I geni della fioritura e le loro implicazioni nella ricerca applicata alle specie ornamentali

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1 Review n. 1 Italus Hortus 14 (1), 2007: I geni della fioritura e le loro implicazioni nella ricerca applicata alle specie ornamentali Annalisa Giovannini * CRA Istituto Sperimentale per la Floricoltura, corso Inglesi 508, Sanremo (IM) Ricevuto: 31 gennaio 2007; accettato: 8 marzo 2007 The genes for flowering and their involvement in ornamental applied research Abstract. Classical breeding together with the most advanced techniques in molecular biology have been applying to a wide variety of species, contributing to the elucidation of molecular mechanisms in plant development. The recent discoveries of the mechanisms of flowering in the model plants Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana and Petunia hybrida allowed new sets of genes to be available. These include genes which affect flowering time and flower architecture, commonly named: flowering-time genes, meristem-identity genes and organ-identity genes. Studies in Arabidopsis have led to the identification of components within individual signaling pathways that affect flowering and to their positioning within molecular hierarchies. Currently four genetic pathways have been identified: the light-dependent, the autonomous, the vernalization and the gibberellin pathway, all integrated by the function of regulatory genes at the integration pathway. Furthermore, distinct signaling pathways are known to converge on the activation of the same integrator genes. This convergence of pathways on a common set of genes may enable the integration of different responses, so that the plant can produce a coordinated flowering response under conditions in which multiple environmental and endogenous parameters are changing simultaneously. The possibility of using molecular techniques to transfer genes in major ornamentals has greatly increased the resources available to plant breeders. Flower induction genes could affect flowering in species unrelated to the plant from which they were isolated. Moreover, native genes can be overexpressed or suppressed. In the near future plant biotechnologists and plant breeders will continue to work alongside to improve floricultural plants. Key words: Arabidopsis thaliana, agricultural biotechnology, flowering-time genes, meristem-identity genes, organ-identity genes. * annalisa.giovannini@entecra.it Introduzione La capacità di manipolare la crescita e lo sviluppo delle colture è da sempre stata una prerogativa essenziale per l industria delle piante ornamentali. La domanda di alcuni prodotti aumenta esponenzialmente in funzione di particolari ricorrenze (ad esempio la Poinsettia a Natale). La possibilità di poter regolare il tempo di fioritura di alcune produzioni senza costi aggiuntivi potrebbe migliorare la programmazione o estendere la stagione di fioritura dove le condizioni ambientali non lo consentono. La ricerca della bellezza e della novità spinge la creatività degli ibridatori verso architetture fiorali sempre più spettacolari. La transizione dalla fase di crescita vegetativa a quella riproduttiva nelle piante superiori è regolata da fattori endogeni ed ambientali (Araki, 2001). Negli ultimi anni la conoscenza sui meccanismi genetici e molecolari che sono alla base dell induzione della fioritura, della determinazione dei meristemi fiorali e dello sviluppo degli organi del fiore, ha fatto passi da gigante, anche grazie agli studi approfonditi sulle tre specie modello: Antirrhinum majus, Petunia hybrida e Arabidopsis thaliana. E proprio sulla piccola piantina appartenente alla famiglia delle Brassicacee che si sono concentrati gli sforzi di numerosi gruppi di ricerca al fine di identificare i geni coinvolti nella fioritura. L Arabidopsis è di piccole dimensioni, quindi facilmente manipolabile, ha un ciclo vitale molto breve (8-16 settimane), produce fino a diecimila semi per pianta che germinano in due-tre giorni, è una pianta autogama ed il suo piccolo genoma di circa ventiseimila geni è stato sequenziato. Si presta alla trasformazione mediante Agrobacterium tumefaciens e sono disponibili svariate collezioni di mutanti. I meccanismi che intervengono nella definizione dello schema di sviluppo del fiore di Arabidopsis hanno cominciato ad essere parzialmente compresi. Nel meristema fiorale, tramite l azione combinata di divisione, differenziamento e allungamento delle cellule, si sviluppano gli organi che costituiscono i fiori. E risultato chiaro che la posizione relativa di una cellula all interno di un organismo è ciò che 50

