PCR (Polymerase chain reaction)

Dimensione: px
Iniziare la visualizzazioe della pagina:

Download "PCR (Polymerase chain reaction)"

Transcript

1 LABORATORIO DI METOLOGIE E TECNOLOGIE GENETICHE PCR (Polymerase chain reaction) La PCR è un metodo di biologia molecolare, utile per amplificare (i.e. creare copie multiple di) DNA, inventato da Kary Mullis alla fine degli anni 80. Lo scopo della PCR è di produrre un enorme numero di copie di una sequenza di DNA, sia essa un gene o parte di questo. Nella pratica corrente i principali componenti della PCR sono: DNA stampo, che contiene il frammento da amplificare; Due primers (Forward e Reverse), che determinano l inizio e la fine della regione da amplificare; DNA Polimerasi, che copia la regione da amplificare (si usano le DNA polimerasi di batteri termofili, che sono stabili ad elevate temperature; es. Taq Polimerasi); Nucleotidi, per la sintesi di nuovo DNA; Buffer, che fornisce l ambiente chimico ideale per la DNA Polimerasi. Il processo della PCR consta di tre steps principali che vengono ripetuti dalle 30 alle 40 volte, attraverso l utilizzo di un termociclatore. 1). Denaturazione a 94 o C (Melting): Durante la denaturazione, i due filamenti di DNA si separano e tutte le reazioni enzimatiche si arrestano (es. l estensione del filamento del ciclo precedente); 2). Annealing a o C: La temperatura di questo stadio dipende dai primers usati. Durante l annealing vengono utilizzati due primers (Forward e Reverse), che si legano ai loro siti specifici. Si formano e si rompono continuamente i legami ionici tra i filamenti dei primers ed i singoli filamenti di DNA che funzionano da templato (filamento stampo). I primers che si appaiano esattamente con il filamento stampo formano i legami più stabili ed, in questo piccolo tratto di doppia elica, si lega la polimerasi, che così inizia a copiare il filamento stampo; 3). Estensione a o C (Elongation): La temperatura di elongation dipende dalla DNA Polimerasi. Durante l estensione, la Polimerasi estende i primers aggiungendo le basi (complementari al templato) all estremità 3. Il risultato sono 2 copie di DNA a doppio filamento. 1

2 Figura 1: Le tre fasi della PCR. Poichè entrambi i filamenti sono copiati durante la PCR, si ha un aumento esponenziale del numero di copie della sequenza di DNA. X=X0(2N) N= NUMERO DI CICLI Con 100 molecole di DNA come stampo, dopo 30 cicli, la PCR produrrà PIU DI 100 MILIONI DI COPIE. 2

3 Figura 2: Amplificazione esponenziale durante la PCR. Caratteristiche della PCR Si possono utilizzare piccole quantità di DNA(ng); La qualità del DNA può anche non essere buona; Alta riproducibilità, specificità e sensibilità; Applicazioni cliniche e nella ricerca; Molto rapida e poco costosa; Puo essere usata solo se si conosce la sequenza del DNA. A cosa serve la PCR? La PCR può essere utilizzata in un ampia varietà di analisi tra cui: Genetic fingerprinting (usata in medicina legale); Test di paternità; Studi di evoluzione e filogenesi; Identificazione di malattie ereditarie; Identificazione di malattie virali; Clonaggio di un gene; Analisi di DNA antico; Genotipizzazione di specifiche mutazioni e polimorfismi. 3

4 POLIMORFISMI I polimorfismi sono variazioni di sequenza nelle regioni codificanti e non (es.: sostituzioni nucleotidiche, delezioni/inserzioni, duplicazioni/delezioni geniche). Per definizione un polimorfismo è una variante allelica, che si verifica nella popolazione con una frequenza di almeno l 1%. Es.: I gruppi sanguigni umani ABO. Il polimorfismo si differenzia da una mutazione spontanea, che si verifica, invece, con una frequenza < 1%. PREVALENZA RISCHIO INDIVIDUALE POLIMORFISMO alta (>1%) basso MUTAZIONE bassa (<1%) alto RISCHIO ATTRIBUIBILE ALLA POPOLAZIONE apprezzabile basso STUDI APPROPRIATI studi di coorte studi di controllo famiglie A che serve lo studio dei polimorfismi? Le analisi dei polimorfismi sono usate: Nella tipizzazione dei tessuti (es.: per la donazione di organi); In studi di popolazione (es.: studio del grado di diversità genetica in una popolazione); Per l identificazione di malattie genetiche. Come nascono i polimorfismi? Per mutazione. Che cosa mantengono i polimorfismi nella popolazione? Molti sono i fattori che mantengono un polimorfismo nella popolazione, tra cui: Effetto del fondatore; Deriva genica; Polimorfismo bilanciato. 4

5 Negli ultimi anni è stato dimostrato che più di 1/3 dei loci eucariotici sono rappresentati da varianti alleliche e che un locus è tanto più polimorfico, quanto più i suoi alleli sono equifrequenti. Le varianti alleliche possono o meno causare alterazioni funzionali della proteina e nel fenotipo, a seconda che siano presenti nelle regioni codificanti o non codificanti. Se un polimorfismo è in una sequenza codificante di un gene, in un esone, si può verificare una sostituzione aminoacidica, determinando cambiamenti nella proteina risultante. Un polimorfismo in un promotore può alterare i livelli di trascrizione. Un polimorfismo caratterizzato dalla delezione dell intero gene, come per l allele nullo GSTM1, elimina l attività funzionale dell enzima. Si possono, inoltre, verificare sostituzioni aminoacidiche, originantesi dalla sostituzione di un singolo nucleotide. Gli alleli la cui sequenza rivela solo un singolo nucleotide cambiato sono chiamati polimorfismi a singolo nucleotide o SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). In questo caso l effetto della sostituzione dipende dalle caratteristiche chimiche dell amminoacido sostituito. Cambiamenti nella funzione della proteina possono avere effetti profondi sul fenotipo, che possono essere osservati sotto particolari condizioni, come l esposizione a sostanze chimiche o stress. Molto spesso questi cambiamenti possono creare, o eliminare, siti per gli enzimi di restrizione che tagliano il DNA. La digestione con l enzima può così produrre frammenti di DNA di diversa lunghezza, identificabili con l elettroforesi. L RFLP-PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism) è un metodo indiretto di indagine utile per l individuazione degli SNPs. Dove può essere posizionato un SNP? In regioni non codificanti (questi polimorfismi non sono identificabili dal prodotto proteico); In regioni codificanti (in questi polimorfismi la struttura proteica può essere alterata). Il genoma umano contiene approssimativamente 1 milione di SNPs dei quali in zone non codificanti e in zone codificanti, dove si hanno sostituzioni amminoacidiche. Il numero di SNPs per gene varia da 0 a 9. La diversa risposta individuale alle condizioni ambientali dipende dalla presenza delle variazioni di sequenza all interno di geni critici. Questi polimorfismi genetici possono influenzare i livelli di espressione, la struttura, o l attività catalitica degli enzimi del metabolismo e della riparazione del DNA, influenzando la suscettibilità individuale. Alcuni esempi includono: 1). la relazione tra enzimi che attivano o detossificano (glutatione S-transferasi) i potenziali carcinogeni, 2). La suscettibilità, degli individui con polimorfismi nel gene XRCC1, a vari tipi di danni genotossici. Ci sono una dozzina di geni che modulano la risposta alle esposizioni ambientali. L analisi dei polimorfismi in questi geni può essere utile per capire la distribuzione del rischio all esposizione nelle popolazioni umane e, possibilmente, predire i rischi individuali dovuti all esposizione. 5

