche che li rendono adeguati al trasferimento genico Interazione elettrostatica spontanea con il DNA, porta a condensazione del complesso Il lipoplex ha carica netta positiva e può interagire efficientemente con la superficie della cellula Il lipoplex ha elevata fusogenicità

43 Polimeri cationici. Questo gruppo di sistemi di delivery non biologici include qualsiasi polimero sintetico cationico (a ph fisiologico) che può essere combinato col DNA a formare un complesso particellare, in grado di trasferire il materiale genetico nelle cellule target. Poiché si tratta di composti sintetici, sono possibili molte modificazioni, tra cui il legame ad altri gruppi funzionali. I polimeri per terapia genica più ampiamente studiati includono: 1. Polimeri PEI, poli(etilenimina) 2. Polimeri PLL, poli(l-lisina)

44 1. Polimeri PEI Oggi i più usati La PEI è disponibile in forme di diversi pesi molecolari (25kDa-800kDa) Molto ramificati Formazione di complessi omogenei sferici di 100 nm Funzionano anche con molecole di DNA molto lunge Offrono alta protezione contro l azione delle nucleasi Grado di condensazione più elevato per elevata concentrazione di carica

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46 Polimeri PEI La PEI di solito è ramificata, ed ogni atomo di azoto amminico terziario risulta protonato, così che la PEI ha un forte potere tamponante (proton sponge). Questa caratteristica, e la capacità della PEI di destabilizzare le membrane lisosomiali, permette ai poliplessi con PEI di sfuggire efficacemente la degradazione nell ambiente endosomiale acido. Molti fattori influenzano il profilo di efficienza/citotossicità dei poliplessi PEI, tra cui il peso molecolare, il grado di ramificazione, la forza ionica della soluzione e le dimensioni delle particelle. Sono stati osservati effetti collaterali letali in topi a cui era stato iniettato intravena un poliplesso PEI lineare (22 KDa), in dose normalmente terapeutica. Sono necessari ulteriori studi per ottimizzare il rapporto efficienza/tossicità dei vettori PEI.

47 2. Polimeri PLL I polimeri PLL sono stati tra i primi polimeri cationici ad essere impiegati per il delivery di geni. Si tratta di polipeptidi lineari in cui l amminoacido lisina costituisce l unità ripetitiva, naturalmente biodegradabile; questa proprietà risulta molto utile per le applicazioni in vivo.

48 PLL, Poly(L-lysine) Diverse formulazioni di peso molecolare variabile E biodegradabile: OK in vivo Però dispone ancora di citotossicità I complessi sono di 100 nm Entrata cellulare molto meno efficiente che con PEI

49 I poliplessi PLL sono rapidamente legati dalle proteine plasmatiche ed eliminati dalla circolazione sanguigna. I poliplessi PLL hanno una scarsa capacità di trasfezione quando utilizzati da soli o senza modificazioni. Una delle modifiche più frequenti è la copertura con PEG, che si è dimostrata in grado di aumentare sia la capacità di trasfezione, sia l emivita in circolo. Per una trasfezione efficiente, è necessaria la co-applicazione di clorochina, un agente che riduce la degradazione lisosomiale dei poliplessi con un meccanismo ancora non ben compreso. La clorochina può essere sostituita da peptidi fusogenici, la cui conformazione dipende dal ph: il loro cambiamento conformazionale perturba le membrane lisosomiali ed endosomiali, permettendo un efficiente delivery del DNA al citoplasma.

50 Vettori non-virali

51 Vettori non-virali I problemi legati all immunogenicità dei vettori virali, alla possibilità di una loro ricombinazione e alla loro limitata capacità di trasporto del DNA terapeutico, hanno portato allo sviluppo di vettori non virali. Questi vettori usano DNA nudo codificante per una sequenza proteica ed i necessari elementi regolatori per esprimerla. il DNA viene veicolato nelle cellule con differenti tecniche, determinando la sintesi endogena della proteina codificata dalle sequenze geniche eterologhe.

52 Vettori non-virali La facilità di manipolazione genetica dei vettori a DNA nudo ha stimolato il loro uso nella terapia genica e nell immunizzazione genetica. Inoltre, l uso di DNA nudo come vettore è solitamente più economico dell uso di vettori virali. Con i vettori non-virali, il DNA non viene stabilmente integrato nel materiale genetico cromosomiale, ma persiste in forma di episomi nucleari extracromosomiali.