2 Geni della fioritura istruisce quella cellula sul tipo di strutture che essa e la sua discendenza dovranno formare. Questa informazione riguardo alla posizione è trasmessa attraverso combinazioni o gradienti di proteine regolatrici (fattori trascrizionali), che sono presenti in regioni specifiche dell organismo. Sono stati identificati più di 80 geni coinvolti nell induzione della fioritura e si è capito che la fioritura in questa specie è regolata da due vie di trasmissione del segnale che rispondono all ambiente (fotoperiodo/giorno lungo e temperatura/vernalizzazione) e da due vie che funzionano indipendentemente dai fattori ambientali: il percorso autonomo e quello legato alle gibberelline (Giovannini, 2006). Queste vie metaboliche sono costituite in modo semplificato da diverse componenti (il segnale, il recettore, il trasduttore, il fattore di trascrizione e da uno o più geni bersaglio) obbligatoriamente collegate durante la trasmissione dell informazione e sono, a loro volta, regolate da proteine regolatrici potenzialmente diverse. Anche i geni bersaglio che esse controllano sono diversi e specifici nel contesto in cui si trovano (Carroll et al., 2004). Le quattro vie di trasmissione del segnale in Arabidopsis convergono verso una via integrativa, che porta all induzione dei geni per l identità del meristema fiorale ed allo sviluppo degli organi del fiore. Partirò proprio dalla formazione degli organi, per poi tornare temporalmente indietro, verso la determinazione dei meristemi fiorali, e ancora più indietro fino all induzione della fioritura, per illustrare le funzioni dei principali geni coinvolti in questo affascinante schema di sviluppo e valutare le loro applicazioni nel campo della ricerca sulle specie ornamentali. La morfologia del fiore è specificata dai geni per l identità degli organi fiorali: floral organ identity genes La bellezza dei fiori è imputabile all assortimento Fig. 1 - Il fiore della specie ornamentale Passiflora serratifolia L. che mostra brillantemente la posizione dei quattro verticilli concentrici dove si sviluppano gli organi del fiore: dall esterno all interno i sepali, i petali sfrangiati, gli stami ed i carpelli. Fig. 1 - The flower of the ornamental species Passiflora serratifolia L. smartly showing, from outer to inner, the four concentric whorls of organs: sepals, petals, stamens and carpels. dei quattro tipi di organi situati rispettivamente in quattro verticilli concentrici: i sepali nel primo, i petali nel secondo, gli stami nel terzo ed i carpelli (che contengono gli ovuli) nel quarto (fig. 1). Lo sviluppo organogenetico è sotto il controllo genetico e, grazie all isolamento di piante che hanno organi giusti in una posizione scorretta (mutanti omeotici), è stato possibile definire i geni (tab.1) responsabili dell identità degli organi fiorali (Meyerowitz et al., 1989). Il primo gene omeotico ad essere clonato è stato DEFI- CIENS di Anthirrinum (Sommer et al., 1990), seguito da AGAMOUS di Arabidopsis (Yanofsky et al., 1990). I geni codificavano fattori di trascrizione con una somiglianza con la struttura del gene SRF presente nell uomo e nel lievito. Ciascuno di questi geni contiene una sequenza di 56 amminoacidi che è necessaria alla proteina per legarsi al DNA; con la prima lettera dei geni MCM1, AGAMOUS, DEFI- Tab. 1 - Principali geni che determinano l identità degli organi fiorali in Arabidopsis thaliana. Tab. 1 - Representative floral organ-identity genes in Arabidopsis thaliana. Nome del gene Abbreviazione Famiglia genica Bibliografia APETALA 1 APETALA2 APETALA3 PISTILLATA AGAMOUS SUPERMAN SEPALLATA AP1 AP2 AP3 PI AG SUP SEP Fattore di trascrizione a dominio AP2 Chen, 2004 Yanofsky et al., 1990 Pelaz et al.,

3 Giovannini CIENS e SRF è stato coniato il termine MADS per descrivere la classe di questi fattori di trascrizione. Le proteine MADS-box nelle piante funzionano insieme, in complessi detti a quartetto, per regolare una serie di geni subordinati e specificare così l identità degli organi fiorali (Theissen, 2001). Il modello di sviluppo postulato nel 1991 da Coen e Meyerowitz in Arabidopsis sembra essere molto conservato: i geni di classe A APETALA (AP1 and AP2) specificano l identità dei sepali e dei petali che si sviluppano nei verticilli 1 e 2; inoltre reprimono l attività dei geni di classe C nei verticilli 1 e 2. I geni di classe B APETALA3 (AP3) epistillata (PI) sono necessari per specificare l identità dei petali nel secondo verticillo (A+B petali) e degli stami nel verticillo 3. Il gene della classe C AGAMOUS (AG) è necessario per specificare l identità del terzo verticillo (B+C stami) e del 4 (carpelli). La seconda funzione dei geni di classe C è quello di reprimere l attività della classe A nelle spirali 3 e 4. Geni ortologhi ai geni ABC sono stati isolati in Antirrhinum (Ma e depamphilis, 2000), petunia (Van der Krol e Chua, 1993) e gerbera (Yu et al., 1999). La scoperta di un altro gruppo di geni MADS-box chiamati SEPALLA- TA1, 2 and 3 (Pelaz et al., 2000) e coinvolti in modo ridondante nel definire i petali, gli stami e i carpelli ha portato ad una revisione del modello ABC. I geni SEP sono stati definiti di