6 Enzimi detossificanti (del metabolismo): Glutatione S-transferasi. Le glutatione S-transferasi (GSTs) sono una famiglia di enzimi conosciuti per il loro importante ruolo nella detossificazioni di molti cancerogeni trovati nelle sigarette. Le GSTs sono proteine dimeriche, che catalizzano le reazioni tra il glutatione ed i loro substrati, come i radicali aromatici eterociclici e gli epossidi. La coniugazione facilita l escrezione consentendo, dunque, la detossificazione. Reazioni di fase I OSSIDAZIONI (es. CYP1A1,CYP2E1) OH Reazioni di fase II CONIUGAZIONI (es. GST, NAT2) O ELIMINAZIONE O ADDOTTO AL DNA Figura 3: Detossificazione dei composti potenzialmente cancerogeni, da parte degli enzimi GSTs. Oltre al loro ruolo nella fase II della detossificazione, i GSTs modulano l induzione di altri enzimi e proteine importanti per le funzioni cellulari, come la riparazione del DNA. Questa classe di enzimi è importante per mantenere l integrità genomica e, come risultato, può svolgere un ruolo importante nella suscettibilità al cancro. Gli enzimi GTSs sono codificati da cinque distinti loci, noti come: alpha (A), mu (M), pi (P), theta (T) e zeta (Z). Due loci, in particolar modo, GSTM1 e GSTT1, svolgono un ruolo di rilevanza nella suscettibilità al cancro testa-collo. 6

7 GSTM1 Il gene GSTM1 si trova sul cromosoma 1 in posizione p13.3; Individui con delezioni omozigoti del locus GSTM1 non hanno un attività enzimatica funzionale; Sono stati identificati tre alleli al locus GSTM1: Un allele nullo (delezione completa); Due alleli (GSTM1a e GSTM1b) che differiscono per una sostituzione C G in posizione 534. Questa sostituzione porta ad una sostituzione amminoacidica Lys Asn in posizione 172. Il metabolismo dei cancerogeni coinvolge una serie di steps di attivazione, che produce intermedi reattivi e steps di detossificazione, che produce composti idrosolubili e, quindi, eliminabili. L attivazione può comportare la formazione di composti che si legano al DNA, formando prodotti noti come addotti. L accumulo di addotti a livello di loci critici, come oncogeni e geni oncosoppressori, può portare a mutazioni somatiche e ad alterazioni del ciclo cellulare. Individui che non sono capaci di produrre l enzima GSTM1 accumulano potenzialmente più addotti al DNA. Le nostre conoscenze su come le variazioni genetiche influenzano gli enzimi del metabolismo hanno fornito nuove spiegazioni su come i carcinogeni riescono a danneggiare il DNA. Numerosi studi hanno dimostrato che i polimorfismi del metabolismo sono importanti determinanti del rischio di cancro a livello della popolazione. La formazione di addotti al DNA si verifica costantemente, nonostante i meccanismi di detossificazione. I mammiferi hanno un complesso sistema di riparazione del DNA, che corregge gli addotti al DNA, le basi danneggiate o altre lesioni prima che eventi di replicazione stabilizzino questi cambiamenti permanentemente. L interazione di tutti questi fattori protettivi determina il grado con cui questi danni sono convertiti in mutazioni e, quindi, in malattie. 7

8 Figura 4: Interazione tra i vari fattori protettivi. Recentemente sono stati compiuti molti sforzi per caratterizzare le variazioni nei geni della riparazione. Riparazione del DNA: Se i sistemi di riparazione del DNA correggono il danno al DNA, endogeno o indotto da cancerogeni, le conseguenze dei genotipi metabolici ad alto rischio possono essere meno significative. Gli enzimi della riparazione mantengono l integrità del codice genetico minimizzando gli errori di replicazione (causati da DNA templato riarrangiato o danneggiato) e rimuovendo i segmenti di DNA danneggiato. La fedeltà dei meccanismi di riparazione può essere influenzata da polimorfismi che alterano l attività enzimatica. E noto che individui che mancano di alcuni elementi della riparazione del DNA hanno una maggiore predisposizione allo sviluppo di tumori e che cambiamenti nell attività di riparazione del DNA può influenzare la sensibilità di un tumore al trattamento con alcuni agenti anti-tumorali. 8

9 La riparazione del DNA può verificarsi secondo molteplici pathways, che dipendono dal tipo di danno: Base excision repair (BER) coinvolge più di 25 geni deputati alla riparazione delle basi danneggiate, dei siti abasici ed altri danni causati per lo più dall azione di radicali liberi; Mismatch repair comprende almeno sei geni che correggono i nucletidi mal appaiati che risultano durante la replicazione del DNA; Nucleotide excision repair (NER) comprende più di 35 geni coinvolti nella rimozione del danno indotto da raggi UV (dimeri di pirimidine) e addotti al DNA prodotti dall esposizione a sostanze chimiche; Two double-strand-break, non homologous end joining and homologous recombination repair (HRR) contano più di 20 geni coinvolti nella riparazione di rotture dell elica del DNA prodotte dall esposizione alle radiazioni o dovute alla riparazione incompleta da parte di altri pathway. Polimorfismi nei geni della riparazione possono alterare la funzione della proteina corrispondente e la capacità individuale di riparare il DNA danneggiato. Recentemente è stata dimostrata una correlazione tra i polimorfismi associati al gene XRCC1 e l insorgenza del cancro. XRCC1 (X-Ray Repair Cross Complementig 1) Il gene XRCC1 si trova sul cromosoma 19 in posizione q13.2; E composto da 17 esoni; La proteina codificata è lunga 677 aa.; La proteina ha domini di legame con la Polimerase-ß, DNA ligasi III and Poly (ADP-ribose) polimerasi (PARP) ed è coinvolta nel pathway di riparazione BER. 9

10 Figura 5: Pathway BER e ruolo di XRCC1. 10

11 Figura 6: Il gene XRCC1. Polimorfismi in XRCC1 Codone 194 Esone 6, Base C T; Arg Trp Frequenza allelica= 0,15 Codone 206 Esone 9, Base A G; Pro Pro Frequenza allelica= 0,30 Codone 399 Esone 10, Base G A; Arg Gln Frequenza allelica= 0,25. Studi di associazione riguardanti il polimorfismo 399 del gene XRCC1 La variante allelica al codone 399 è stata associata ad un aumento di addotti al DNA indotti da aflatossine. E stata evidenziata un associazione positiva tra la variante allelica al codone 399 e la presenza di addotti al DNA, in cellule mononucleate presenti nel sangue, ed con un aumentata frequenza di scambi tra cromatidi fratelli (SCE) in linfociti di individui fumatori. Esiste un associazione positiva tra la presenza del polimorfismo nel codone 399 e l insorgenza del cancro testa-collo, cancro polmonare, cancro allo stomaco e cancro alla mammella. Esiste invece un associazione inversa tra lo stesso polimorfismo e l insorgenza del cancro alla vescica e del cancro della pelle (del tipo non-melanoma). 11

12 XRCC3 (X-Ray Repair Cross Complementig 3) Il gene XRCC1 si trova sul cromosoma 14 in posizione q32.3; E composto da 10 esoni; La proteina codificata è lunga 347 aa.; Proteina facente parte della famiglia di RAD51, la quale facilita, per l appunto, l assemblaggio del filamento nucleoproteico di RAD51 lungo il filamento crossricombinante. Interviene nella riparazione delle rotture a doppio filamento, in particolare nell Homologous Recombination Repair. Figura 7: Pathway HRR e ruolo di XRCC3. Polimorfismi in XRCC3 IVS 5-14, Base A G; Modifica della giunzione Introne-Esone Frequenza allelica= 0,30 Codone 241 Esone 7, Base C T; Thr Met Frequenza allelica= 0,25. 12