53 Vettori virali Si ottengono inserendo il gene di interesse nel genoma di diversi tipi di virus, sotto il controllo di un promotore forte. Il virus viene reso incapace di riprodursi autonomamente, per evitare la diffusione di virus ricombinanti (virus difettivo) Il genoma viene ingegnerizzato con le tecniche del DNA ricombinante, e trasfettato in particolari linee cellulari capaci di produrre le particelle virali ricombinanti (linee di packaging). Queste complementano i difetti introdotti nel genoma virale. Il principale vantaggio consiste nell elevata efficienza di trasduzione (fino al 100% delle cellule).

54 Alta efficienza di trasduzione Vantaggi dei vettori virali Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

55 Principi comuni dei Vettori virali 1) Rimozione, dal genoma virale, della maggior parte dei geni che codificano proteine virali (potenzialmente patogeni per la cellula); 2) Mantenimento, nel genoma virale, delle sequenze in cis indispensabili per la replicazione del virus, e in particolare, quelle che determinano l inclusione del genoma del virus nelle particelle virai (segnali di incapsidamento Ψ); 3) Espressione dei geni virali indispensabili per la replicazione del virus da parte di plasmidi trasfettati transitoriamente o integrati nel genoma delle cellule produttrici.

56 Vettori virali Virus difettivi: possono essere prodotti solo in particolari linee cellulari capaci di complementare i difetti del virus (cellule di packaging). La loro preparazione deve seguire queste fasi obbligate: 1. Costruzione del genoma ricombinante 2. Trasfezione del DNA nella linea cellulare capace di produrre le particelle virali 3. Raccolta e analisi del virus

57 Engineering a Virus into a Vector Ψ Wild-type virus cis-acting viral sequences Ψ Vector DNA Helper DNA Ψ(-) Therapeutic gene Essential viral genes Packaging cell Ψ Ψ Ψ Therapeutic protein Ψ Viral vector Structural viral proteins Barzon et al. 2005

58 Gene Transfer Ψ Viral vector No viral vector replication Ψ Therapeutic protein Target cell Barzon et al. 2005

59 Vettori virali: Caratteristiche principali Retrovirus : possono infettare solo cellule in divisione e si integrano stabilmente in maniera casuale. Lentivirus : derivati del virus dell'hiv, possono infettare cellule quiescenti e si integrano stabilmente in maniera casuale. Adenovirus: esprimono ad alti livelli, non si integrano stabilmente e danno grosse reazioni immunitarie. Virus adeno-associati (AAV): integrazione sito specifica ed espressione stabile nel tempo, difficile produrli ad alto titolo. Herpes simplex: infezione molto selettiva dei neuroni, ma importanti effetti citotossici.

60 Features of viral vector systems for their Features of viral vectors application in gene therapy

61 Retroviruses RNA viruses with a unique life cycle: Reverse-transcription of viral RNA genome into a double-stranded DNA form Establishment of the DNA in an integrated form in the host chromosomal DNA

62 RETROVIRUS virus con envelope genoma di 9-11 Kb costituito da una molecola di ssrna dopo l infezione il genoma è retrotrascritto a dsdna alle sue estremita 5 e 3 sono presenti due sequenze identiche, LTR (LTR: long terminal repeat, comprendono promotore/enhancers) LTR gag pol env LTR Ciascuna LTR e composta da 3 regioni U3 R e U5 La regione U3 al 5 contiene il promotore del virus: la trascrizione avviene dal primo nt di R e procede fino a U5 al 3 L RNA trascritto funge da un lato da pre mrna per la traduzione di tutte le proteine virali, dall altro costituisce il genoma virale incapsidato nel virione.

63 Retrovirus Tra le due LTR sono presenti 3 geni essenziali per la replicazione del virus. gag: codifica per le proteine del virus che si associano al genoma virale e sono indispensabili per l assemblaggio del virione. pol: codifica per i 3 enzimi che sono propri della famiglia dei Retrovirus: RT trascrittasi inversa, PR proteasi, IN integrasi env: codifica per le proteine dell envelope

64 Retrovirus life cycle

65 How could we exploit retroviruses as vectors?

66 vettori retrovirali REPLICAZIONE COMPETENTI Sono virus integri nei geni che ne consentono la replicazione, ma vengono privati di sequenze indesiderabili (es. src del RSV). Virus derivati da RSV possono infettare in maniera efficiente cellule di origine aviaria e in modo meno efficiente cellule di mammifero. Virus derivati dal virus della leucemia murina di Moloney (MoMLV) sono invece più efficienti per le infezioni di cellule di mammifero.

