Strumenti, obiettivi e frontiere della terapia genica

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1 Strumenti, obiettivi e frontiere della terapia genica Michela A. Denti, PhD Centro Interdipartimentale per la Biologia Integrata Università degli Studi di Trento Trento, 11 Dicembre 2009 Le malattie genetiche Identificazione dei geni malattia Diagnosi genetica Terapia Genica Vettori virali per la terapia genica

2 Le malattie genetiche Il destino è nei geni? Malattie monogeniche: almeno 6.000, la maggior parte rare (<1/2000) Malattie multifattoriali o complesse: interazioni geneambiente, suscettibilità, più di un gene coinvolto Si stima che ogni anno il 6% dei neonati (8 milioni di bambini) nasca con un grave difetto di origine totalmente o parzialmente genetica! La diagnosi genetica Una delle più importanti applicazioni della tecnologia genica è la capacità di identificare mutazioni genetiche che causano malattie specifiche, o la predisposizione allo sviluppo di una malattia.

3 La diagnosi genetica: primo risultato della ricerca Test diagnostici: conferma di un sospetto clinico Test di identificazione di portatori sani: su familiari o screening di popolazioni Test preclinici o presintomatici effettuati prima dell insorgenza della malattia Test di suscettibilità fornisce una probabilità statistica di ammalarsi (es. BCRA1 o BCRA2) Problemi etici 1997 La scala della ricerca: dalla malattia alla cura (Fondazione Telethon Italia, 2007)

4 I tempi della ricerca ed i tempi della cura Fase I su un numero molto ristretto di volontari sani, obiettivo è determinare il meccanismo d azione e se il preparato è tollerato come previsto in base ai risultati sugli animali. Fase II su un numero ristretto di pazienti malati volontari; a gruppi diversi si somministrano dosi differenti del composto, per determinarne la dose più adatta a esercitare effetti terapeutici senza scatenare danni collaterali. Fase III su un numero di pazienti elevato e significativo, l obiettivo è verificare l effettiva efficacia del farmaco. Terapia genica -Sostituzione di un gene malato o mancante con uno sano -Correzione di un gene malato -Impedire al gene malato di esprimersi

5 Terapia genica -Somatica: si alterano solo cellule somatiche, il trattamento non è ereditabile ed influenza soltanto il singolo paziente -Germinale comporterebbe modificazione dei gameti o dell embrione: i cambiamenti verrebero passati alla generazione successiva. Non accettata al momento, non praticata: il problema è che le tecniche usate per la correzione germinale di malattie ereditarie sono esattamente le stesse che potrebbero essere usate per la manipolazione germinale di altre caratteristiche ereditarie Il 70% delle sperimentazioni di terapia genica in atto (tutte somatiche) riguarda i tumori. Terapia genica Primo protocollo di terapia genica in USA per una deficienza ereditaria del sistema immunitario -Oggi più di 900 protocolli in corso 2/3 per il trattamento di vari stadi e forme di cancro malattie cardiovascolari Malattie infettive (quasi tutti HIV) Disordini ereditarii autosomici recessivi provocati da difetti di un singolo gene, come la fibrosi cistica.

6 Vettori per la terapia genica somatica Per introdurre geni nelle cellule di un organismo umano servono dei vettori che: -Sappiano riconoscere le cellule bersaglio -Non vengano distrutti dal sistema immunitario del ricevente Espressione: transiente o permanente Introduzione: in vivo oppure ex vivo Terapia genica -In vivo Il gene bersaglio è introdotto nel tipo di cellule desiderato all interno del paziente. -Ex vivo Le cellule sono manipolate fuori dal corpo e quindi reimpiantate nel paziente. -Le cellule bersaglio devono essere rimuovibili, reiniettabili, a lunga vita, resistenti ed accessibili. -Introdotte ad es. mediante aerosol, iniezione nel torrente circolatorio o rimozione chirurgica e manipolazione -Spesso si usano cellule staminali perché si dividono attivamente (ma sono rare e non tollerano bene le manipolazioni)

7 Le due strategie principali per la terapia genica somatica Terapie cellulari Isolamento ed amplificazione di cellule (staminali) da paziente o da donatore Eventuale cura mediante terapia genica Re-infusione nel paziente

8 Trasferimento genico ex vivo in cellule staminali Vettori per la terapia genica somatica Vettori liposomici Vettori retrovirali Vettori adenovirali Vettori adenoassociati