13 Studi di associazione riguardanti il polimorfismo 399 del gene XRCC1 La variante allelica al codone 241 è stata associata ad un aumento di addotti al DNA in leucociti circolanti di persone sane e ad un aumento di aberrazioni cromosomiche. E stata evidenziata un associazione positiva tra la variante allelica al codone 241 e l insorgenza di tumore alla pelle di tipo melanoma, cancro alla vescica e di tumore alla prostata. Di contro non sono state trovate relazioni tra questo polimorfismo e l aumentata probabilità di manifestare il tumore ai polmoni, allo stomaco, alla pelle ed alla vescica. SCOPO DELL ESERCITAZIONE Determinazione dei polimorfismi dei geni XRCC1 e XRCC3, mediante PCR. Primo Step: Purificazione di DNA da sangue intero; Quantificazione del DNA e sua diluizione; Secondo step: Preparazione dei campioni; Reazione della PCR; Check del prodotto di PCR (per verificare l assenza di contaminazioni); Terzo step: Determinazione del genotipo: a). Digestione enzimatica (per XRCC1/XRCC3); b). Corsa elettroforetica; c). Lettura delle bande ottenute. 13

14 Primo step Purificazione di DNA da sangue intero 1) Lisi dei campioni di sangue: Mettere in una eppendorf da 1,5 ml 200 μl di sangue (a temperatura ambiente) ed aggiungere 25 μl di proteinasi K. Aggiungere 200 μl di buffer B3 ai campioni e vortexare vigorosamente (10-20S). Incubare i campioni a 70 o C per min. 2). Regolare le condizioni di legame del DNA: Aggiungere 210 μl di etanolo (96-100%) ad ogni campione e vortexare ancora. 3). Legare il DNA: Caricare ogni campione in una colonnina NucleoSpin Blood posizionata dentro una eppendorf da 1,5ml. Centrifugare 1 min. a 11,000x g. 14

15 4). Lavare la membrana: Primo lavaggio Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 500 μl di buffer BW. Centrifugare 1 min. a 11,000 x g. Secondo lavaggio Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 600 μl di buffer B5. Centrifugare 1 min. a 11,000x g. 5). Eluizione del DNA: Mettere la colonnina NucleospinBlood in una nuova eppendorf da 1,5 ml ed aggiungere 100 μl di buffer BE, precedentemente riscaldato a 70 o C. Incubare a temperatura ambiente per 1 min. Centrifugare 1 min. a 11,000 x g. 15

16 Quantificazione del DNA purificato Preparare 1 eppendorf da 0,5 ml per ogni campione. Aggiungere in ogni eppendorf 390 μl di H2O distillata e 10 μl di campione. Lettura allo spettrofotometro: Prima lettura: bianco. Mettere nella cuvetta al quarzo 400 μl di H2O distillata ed iniziare la lettura. Letture successive. Campioni Caricare i campioni nella cuvetta al quarzo e procedere con la lettura. Lo spettrofotometro indicherà tre valori: A 260 : Assorbanza del DNA A 280 : Assorbanza delle proteine A 260 / A 280 = Purezza del DNA (deve essere tra 1,7 e 1,8). N.B.: se la lettura è negativa, non c è nulla. Calcolo della concentrazione del DNA: A 260 x Fattore di diluizione x 40 Con: Fattore di diluizione Valore dell assorbanza pari a 1 quando la concentrazione del DNA è pari a 40 μg/ml. Esempio: A 260 = 0,055 La concentrazione è pari a 110 μg/ml. La concentrazione finale del DNA deve essere di 10 ng/ μl, quindi: 16

17 110/10 = 10 ca. Il campione di DNA va diluito 10 volte in H2O distillata per ottenere una concentrazione finale di 10 ng/μl. XRCC1 ex10/xrcc3 ex7 Preparazione dei campioni Secondo step SCOPO: I polimorfismi che verrnno studiati sono delle sostituzioni aminoacidiche Arg Gln (codone 399) e Thr Met (codone 241), localizzate, rispettivamente, all interno dell esone 10 del gene XRCC1 e dell esone 7 del gene XRCC3. Tali polimorfismi sono dovuti: per XRCC1 ad una sostituzione G A (nucleotide 28152), in grado di eliminare un sito di restrizione specifico per l enzima HpaII/Msp I, presente, invece, nell allele wild-type; per XRCC3 ad una sostituzione C T (nucleotide 18067), in grado di creare un sito di restrizione specifico per l enzima NiaIII/Hsp92II. Dopo aver amplificato, tramite una PCR multipla (in cui vengono amplificate due frammenti genici diversi in due serie di campioni), un segmento di circa 200 bp per tutti e due i geni, la determinazione del genotipo verrà effettuata mediante digestione enzimatica. Campioni utilizzati: Totale campioni da utilizzare per ogni polimorfismo: 6 campioni genotipizzati. Per ogni serie di campioni sarà presente un controllo negativo per valutare la presenza o meno di contaminazione. 17

18 Preparare la miscela di reazione (Master Mix) per ogni gene in una eppendorf da 0,5/1,5 ml, secondo il seguente protocollo: PCR CALCULATION SHEET Date: 07/12/2005 XRCC1 ex10-xrcc3 ex7 Esercitazione Components Name or Stock solution Added Final concentration brand amount in µl in PCR Other component DMSO 1X 0,0 0,00X dh2o dw 1 X 102,0 0,69 X 10x buffer 10 X 14,8 1,00 X MgCl2 50 mm 5,9 2,00 mm dntp 1,25 mm 13,1 0,11 mm Primer 1 20 µm 2,2 0,30 µm Primer 2 20 µm 2,2 0,30 µm Glycerol 1X 0,0 0,00X DNA Polymerase Taq 5 U/µl 0,7 0,03 U/µl Desired MasterMix volume -> 141,0 To be used in PCR -> 133,0 DNA Polymerase added in Hot Start (µl/sample) 0,0 1:10 or 1:5 dilution!! Sample volume (µl) 1,0 Number of samples 7,0 Calculation OK Total volume of PCR reaction 20,0 Add MasterMix 19,0 Total volume -> 140 Allestire una microprovetta da 0,2 ml (strip) per ogni campione. Aggiungere in ogni strip 1 μl di DNA diluito (10 ng/μl) e 19 μl di Master Mix, per un volume totale di reazione di 20 μl. Nel controllo negativo non va aggiunto DNA, ma solo 20 μl di Master Mix. N.B.: Durante la preparazione della Master Mix tutti i suoi componenti vanno tenuti in ghiaccio. La Taq polimerasi va aggiunta all ultimo poco prima della reazione di PCR per impedire amplificazioni aspecifiche. Inoltre la Taq (HOTSTART Taq) che andremo ad utilizzare possiede una carattersistica che cerca di limitare le amplificazioni aspecifiche che possono avvenire a temperatura ambiente. Infatti possiede un ligando nel sito attivo che viene rimosso soltanto dopo uno step iniziale a 95 C per 5 minuti. 18

19 Reazione della Multiplex PCR Condizioni della PCR per XRCC1 399: 94 o C 30 sec. - Denaturazione 61 o C 30 sec. Annealing 35 cicli 72 o C 30 sec - Estensione 72 o C 5 min. 4 o C for ever. Condizioni della PCR per XRCC3 241: 94 o C 30 sec. - Denaturazione 60 o C 30 sec. Annealing 35 cicli 72 o C 30 sec - Estensione 72 o C 5 min. 4 o C for ever. Condizioni per la PCR multipla: E possibile effettuare una PCR multipla poichè le T di annealing sono molto simili. In questo caso verrà utilizzata la T di annealimg per XRCC1 (61 C). 95 C 5 min Attivazione della HOTSTART Taq 94 o C 30 sec. - Denaturazione 61 o C 30 sec. Annealing 35 cicli 72 o C 30 sec - Estensione 72 o C 5 min. 4 o C for ever. Check del prodotto di PCR Prima che il prodotto di PCR venga utilizzato, è necessario verificare che : Il prodotto si sia formato; Il prodotto sia della dimensione corretta; Non ci sia stata contaminazione (in questo caso è presente una banda anche nel controllo negativo) Preparazione del gel di agarosio Si utilizza un buffer (TBE) 10X, che va quindi diluito 10 volte. Gel al 2%: 19