67 vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI La maggior parte delle applicazioni dei vettori retrovirali richiedono che non vi sia replicazione del virus dopo l'infezione iniziale. A questo fine si possono sostituire parte o tutte le sequenze codificanti del retrovirus con quelle che si desidera trasferire: in questo modo il vettore stesso è incapace di produrre le proteine necessarie alla propria replicazione. Le funzioni richieste per l'infezione iniziale del vettore sono generalmente fornite da una linea cellulare detta "packaging", che consente la produzione di virus infettante ma incapace di replicarsi. Cruciale nel giudicare l efficacia del sistema vettore/linea di packaging è la valutazione della frequenza con la quale si verifica la comparsa di revertanti replicazione competenti (RCR) nella popolazione di virus prodotto.

68 vettori retrovirali REPLICAZIONE DEFICIENTI I geni virali gag, pol ed env sono sostituiti con il cdna del gene di interesse. Il vettore che si ottiene non è in grado di produrre le proteine virali necessarie per un altro ciclo di infezione (vettore difettivo nella replicazione). LTR gag pol env LTR LTR cdna LTR LTR neo promoter cdna LTR Viene mantenuta la regione essenziale che comprende i due LTR e la sequenza di packaging (elementi-cis). Promotore: virale o eucariotico Marker di selezione (es. neomicina o b-galattosidasi). Dimensione max del transgene: 7.5 Kb.

69 Retroviral vector Gammaretrovirus CAP U3 Transcript--syntesized by RNA pol II R U5 PBS SD y Gag Pol SA Env U3 AAAAAA R U5 CAP U3 R U5 PBS SD y LTR driven vector SA cdna U3 AAAAAA R U5 P Gag Pol T P Env T

70 Retroviral vector RETROVIRAL VECTOR ARE TYPICALLY SEPARATED IN 2 COMPONENTS: the packaging, that provides all the proteins required in trans for production of viral particles that do not contain viral RNA the retroviral vector itself (in cis sequences), that carries the gene of interest (therapeutic gene)

71 Cellule di packaging La prima linea fu ottenuta trasfettando permanentemente cellule NIH 3T3 con un retrovirus MLV privato di y. La linea cellulare ottenuta complementa costrutti privi di gag, pol e env, ma i titoli ottenuti sono bassi e la frequenza di ricombinazione con produzione di revertanti replicazione competenti (RCR) è troppo elevata. Per ridurre ulteriormente le possibilità di ricombinazione le proteine gag e pol sono state espresse su un plasmide diverso da quello esprimente env ( split genome ), e non più sotto il controllo di LTR.

72 RETROVIRAL VECTOR-BASED SYSTEM Trans-acting element PACKAGING FUNCTIONS ( trans ) env Vector particle gag-pro-pol viral proteins Packaging cell

73 RETROVIRAL VECTOR-BASED SYSTEM Trans-and cis-acting elements PACKAGING FUNCTIONS ( trans ) env Vector particle gag-pro-pol VECTOR ( cis ) Therapeutic gene Vector RNA + viral proteins infection but no replication! Packaging cell

74 PSEUDOTYPING Ogni retrovirus è in grado di infettare un particolare tipo cellulare grazie all espressione di specifiche proteine codificate dai geni env. Si sfrutta la capacità di un retrovirus di incorporare le proteine env di un altro retrovirus: modificando i geni env è possibile modificare il tropismo virale e/o aumentare il titolo del vettore. Le proteine env endogene o eterologhe vengono fornite in trans ad un retrovirus difettivo per la replicazione. La pseudotipizzazione piu efficiente e conferita dalle proprieta della proteina G, presente sull envelope del virus della stomatite vesicicolare (VSV-G). Si lega ai fosfolipidi presenti virutalmente sulla membrana di tutti i tipi cellulari e innesca un meccanismo di endocitosi.

75 Phenotypic mixing

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