9 Vantaggi: Vettori liposomici mancanza di tossicità mancanza di immunogenicità Svantaggi trasferimento genico scarsamente efficiente espressione transitoria I liposomi sono minuscole sfere lipidiche in cui il doppio strato lipidico intrappola il DNA. Il doppio strato lipidico può essere costruito in modo da far aumentare il legame a certi tipi cellulari, ad esempio tramite anticorpi, lipidi o carboidrati. I complessi plasmide-liposoma si fondono con la membrana plasmatica ed entrano nella cellula. La maggior parte del materiale non va al nucleo ma viene dirottata negli endosomi (organelli citoplasmatici in cui il materiale viene degradato). Una parte riesce ad arrivare al nucleo ma il DNA non si integra nei cromosomi della cellula ospite. Trasferimento genico mediato da liposomi

10 Vettori retrovirali Il 34% dei trial attuali di terapia genica utilizza retrovirus. I vettori retrovirali traggono vantaggio dalla capacità innata dei retrovirus di entrare in modo efficiente nelle cellule. Dopo l infezione il genoma a RNA è copiato in DNA dalla trascrittasi inversa ed integrato stabilmente nei cromosomi dell ospite. L integrazione non è del tutto casuale: tendenza ad inserirsi nei geni attivi. Non infettano con efficacia cellule che non si dividono (es. cellule nervose) poiché il DNA virale può raggiungere i cromosomi solo se la membrana nucleare viene demolita (divisione cellulare). Rischio di alterazione di funzioni di geni adiacenti o attivazione di un oncogene Vettori adenovirali Il 27% dei trial attuali di terapia genica utilizza adenovirus. La prima morte attribuita direttamente a terapia genica è avvenuta con vettori adenovirali Gli adenovirus sono una famiglia di virus a DNA a doppio filamento che infettano i vertebrati provocando malattie blande del tratto respiratorio, della congiuntiva e della cornea, del tratto gastrointestinale e del tratto genito-urinario. Hanno la capacità di infettare una vasta gamme di cellule che si dividono e che non si dividono. Sono tra i vettori più efficienti per il trasferimento genico in cellule di mammifero. Possono accogliere geni estranei di maggiori dimensioni. Svantaggio: poiché il DNA virale non si integra può essere necessaria la somministrazione ripetuta e questo può portare a risposta immunitaria.

11 La prima morte per terapia genica Prima del 17 Settembre 1999 si riteneva comunemente che la terapia genica somatica per il trattamento di una malattia grave fosse un opzione terapeutica corretta dal punto di vista etico: i benefici erano ritenuti maggiori di costi e rischi, per malattie mortali o terminali. Il 17 Settembre 1999 Jesse Gelsinger muore a causa di una risposta iperimmune contro la grande quantità di vettore necessaria per una terapia non mirata: il consenso generale è messo in discussione. Jesse Gelsinger, 18 anni, è relativamente sano ed ha una forma lieve di deficienza parziale di ornitina transcarbamilasi (OTC) che poteva anche essere controllata con la dieta e con i farmaci (anche se con un regime molto stretto). In questa malattia, per una incapacità a demolire correttamente le proteine della dieta si ha accumulo tossico di ammoniaca. La prima morte per terapia genica In un trial clinico, il 13 settembre 1999 Gelsinger riceve un alta dose di vettore adenovirale contenente il gene OTC nella vena porta (che irrora il fegato): 38 miliardi di miliardi di particelle virali (la dose più alta mai somministrata in un trial clinico. Solo l 1% raggiunge il fegato. Non si osserva espressione significativa del gene. Le particelle virali invasero tutti gli altri organi del corpo successivamente esaminati: milza, polmoni, tiroide, cuore, rene, testicoli, cervello, pancreas, linfonodi, midollo osseo, vescica. Quattro giorni dopo Gelsinger morì a causa di una risposta infiammatoria sistemica alle proteine virali che portò ad insufficienza generalizzata degli organi.

12 La prima morte per terapia genica 21 Gennaio 2000 L FDA (US Food and Drug Administration) chiuse 5 trial di terapia genica dell Università della Pennsylvania dopo aver scoperto gravi mancanze nella supervisione e nel monitoraggio di questo trial in 18 aree. Ad esempio: -I pazienti non erano stati informati della morte di due scimmie Rhesus che avevano ricevuto il trattamento sperimentale - i moduli di consenso informato non erano stati compilati in modo appropriato 5 anni dopo il Dipartimento di Giustizia degli Stati Uniti commina multe pesanti ed opera restrizioni alla ricerca clinica per i ricercatori e l istituzione. Vettori virali adeno-associati I virus adeno-associati (AAV) hanno un genoma a DNA a singolo filamento, non causano alcuna malattia negli esseri umani e tendono a rimanere inattivi in assenza di adenovirus. Sono considerati sicuri, perché non si integrano nei cromosomi dell ospite. Hanno lo svantaggio di non poter accomodare grossi pezzi di DNA.