20 2g di agarosio in 100 ml di buffer 1:10 (diluito, cioè, con H 2 O distillata). Far sciogliere alla T = 100 o C. Caricare il gel nell apposita celletta. Far solidificare il gel (occorrono 30 min.) Corsa elettroforetica Mettere su carta parafilm 1μl di colorante (loading dye) ed aggiungere 5 μl di campione, mettere i campioni colorati nei relativi pozzetti. Lasciare lo spazio per il controllo negativo e per il marker (DNA Ladder 50pb); vanno aggiunti 0,5 0,7 μl di marker. Valori per l elettroforesi: 300 ma; 100 V; 1:20 h (80 min.); 4 W. Dopo l elettroforesi, prendere il panetto di gel e lasciarlo immerso per 30 min. in BrEt (1 goccia di BrEt diluito 1:10, in un contenitore di H 2 O), al buio, a +4 o C. Successivamente prelevare il panetto ed immergerlo in H 2 O per 15 min., per eliminare l eccesso di colorante, al buio, a +4 o C. Verificare alla lampada UV la presenza di DNA. Lettura delle bande Analizzare le bande ottenute con l amplificazione. La dimensione delle bande viene calcolata rispetto alle bande del marker (ogni banda ha una dimensione di 50 bp). Dall analisi delle bande bisogna ottenere: - una sola banda da 213 bp per XRCC1; - una sola banda da 215 bp per XRCC3; - Controllo negativo nessuna banda (se compare una banda si è avuta una contaminazione con DNA che è stato amplificato). 20

21 Determinazione del genotipo Terzo Step Digestione enzimatica tramite l enzima HpaII/MspI per XRCC1 e NiaIII/Hsp92II per XRCC3: Aggiungere ad ogni campione 0,5 μl dell enzima di restrizione corrispondente ed incubare a 37 o C overnight (o per 4 ore). L identificazione del genotipo dei campioni esaminati verrà effettuata in base alla presenza di due frammenti di restrizione: XRCC1 ex 10 (l enzima taglia il sito wt): wt 2 bande a 161bp e 52bp het 3 bande a 213bp, 161bp e 52bp homo 1 banda a 213bp XRCC3 ex 7 (l enzima taglia il sito polimorfico): wt 1 banda a 215bp het 3 bande a 215bp, 105bp e 110bp homo 2 bande a 105bp e 110bp Esempio di foto di gel: XRCC1 (Arg399Gln) 213bp 161bp 52bp hom het wt hom het het wt hom wt XRCC3 (Thr241Met) M50 215bp 110bp 105bp wt hom wt hom het wt M50 Legenda: wt omozigote selvatico; het eterozigote; homo omozigote mutante; Neg controllo negativo. 21

22 Corsa elettroforetica Successivamente alla digestione enzimatica, i campioni vanno sottoposti ad elettroforesi, in un gel di poliacrilamide; questo passaggio consente la separazione delle bande (qualora il segmento di DNA da studiare sia stato digerito) e, quindi, permette di identificare la presenza del polimorfismo. Gel di poliacrilamide Volume totale : 10 ml. Gel al 10% in TBE. 5,5 ml H2O distillata; 3,5 ml acrilammide (30% ca.); 1 ml buffer (TBE o TAE); 100 μl APS (10%) (Ammonium Persulfate, si prepara una soluzione di 0,1 g di APS in 1 ml di H2O distillata); 7,5 μl TEMED. L APS ed il TEMED vanno aggiunti per ultimi, perché determinano la polimerizzazione del gel. Far polimerizzare il gel (40 min. ca.). Elettroforesi Mettere su carta parafilm 1μl di colorante (loading dye) ed aggiungere 5 μl di campione, mettere i campioni colorati nei relativi pozzetti. Lasciare lo spazio per il marker (DNA Ladder 50pb); vanno aggiunti 0,5 0,7 μl di marker. Se è stato fatto il check, non è necessario aggiungere il controllo negativo nei pozzetti. Valori per l elettroforesi: 400 ma; 200 V; 00:20 h (20 min.); 17 W. Dopo l elettroforesi, prendere il gel e lasciarlo immerso per 15 min. in BrEt (1 goccia di BrEt diluito 1:10, in un contenitore di H 2 O), al buio, a +4 o C. Successivamente prelevare il gel ed immergerlo in H 2 O il tempo necessario per l analisi alla lampada UV. Verificare alla lampada UV la presenza di DNA digerito. Lettura delle bande ottenute Fotografare il gel con la Polaroid ed analizzare le bande ottenute 22

23 Magnesio I componenti della miscela di reazione La concentrazione del Magnesio è un fattore cruciale, che influenza la performance della Taq DNA Polimerasi. I componenti della reazione, incluso il DNA templato, gli agenti alchilanti presenti nei campioni (EDTA o citrato), dntps e le proteine, influenzano la quantità di Magnesio libero. E importante, dunque, che nella preparazione della miscela di reazione non ci siano elevate concentrazioni di agenti alchilanti, come EDTA, o di gruppi ionici negativi, come i fosfati. I dntps rappresentano la maggiore parte dei gruppi fosfato nella reazione, quindi una qualsiasi variazione della loro concentrazione influenza la concentrazione del Magnesio disponibile. In assenza di un adeguata quantità di Magnesio disponibile, la Taq DNA Polimerasi non è attiva. Inoltre, un eccesso di Magnesio disponibile riduce la fedeltà dell enzima e può aumentare il livello di amplificazioni aspecifiche. Buffer Il buffer standard per la PCR contiene 50 mm KCl, 10 mm Tris-Cl (PH 8.3 a temperatura ambiente). Quando incubato a 72 o C, il PH della reazione diminuisce più di un unità, producendo un buffer il cui PH è approssimativamente 7.2. Primers Gli oligonucleotidi usati per i primers devono avere una lunghezza di almeno 16 nucleotidi e, preferibilmente, di nucleotidi. Questi oligonucletidi sono troppo corti per formare ibridi stabili alle temperature usate per la polimerizzazione (72 o C). La Taq Polimerasi inizia a lavorare non appena i primers si sono legati al loro templato alle basse temperature (50-60 oc). I prodotti così estesi sono abbastanza lunghi da rimanere legati al templato, non appena la temperatura è rapidamente aumentata a 72 o C. I primers devono contenere il 40-60% di G+C e va fatta molta attenzione nella scelta della sequenza, perchè con un elevata quantità di G+C è possibile la formazione di strutture secondarie interne. Le estremità 3 dei primers non devono essere complementari, per impedire la produzione di dimeri tra i primer durante la reazione di PCR. Idealmente entrambi i primers si annilano alla stessa temperatura. La temperatura di annealing dipende dal primer con la temperatura più bassa (melting temperature T m ). Generalmente gli oligonucletodi sono usati ad una concentrazione di 1 μm. Questa concentrazione è sufficiente per almeno 30 cicli di amplificazione. La presenza di concentrazioni più elevate di oligonucleotidi può causare priming a siti ectopici, con conseguente amplificazione di sequenze indesiderate. Al contrario, la PCR è estremamente inefficiente quando la concentrazione dei primers è limitata. Deossiribonucleotidi trifosfati (dntps) I dntps sono usati a concentrazioni saturanti. I

24 Taq DNA Polimerasi Possono essere utilizzate due forme di Taq DNA Polimerasi: l enzima purificato dal microorganismo Thermus acquaticus ed una forma geneticamente ingegnerizzata dell enzima sintetizzato in E.coli. Entrambe le forme di polimerasi hanno un attività esonucleasica 5 3, ma mancano dell attività 3 5. Le proprietà delle due polimerasi sono sostanzialmente equivalenti. L aggiunta di un eccesso di enzima può portare ad amplificazioni di sequenze non bersaglio. Sequenza target Un amplificazione corretta della regione d interesse dipende dalla quantità e dalla qualità del DNA templato. I reagenti comunemente utilizzati per purificare gli acidi nucleici (sali, guanidina, proteasi, solventi organici e SDS) sono dei potenti inibitori delle DNA polimerasi. La precipitazione con etanolo dei campioni di acici nucleici elimina la maggior parte degli agenti inibitori. La quantità di templato richiesta per un amplificazione corretta dipende dalla complessità del campione di DNA. Effetti indesiderati durante la reazione a catena Spesso si possono verificare reazioni a catena indesiderate, che iniziano a temperatura ambiente, una volta che tutti i componenti della reazione sono stati aggiunti. Queste reazioni non volute, includono amplificazioni aspecifiche e formazioni di dimeri tra primers. II

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici

TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE. LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE LA REAZIONE POLIMERASICA A CATENA Principi teorici e aspetti pratici POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 1955 A. Kronembreg e coll. (Stanford University) scoprono la DNA-polimerasi

Dettagli

Protocollo Crime Scene Investigation

Protocollo Crime Scene Investigation Protocollo Crime Scene Investigation Precauzioni da adottare in laboratorio: - non mangiare o bere - indossare sempre i guanti quando si maneggiano i tubini, i gel, le micropipette - nel dubbio, chiedere!

Dettagli

Esperienza 10: la PCR

Esperienza 10: la PCR Esperienza 10: la PCR La tecnica della polimerizzazione a catena (in inglese polymerase chain reaction) o PCR, permette di amplificare milioni di volte un unico frammento di DNA. Questo metodo è diventato

Dettagli

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno).

Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Esercitazione di Laboratorio corso Prof Tuberosa Biotecnologie genetiche agrarie Laurea in Biotecnologie (terzo anno). Programma: Giorno 1Preparazione di DNA genomico da foglie 2 - Controllo qualità DNA

Dettagli

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori

Istruzioni d uso. BAG Cycler Check. REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori Istruzioni d uso BAG Cycler Check REF 7104 (10 test) REF 71044 (4 test) Kit per la validazione dell uniformità della temperatura nei termociclatori pronto all uso, prealiquotato Indice 1. Descrizione del

Dettagli

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro

di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro di Milazzo Gabriele Mangiagli Graziella Paternò Valentina Lomagno Valeria Mangione Enza Prof. C. Di Pietro Polymerase Chain Reaction Inventata a metà degli anni 80 da Kary Mullis, è a tutt oggi uno strumento

Dettagli

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino

La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La reazione a catena della polimerasi (PCR) di Ofelia Leone e Vincenzo Mandarino La Polymerase Chain Reaction (PCR) o reazione di amplificazione a catena è una tecnica che permette di amplificare una specifica

Dettagli

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi

PROGETTO DNA chiavi in mano. Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano Le Biotecnologie in classe e in laboratorio 11/03/2015 Prof.ssa Paola Cazzani I.T.E. A. Bassi - Lodi PROGETTO DNA chiavi in mano PROGETTO DNA chiavi in mano IFOM PROGETTO DNA

Dettagli

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica

Maria Antonietta Lepore. Principali tecniche di biologia molecolare clinica Maria Antonietta Lepore Principali tecniche di biologia molecolare clinica Copyright MMIX ARACNE editrice S.r.l. www.aracneeditrice.it info@aracneeditrice.it via Raffaele Garofalo, 133 a/b 00173 Roma (06)

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

PCR - Polymerase Chain Reaction. ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). End point PCR vs quantitative Real-Time PCR PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando

Dettagli

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio

LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR. Dott. Paolo Cascio LEZIONE X FUNZIONAMENTO E APPLICAZIONI DELLA PCR Dott. Paolo Cascio Tecnica della reazione a catena della DNA polimerasi o PCR (Polymerase Chain Reaction) 1) Introdotta da Kary Mullis alla metà degli anni

Dettagli

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92

PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale. Esercizio. Tipizzazione del gene PV92 PROGETTO BIOFORM Corso didattico sperimentale Esercizio Tipizzazione del gene PV92 Elementi trasponibili Che cosa sono gli elementi trasponibili? Sono segmenti di DNA che sono in grado di trasferirsi in

Dettagli

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI

Materiali e Metodi MATERIALI E METODI MATERIALI E METODI 62 1. Pazienti con IBS Per eseguire l analisi del polimorfismo 5HTTLPR è stato necessario ottenere campioni di sangue intero o saliva dai quali estrarre il DNA genomico. A tal fine è

Dettagli

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO

ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO (Reazione a catena della polimerasi) & ESTRAZIONE del DNA da gel di AGAROSIO Corso di Ingegneria Genetica e Microbiologa Applicata Prof. Renato Fani Percorso1: Analisi della variabilità genetica di popolazioni

Dettagli

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico

Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Amplificazione del DNA tramite reazione a catena della polimerasi (POLYMERASE CHAIN REACTION; PCR) e sue applicazioni in ambito biomedico Dottoressa Camerin Consuelo Laboratorio Oncoematologia Pediatrica

Dettagli

Metodiche Molecolari

Metodiche Molecolari Metodiche Molecolari La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro saggio che può essere utilizzato sia per verificare la presenza di un virus in un determinato campione biologico, sia per studiare

Dettagli

SEQUENZIAMENTO DEL DNA

SEQUENZIAMENTO DEL DNA SEQUENZIAMENTO DEL DNA Il metodo di Sanger per determinare la sequenza del DNA Il metodo manuale La reazione enzimatica Elettroforesi in gel denaturante di poliacrilammide Autoradiografia Il metodo automatico

Dettagli

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri).

Il primer utilizzato può essere specifico per il gene che si intende amplificare oppure aspecifico (oligo (dt) oppure random esameri). Retrotrascrizione l mrna viene convertito in cdna per mezzo dell enzima trascrittasi inversa (DNA polimerasi RNAdipendenti ricavate dai virus della mieloblastosi aviaria AMV o della leucemia murina di

Dettagli

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009

Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di. DNA umano. 22-26 giugno 2009 Analisi di polimorfismi usati per la caratterizzazione di profili genetici in campioni di 22-26 giugno 2009 DNA umano 1 GENETICA FORENSE La genetica forense applica tecniche di biologia molecolare al fine

Dettagli

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

12-05-2010 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DI ACIDI NUCLEICI Il primo passaggio per la maggior parte delle procedure che verranno trattate in questo corso consiste nell estrazione del DNA (e dell RNA) da materiale biologico, e nella sua purificazione mediante separazione

Dettagli

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici

Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici Analisi Molecolare di sequenze di acidi nucleici 1. L Analisi di restrizione di frammenti o RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) di DNA comporta lo studio delle dimensioni dei frammenti di DNA

Dettagli

Corso di aggiornamento

Corso di aggiornamento I n t r o d u z i o n e a l l e t e c n i c h e d i bi o l o g i a m o l e c o l a r e e l o r o a p p l i c a z i o n i ne l L a b o r a t o r i o C l i n i c o Corso di aggiornamento Milano - Sabato

Dettagli

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING

DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING DALL ESTRAZIONE DEL DNA AL FINGERPRINTING SCOPO DELL'ATTIVITÀ Ciascuno studente estrae il proprio DNA da cellule della mucosa boccale. Quindi, mediante PCR, vengono amplificati frammenti corrispondenti

Dettagli

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA

Soluzioni e tamponi utilizzati per la PCR, senza DNA Materiali biologici In questo file sono elencati, capitolo per capitolo, i materiali biologici da richiedere al CusMiBio (o centro simile) per realizzare gli esperimenti che abbiamo illustrato (www.cusmibio.unimi.it).