13 Interferenza a RNA e micro RNA Ambros, V. A (1989). Arasu P, Wightman B, Ruvkun G. (1991). Napoli et al., (1990) Jorgensen et al., (1996) L RNA interference (RNAi) è un processo naturale di silenziamento post-trascrizionale dell espressione genica iniziato da RNA a doppio filamento (dsrna) di sequenza omologa al gene target. dsrna nucleo cap RNA target AAAAAA

14 L RNA interference (RNAi) è un processo naturale di silenziamento post-trascrizionale dell espressione genica iniziato da RNA a doppio filamento (dsrna) di sequenza omologa al gene target. nucleo Uso terapeutico dell RNA interference 19 nt duplex Respiratory syncitial virus, Fase II Diabetic Macular Edema, Fase II Acute kidney injury, Fase I Tumore epatico, Fase I Tumori solidi, Fase I 2 nt 3 overhangs Age-related Macular Degeneration, Fase II

15 Uso terapeutico dell RNA interference Trial clinico per uso di RNA interference contro HIV (Benitec/City of Hope) Fase II Terapie di splicing Distrofia Muscolare di Duchenne (DMD) Nei muscoli degli individui affetti da DMD manca una proteina: la distrofina. La distrofina e richiesta per il mantenimento del muscolo e previene l atrofia muscolare. proteina= 427 KDa

16 DNA: l informazione genetica nei nostri geni Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene Pre-mRNA: la copia esatta del DNA di un gene Introne Introne ESONE 1 ESONE 2 ESONE 3 ESONE 1 ESONE 2 ESONE 3 mrna RNA messaggero

17 DNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE Pre-mRNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE DNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE Pre-mRNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE

18 DNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE Pre-mRNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE mrna STOVIACONMIAZIAPERTREORE DNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE Pre-mRNA STOTOMVIAATICONPIQMIAURDIZIAITPEROVINTREALORE mrna STOVIACONMIAZIAPERTREORE STO VIA CON MIA ZIA PER TRE ORE

19 mrna RNA messaggero, porta l informazione dal DNA alle proteine ESONE 1 ESONE 2 ESONE 3 proteina i mattoni che costituiscono le cellule Delezioni e mutazioni puntiformi nel gene della distrofina. Nella piu lieve Distrofia Muscolare di Becker (BMD) la distrofina e presente, anche se mutata o in quantita minori. Delezione frame-shift : Delezione non frame-shift : DNA AAG CT GCA AAG GCA Splicing AAG CU STOP AAG CU STOP GCA GCA DEGRADAZIONE Pre-mRNA mrna 47 AAG TRADUZIONE AAG GCA Distrofina GCA 52 Splicing DMD BMD

20 DMD CO STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E BMD CON MIA ZIA STO VIA PER TRE ORE DMD CO STO VIA NMI AZI APE RTR EOR E BMD CON MIA ZIA STO VIA PER TRE ORE

21 Exon skipping o cerotto molecolare per la correzione di mutazioni DMD DNA AAG CT GCA Pre-mRNA AAG GCA Splicing mrna AAG GCA Traduzione Distrofina Exon Skipping o cerotto molecolare Uso di oligonucleotidi antisenso (AON): piccoli frammenti di DNA che si legano all esone da saltare e ne inibiscono l inclusione nell RNA messaggero Dr. J.C.T. van Deutekom, Olanda MDEX Consortium Prosensa

22 oligonucleotidi antisenso E1 E2 E3 E1 E3 Molecole di RNA antisenso come cerotto molecolare 47 RNA ANTISENSO AAG 51 GCA 47 AAG GCA 52 AAAAAAA

23 Vantaggi:uso di vettori virali 5 -ITR U1/U7 promoter Antisense CMV promoter GFP Wpre 3 -ITR SV40 misc intron BGH pa Produzione di Particelle virali Somministrazione locale o sistemica 5 3 Produzione dell RNA antisenso e correzione molecolare del difetto Molecole di RNA antisenso come cerotti molecolari RNA ANTISENSO E1 E3 3 E2 E1 E3 AAAAAAA Alcuni esempi di mutazioni che si possono correggere con exon skipping: Distrofia Muscolare di Duchenne Beta-Talassemia Fibrosi Cistica Malattie Metaboliche (Malattie da accumulo lisosomiale) Retinopatie Demenza Frontotemporale con Parkinsonismo legata al cromosoma 17 3

24 Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata al cromosoma 17 (ftdp-17) E9 E10 E11 nei neuroni sani E9 E11 E9 * E10 E11 nei neuroni di pazienti FTDP-17 E9 E10 FTDP-17 E11 Tau microtubule associated protein Exon skipping indotto da RNA antisenso per la terapia genica della Demenza FrontoTemporale con Parkinsonismo associata al cromosoma 17 (ftdp-17) E9 * E10 E11 RNA antisenso nei neuroni di pazienti FTDP-17 curati E9 E11

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