Dettagli

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test

U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare. Unità di misura. Repertorio. 200 ml 10.000 U. 500 test U.O.C. di Epatologia Clinica e Biomolecolare Lotto N. DESCRIZIONE PRODOTTO Quantità annua richiesta Unità di misura Repertorio CND Codice Prodotto, Confezione Offerta e nome commerciale Prezzo unitario

Dettagli

Purificazione degli acidi nucleici

Purificazione degli acidi nucleici A cosa serve? Purificazione degli acidi nucleici DNA genomico: per costruire librerie genomiche e/o usato nell analisi d ibridazione Southern. mrna: sintesi del cdna; analisi d ibridazione Northern, o

Dettagli

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675

Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 Orga Bio Human S.r.l. DIREZIONE E UFFICI: Via Amsterdam 75, 00144 Roma Tel/fax: 06 99701675 SEDE LEGALE: Via Helsinki 21, 00144 Roma Tel. 06 97998273; Fax 06 52246148 e-mail: orgabiohuman@fastwebnet.it

Dettagli

Metodi di analisi mutazionale

Metodi di analisi mutazionale Metodi di analisi mutazionale I metodi impiegati per l analisi di mutazioni o polimorfismi nel DNA genomico possono essere suddivise in due principali categorie: (1) metodi per individuare mutazioni note,

Dettagli

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati.

Biotecnologie ed OGM. Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. Biotecnologie ed OGM Prima parte: DNA ricombinante e microorganismi geneticamente modificati. COSA SONO LE BIOTECNOLOGIE? Si dicono Biotecnologie i metodi tecnici che permettono lo sfruttamento di sistemi

Dettagli

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA

MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA MECCANISMI DI RIPARAZIONE DEL DNA MUTAZIONI SPONTANEE ED INDOTTE Il danno al DNA non riparato può portare a mutazioni che causano malattie o morte delle cellule. Le mutazioni derivano da cambiamenti della

Dettagli

Capitolo 1 Introduzione alla PCR

Capitolo 1 Introduzione alla PCR Capitolo 1 Introduzione alla PCR La tecnologia della PCR ha rivoluzionato l attività dei laboratori di ricerca e di diagnostica trovando applicazioni ed impieghi in svariati campi della medicina e della

Dettagli

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E

Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E Si può ottenere un a grande quantità di copie di DNA a partire da una singola molecola di DNA stampo La reazione è semplice ed automatizzabile E possibile scegliere selettivamente cosa amplificare (specificità)

Dettagli

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici

Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici Analisi di sequenziamento degli acidi nucleici In questa lezione darò qualche breve cenno sui metodi di sequenziamento del DNA e specialmente quelli con marcatura fluorescente che attualmente vengono effettuati

Dettagli

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92

PROGETTO BIOFORM. Tipizzazione del locus PV92 Ci fu un tempo in cui per amplificare il DNA, dovevi crescere tonnellate e tonnellate di piccole celle. Poi è arrivato un ragazzo di nome Dr. Kary Mullis, Ha detto che si può amplificare in vitro altrettanto

Dettagli

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO

PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO PROGETTO DNA CHIAVI IN MANO La collaborazione con il Virgilio e il progetto dell IFOM Il progetto DNA chiavi in mano è un percorso pensato dal Centro di Ricerca internazionale IFOM per avvicinare i ragazzi

Dettagli

Tecniche Diagnostiche molecolari

Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche Diagnostiche molecolari Tecniche di Biologia Molecolare La scoperta che il DNA è alla base di tutte le funzioni della cellula ha aperto la strada allo sviluppo di una disciplina denominata biologia

Dettagli

Diagnosi genetiche molecolari

Diagnosi genetiche molecolari Diagnosi genetiche molecolari INDICAZIONI per la diagnosi genetica Ricorrenza nella famiglia di una malattia genetica - identificazione dei portatori - confermare la diagnosi basata sul quadro clinico

Dettagli

Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare

Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare Un nuovo approccio: la VEQ in biologia molecolare Il crescente interesse nella biologia molecolare applicata alla diagnostica è il risultato dei profondi progressi ottenuti nelle conoscenze scientifiche

Dettagli

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno

Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo. alla realtà di ogni giorno Editoriale n.10 Newsletter aprile 2013 Come si traccia un alimento di origine animale? Dalle lasagne con carne di cavallo alla realtà di ogni giorno Identificare la specie, un obiettivo fondamentale quando

Dettagli

Corso di: GESTIONE FAUNISTICA. Prof. Bernardino Ragni

Corso di: GESTIONE FAUNISTICA. Prof. Bernardino Ragni Corso di: GESTIONE FAUNISTICA Prof. Bernardino Ragni Università degli Studi di Perugia Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche Naturali Corso di laurea in Scienze Naturali LAUREA MAGISTRALE Caso di studio:

Dettagli

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b)

PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) RT-PCR: serve a valutare l espressione di un gene tramite l amplificazione dell mrna da esso trascritto PCR COMPETITIVA: serve a valutare la concentrazione iniziale di DNA o RNA

Dettagli

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE)

ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI CON PARTICOLARE RIFERIMENTO A DNA ESTRATTO DA TESSUTI FISSATI IN FORMALINA E INCLUSI IN PARAFFINA (FFPE) SALVATORE GIRLANDO LABORATORIO PATOLOGIA MOLECOLARE ANATOMIA PATOLOGICA

Dettagli

Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010. aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM)

Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010. aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM) Lezione 7-8 Giovedì 18 Marzo 2010 aula 2 ore 9:00 corso integrato di Biologia Applicata (BU) ed Ingegneria Genetica (BCM) materiale del T-Rex system pfrt/laczeo = Flp-In target site vector for stable transfection

Dettagli

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini

Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero. Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Protocollo di Real-Time RT-PCR per la diagnosi del fitoplasma della Moria del Pero Claudio Ratti, Chiara Lanzoni e Carlo Poggi Pollini Moria del pero (Candidatus Phytoplasma pyri) Fitoplasmi: Microrganismi

Dettagli

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di

Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di Dopo aver effettuato la PCR, all interno della soluzione oltre al tratto amplificato sono presenti: primers, dntps, Taq polimerasi e tampone di reazione Inizialmente i 20 µl dell amplificato vengono

Dettagli

PCR - Polymerase Chain Reaction

PCR - Polymerase Chain Reaction PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi della duplicazione del DNA,

Dettagli

Dott.ssa Renata Tisi. Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it

Dott.ssa Renata Tisi. Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere l informazione genetica nelle cellule,

Dettagli

Lezioni di biotecnologie

Lezioni di biotecnologie Lezioni di biotecnologie 2 Lezione 2 Analisi del DNA e delle proteine 3 Analizzare DNA e proteine Per le applicazioni delle biotecnologie è di fondamentale importanza: 1. essere in grado di identificare

Dettagli

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica)

Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) DNA Metodiche di analisi del DNA (cenni) (Ingegneria genetica) Principali tecniche di base Enzimi di restrizione (Endonucleasi) Gel elettroforesi Ibridizzazione PCR (Polymerase Chain Reaction) Sequenziamento

Dettagli

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN)

Verifiche qualitative dell RNA e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme. Massimo Degan, CRO Aviano (PN) e cdna in ambito dei trials BCR/ABL e AML translocation programme Massimo Degan, CRO Aviano (PN) perchè è importante verificare l RNA La verifica della qualità dell RNA nei saggi diagnostico-molecolari

Dettagli

Corso di Biologia Molecolare

Corso di Biologia Molecolare Corso di Biologia Molecolare Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Acidi nucleici Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere

Dettagli

DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA.

DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA. DNA BARCODE: ALLESTIRE UNA BANCA DATI PER TUTELARE LE NOSTRE RISORSE E GARANTIRE LA TRACCIABILITA. Ogni regione italiana vanta una quantità notevole di prodotti agroalimentari ed animali tipici e caratteristici.

Dettagli

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo

immagine Biologia applicata alla ricerca bio-medica Materiale Didattico Docente: Di Bernardo Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Biologia applicata alla ricerca bio-medica immagine Docente: Di Bernardo TECNICHE PER L ANALISI

Dettagli

Corso di Biologia Molecolare

Corso di Biologia Molecolare Corso di Biologia Molecolare Dott.ssa Renata Tisi Dip. Biotecnologie e Bioscienze Ed. U4 Tel. 02 6448 3522 renata.tisi@unimib.it Acidi nucleici Il ruolo degli acidi nucleici è quello di custodire e trasmettere

Dettagli

Elettroforesi degli acidi nucleici

Elettroforesi degli acidi nucleici Elettroforesi degli acidi nucleici Una volta che i frammenti del DNA o del RNA da analizzare sono stati amplificati con la reazione PCR è necessario separarli ed identificarli. A tale scopo si utilizza

Dettagli

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche

BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione alle tecniche e alle loro applicazioni cliniche I T A L B I O F O R M A i n c o l l a b o r a z i o n e c o n O R D I N E N A Z I O N A L E D E I B I O L O G I o r g a n i z z a i l c o r s o d i a g g i o r n a m e n t o BIOLOGIA MOLECOLARE: introduzione

Dettagli

Elementi di genetica di base e marcatori molecolari. Dott.ssa Marica Soattin

Elementi di genetica di base e marcatori molecolari. Dott.ssa Marica Soattin Elementi di genetica di base e marcatori molecolari Dott.ssa Marica Soattin Organismi animali costituiti da cellule di tipo eucariote Cellule con nucleo differenziato delimitato da membrana e organelli

Dettagli

Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto

Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto Analisi mutazionale di K-RAS metodiche a confronto Aula Magna Villa Sironi Gallarate 16 ottobre Dott. Carmelo Lupo Coordinatore Tecnico Anatomia Patologica e Patologia Molecolare Oncologica PERCHÉ K-RAS

Dettagli

Le cellule cancerose

Le cellule cancerose Le cellule cancerose Cosa è il cancro? Malattia che insorge in conseguenza di anomalie della funzionalità cellulare E la Seconda causa di morte si possono sviluppare in quasi tutti gli organi Le diverse

Dettagli

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione

SINTESI DELL RNA. Replicazione. Trascrizione. Traduzione SINTESI DELL RNA Replicazione Trascrizione Traduzione L RNA ha origine da informazioni contenute nel DNA La TRASCRIZIONE permette la conversione di una porzione di DNA in una molecola di RNA con una sequenza

Dettagli

La trascrizione nei procarioti. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie

La trascrizione nei procarioti. Prof. Savino; dispense di Biologia Molecolare, Corso di Laurea in Biotecnologie La trascrizione nei procarioti Concetti base Nucleoside base purinica o pirimidinica legata alla posizione 1 dell anello pentoso Nucleotide base azotata-pentoso-fosfato Concetti base La trascrizione comporta

Dettagli

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine

Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi basati sulla ricerca del DNA e delle proteine Università degli Studi del Piemonte Orientale A. Avogadro CORSO DI ALTA FORMAZIONE IN LEGISLAZIONE ALIMENTARE Metodi per il rilevamento degli OGM in matrici alimentari: principi ed i metodi di analisi

Dettagli

RELAZIONE TECNICA. Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità

RELAZIONE TECNICA. Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità RELAZIONE TECNICA Indagini Biologico-Molecolari per Accertamento di Paternità PROSPETTO RIASSUNTIVO DELL'ANALISI ANALISI INDAGINE DI PATERNITA' PERSONE SOTTOPOSTE AL TEST QUESITO Campione Biologico Tampone

Dettagli

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a)

PRINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PCR. PRINCIPALI TIPI DI PCR a) PRINCIPALI TIPI DI PCR b) PRINCIPALI TIPI DI PCR a) EAZIONE A CATENA DELLA POLIMEASI (PC) PINCIPALI APPLICAZIONI DELLA PC UPPE primer LOWE primer GENE X 1. Identificazione di agenti patogeni nell uomo, negli animali o negli alimenti (batteri e virus) 2.

Dettagli

immagine Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello Materiale Didattico

immagine Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello Materiale Didattico Esperto in processi innovativi di sintesi biomolecolare applicata a tecniche di epigenetica Materiale Didattico Metodologie e applicazioni della biologia molecolare e cellulare Dott.ssa Giorgia Borriello

Dettagli

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE

DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE DNA RICOMBINANTE E BIOTECNOLOGIE INDICE DNA ricombinante e sue applicazioni Tecniche del DNA ricombinante Inserzione di un gene in un plasmide Progetto Genoma Umano Biotecnologie e loro applicazioni Organismi

Dettagli

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione.

C2. Il rilascio del fattore sigma marca il passaggio alla fase di allungamento della trascrizione. Soluzioni ai problemi del Capitolo 12 Domande concettuali C1. A. I geni dei trna codificano molecole di trna e i geni degli rrna le molecole di rrna che si trovano nei ribosomi. Esistono anche dei geni

Dettagli

IVD. pronti all uso e prealiquotati

IVD. pronti all uso e prealiquotati IT Istruzioni d uso BAGene DNA-SSP Kits Kit per la determinazione dei gruppi del sangue ABO, genotipi RH, sistemi Kell, Kidd e Duffy, MNS, sistemi gruppoematici rari e specificità HPA ed HNA in biologia

Dettagli

Metodica fu ideata nel 1983

Metodica fu ideata nel 1983 Metodica fu ideata nel 1983 PCR - Polymerase Chain Reaction ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993). Questa tecnica, utilizzando i principi

Dettagli

Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA

Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA Identificazione di mutazioni e analisi dei polimorfismi del DNA L identificazione delle mutazioni che causano malattie può oggi essere effettuata con metodiche relativamente semplici e pratiche in un laboratorio

Dettagli

Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione

Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione Protocollo di laboratorio per la purificazione manuale del DNA a partire da 0,5 ml di campione Per la purificazione del DNA genomico proveniente dai kit di prelievo Oragene e ORAcollect. Per le istruzioni

Dettagli

Francesca Ceroni. Biotecnologie tradizionali. Biologia Sintetica. F. Ceroni 16/09/2010. Bressanone GNB 2010 1. 1) DNA ricombinante 2) PCR

Francesca Ceroni. Biotecnologie tradizionali. Biologia Sintetica. F. Ceroni 16/09/2010. Bressanone GNB 2010 1. 1) DNA ricombinante 2) PCR XXIX Scuola Annuale di Bioingegneria. Bressanone, 13-17 settembre 2010 Francesca Ceroni Biotecnologie tradizionali 1) DNA ricombinante 2) PCR 3) Sequenziamento automatizzato Biologia Sintetica 4) Approccio

Dettagli

Pellet cellulare. Vortexare per 10-30 sec. Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C

Pellet cellulare. Vortexare per 10-30 sec. Riscaldare il campione in un termoblocco per 10 min a 100 C PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Guida Rapida Per informazioni sulla sicurezza far riferimento alla sezione Safety del PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent Protocol (PN 4367554). Per tutti

Dettagli

Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità

Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità Progettazione di primer per PCR. Verifica della specificità La PCR (Polymerase Chain Reaction) ha progressivamente assunto importanza tra le tecnologie ricombinanti in quanto in diversi protocolli applicativi

Dettagli

GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO

GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO GRUPPO DI STUDIO TUMORI CUTANEI LINEE GUIDA PER ANALISI GENETICO MOLECOLARI IN PAZIENTI AFFETTI DA MELANOMA METASTICO Documento redatto da: Dott.ssa T.Venesio, Dr.ssa A. Balsamo - Laboratorio di Patologia

Dettagli

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica:

Cenni storici. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di ricerca biologica: DNA Microarray: griglia di DNA costruita artificialmente, in cui ogni elemento della griglia riconosce una specifica sequenza target di RNA o cdna. Tale tecnica trova largo impiego in tutte le aree di

Dettagli

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica

PRODA Istituto di Diagnostica Clinica Caratterizzazione molecolare delle Distrofie Muscolari di Duchenne (DMD) e di Becker (BMD): diagnosi di malattia e studi familari L Proda esegue le indagini molecolari per le Distrofie muscolari di Duchenne

Dettagli

LE MOLECOLE INFORMAZIONALI. Lezioni d'autore Treccani

LE MOLECOLE INFORMAZIONALI. Lezioni d'autore Treccani LE MOLECOLE INFORMAZIONALI Lezioni d'autore Treccani Introduzione (I) I pionieri della biologia molecolare, scoperta la struttura degli acidi nucleici, pensarono di associare al DNA una sequenza di simboli,

Dettagli

Lezione 2 Capitolo 18 del testo

Lezione 2 Capitolo 18 del testo Test genetico Lezione 2 Capitolo 18 del testo Cos e un test genetico/diagnostico M Il test genetico di per se non e solo utilizzato in diagnostica: sono un insieme di tecniche che vengono utilizzate per

Dettagli

Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip

Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip Biosensori 3: Biosensori a DNA e Bio- Gene Chip mazzei@di.unipi.it (materiale parzialmente tratto da: http://nestor.med.unibo.it/shared_files/seminari/sartini_21-10-2004.ppt) Biosensori ad affinità basati

Dettagli

SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO

SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO REPARTO GENOMICA LABORATORIO ANALISI GENOMICHE SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO DOCUMENTO ILLUSTRATIVO DEL SERVIZIO DI SEQUENZIAMENTO ACIDI NUCLEICI ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DELLA LOMBARDIA

Dettagli

DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA

DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? SI AUMENTA O SI DIMINUISCE L ESPRESSIONE DELLA PROTEINA DOMANDA FREQUENTE: QUALE E LA FUNZIONE DI UNA CERTA PROTEINA? OVERESPRESSIONE DELLA PROTEINA ESPRESSIONE ECTOPICA CON UN VETTORE DI ESPRESSIONE ABOLIZIONE DELLA ESPRESSIONE DELLA PROTEINA INTERFERENZA

Dettagli

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING

8-06-2010. BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING. BLOTTING delle proteine: NORTHERN BLOTTING SOUTHERN BLOTTING 8-06-2010 TECNICHE PER L ANALISI DELL ESPRESSIONE GENICA BLOTTING degli acidi nucleici: RT-PCR REAL TIME PCR SOUTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING NORTHERN BLOTTING BLOTTING delle proteine: MICROARRAYS MACROARRAYS

Dettagli

Elettroforesi. Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita.

Elettroforesi. Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. Elettroforesi Elettroforesi: processo per cui molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilita. A qualunque ph diverso dal pi le proteine hanno una carica netta quindi,

Dettagli

RISOLUZIONE ENO 24/2004

RISOLUZIONE ENO 24/2004 RICERCA DI SOSTANZE PROTEICHE DI ORIGINE VEGETALE NEI VINI E NEI MOSTI L'ASSEMBLEA GENERALE, Visto l'articolo 2 paragrafo 2 iv dell'accordo del 3 aprile 2001 che istituisce l'organizzazione internazionale

Dettagli

ATASSIA SPINOCEREBELLARE 17 (SCA17) (OMIM #607136)

ATASSIA SPINOCEREBELLARE 17 (SCA17) (OMIM #607136) ATASSIA SPINOCEREBELLARE 17 (SCA17) (OMIM #607136) Il gene implicato nella SCA17 è il gene TATA box-binding protein (TBP) che fa parte del complesso della RNA polimerasi II ed è essenziale per dare inizio

Dettagli

SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA (ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA)

SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA (ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA) SUPERAVVOLGIMENTO DEL DNA (ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA) ORGANIZZAZIONE TERZIARIA DEL DNA Il DNA cellulare contiene porzioni geniche e intergeniche, entrambe necessarie per le funzioni vitali della

Dettagli

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la

Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la LABORATORIO 2: ESTRAZIONE ED ANALISI ELETTROFORETICA DI DNA GENOMICO Come fare? Seguiamo 3 semplici passaggi: Detergente enzimi (es. preparato per ammorbidire la carne) Alcol Cooome?? E' così facile??

Dettagli

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA

DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA CLM Biotecnologie per l Alimentazione CLM in Biotecnologie Sanitarie Corso di Chimica e certificazione degli alimenti DETERMINAZIONE DI ENTEROVIRUS IN CAMPONI DI ACQUA VIRUS ENTERICI virus escreti tramite

Dettagli

Analisi del DNA genomico mediante Southern Blot Hybridization

Analisi del DNA genomico mediante Southern Blot Hybridization Analisi del DNA genomico mediante Southern Blot Hybridization Permette la mappatura dei siti di restrizione attorno al frammento di DNA genomico per il quale si dispone di una sonda specifica a) Il DNA

Dettagli

Biosintesi non ribosomiale di metaboliti peptidici bioattivi

Biosintesi non ribosomiale di metaboliti peptidici bioattivi Biosintesi non ribosomiale di metaboliti peptidici bioattivi Principali bersagli degli antibiotici Gli antibiotici derivano per la maggior parte da composti naturali Strutture di alcuni peptidi bioattivi

Dettagli

Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio

Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio Relazione conclusiva delle esperienze di laboratorio Emiliano Giovanni Vavassori e.vavassori@sssup.it Allievo Ordinario Settore di Agraria Scuola Superiore di Studi Universitari e di Perfezionamento Sant

Dettagli

Tecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni

Tecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni Tecniche molecolari per la diagnosi di funghi fitopatogeni Tecniche che consentono l identificazione, la diagnosi, la quantificazione di un organismo mediante l analisi degli acidi nucleici: DNA RNA Diagnosi

Dettagli

Progetto della classe II C

Progetto della classe II C Progetto della classe II C Preparazione allo svolgimento dell esperienza La II C è preparata all esperienza presso il centro di ricerca E.B.R.I. iniziando un intenso lavoro di approfondimento sulla genetica

Dettagli

HISTO SPOT On-Call Typing Kit

HISTO SPOT On-Call Typing Kit Istruzioni per l uso HISTO SPOT On-Call Typing Kit REF 726070 Kit per test di tipizzazione tissutale HLA in biologia molecolare 10 test per HLA-A, B, C, DRB1, DRB3/4/5, DQ, DPB1 IVD 0123 Versione: 03/2014

Dettagli

Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine?

Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? Perche usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine? I gel di poliacrilammide hanno una trama piu compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu piccole

Dettagli

Genotipizzazione virale

Genotipizzazione virale Genotipizzazione virale Typing Separazione basata su maggiori differenze genetiche tra i membri di una singola specie virale Subtyping Individuazione di differenze stabili all interno di un gruppo di virus

Dettagli

Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole?

Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole? Sperimenta il BioLab Chi è il colpevole? Università degli Studi di Milano Settore Didattico, via Celoria 20, Milano Laboratorio 105 Indice 1. Conoscenze propedeutiche 1.1 Cosa è il DNA p. 3 1.2 Struttura

Dettagli

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG

BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 POS VIR 001 INT rev. 0 del 05/02/2008 ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI (OGM): MONITOR PCR HMG BIOTECNOLOGIE pag 1 di 12 Redatto: F.Gatto Verificato Responsabile Struttura Semplice: I.M.Ciabatti Verificato RQ: M.Guarducci Approvato Responsabile di Struttura Complessa: D.Amaddeo BIOTECNOLOGIE pag

Dettagli

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare

Quantificazione di. legionella pneumophila. mediante metodo biomolecolare Quantificazione di legionella pneumophila mediante metodo biomolecolare Laboratorio di Epidemiologia Genetica e Genomica di Sanità Pubblica Istituto di Igiene LABORATORIO DI EPIDEMIOLOGIA GENETICA: ATTIVITA

Dettagli