classe E. Il modello ABCE (Jack, 2004) postula che i sepali sono specificati solamente dall attività dei geni di classe A (tetramero di proteine AP1), i petali da A+B+E (tetrametro di proteine AP1-SEP-AP3-PI), gli stami da B+C+E (tetrametro di proteine AP3-PI-AG-SEP) ed i carpelli da C+E (tetrametro di proteine AG-AG-SEP-SEP). Esiste un altro gruppo di geni, identificato inizialmente in petunia, che era stato chiamato di classe D (Colombo et al., 1995). I due geni FBP7 e FBP11 specificano l identità della placenta e dell ovulo in petunia; gli ortologhi in Arabidopsis STK, SHP1 and SHP2 (Pinyopich et al., 2003) sono necessari per il corretto sviluppo degli ovuli. Il modello di sviluppo organogenetico del fiore delle Angiosperme è quindi stato chiamato ABCDE. Studi recenti hanno dimostrato che l espressione del gene AP2 è inibita a livello post-trascrizionale dal microrna mir172 (Aukerman e Sakai, 2003). I microrna sono RNA di 20 nucleotidi non codificanti che regolano l espressione degli mrna codificanti proteine, attraverso meccanismi di degradazione dei trascritti o di inibizione della traduzione (Hutvagner e Zamore, 2002). Piante di Arabidopsis transgeniche con elevati livelli della proteina AP2 hanno manifestato un meristema fiorale indeterminato, che produceva numerosi stami o petali, mentre una sovraespressione di mir172 ha portato ad una riduzione della proteina AP2 ed un fenotipo a fioritura precoce e difetti nell identità degli organi fiorali (Aukerman e Sakai, 2003; Chen, 2004). I siti di riconoscimento di mir172 sui geni apetala-simili sono molto conservati nelle angiosperme ed è stato quindi dimostrato che l espressione transgenica di mir172 di Arabidopsis in specie eterologhe (Nicotiana benthamiana) può provocare alterazioni nel normale sviluppo del fiore (Mlotshwa et al., 2006). I geni che specificano l identità dei meristemi fiorali: flower meristem identity genes Gli organi del fiore si sviluppano sulle infiorescenze dal meristema fiorale. La transizione da meristema dell infiorescenza a meristema fiorale coinvolge cambiamenti nell identità, nella fillotassi e nella determinazione del meristema. In seguito all induzione della fioritura i meristemi dell apice vegetativo acquisisco- Tab. 2 - Alcuni geni che partecipano alla determinazione dell identità dei meristemi fiorali in Arabidopsis thaliana. Tab. 2 - Representative flower meristem-identity genes in Arabidopsis thaliana. Nome del gene Abbreviazione Famiglia genica Bibliografia TERMINAL FLOWER1 LEAFY EMBRYONIC FLOWER2 CAULIFLOWER FRUITFULL APETALA 1 UNUSUALFLORALORGANS WUSCHEL TFL1 LFY EMF2 CAL FUL AP1 UFO WUS PEBP, simile a inibitori della Raf1 kinase animale Fattore trascrizionale MYB PcG (Polycomb Group) F-box Omeobox Bradley et al., 1996 Weigel et al., 1992 Sung et al., 2003 Gu et al., 1998 Simon et al., 1996 Mayer et al.,

4 Geni della fioritura no la competenza a diventare meristemi dell infiorescenza e generano infiorescenze laterali o meristemi fiorali, in una fillotassi spiralata. I geni coinvolti nella determinazione dei meristemi fiorali (tab. 2) sono stati identificati per la prima volta in mutanti in cui i fiori erano sostituiti da germogli con caratteristiche di infiorescenze. Il gene FLORICAULA di Anthirrhinum (Coen et al., 1990) ed il suo ortologo LEAFY di Arabidopsis (Weigel et al., 1992), codificano fattori di trascrizione che impongono l identità fiorale ai primordi che si sviluppano lateralmente al meristema apicale, dopo l induzione della fioritura. Le interazioni fra LFY e tre geni MADS-box, AP1, CAL e FUL reprimono TERMINAL FLOWER 1 (TFL1), che mantiene il meristema apicale dell infiorescenza in uno stato indeterminato a crescita illimitata (Boss et al., 2004). L espressione costitutiva di LFY in Arabidopsis accelera il tempo di fioritura: le piante convertono precocemente le foglie ed i germogli ascellari in fiori (Weigel e Nilsson, 1995). In queste piante transgeniche l espressione di AP1 era aumentata nel primordio fiorale e si ritrovava anche nelle foglie (Liljegren et al., 1999). Quindi LFY induce l espressione di AP1 (Wagner et al., 1999). Geni ortologhi ai geni che specificano l identità del meristema fiorale (LFY, AP1 e TLF1) sono stati isolati nella bocca di leone (FLO, SQUA and CEN), così come i loro geni co-regolatori UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO). Durante i primi stadi di sviluppo del fiore sia LFY che AP1 sono espressi in tutto il meristema fiorale (Gustafson-Brown et al., 1994). LFY stimola i geni che determinano l identità degli organi fiorali funzionando insieme al gene co-attivatore WUSHEL (WUS) per attivare il geni di classe C class gene AG ed insieme ad UFO per attivare il gene di classe B AP3. AP1 insieme ad UFO hanno un effetto di regolazione positiva sul gene di classe B AP3 (Jack, 2004). LFY è positivamente regolato dei geni della via metabolica delle gibberelline (GAs), dal gene CONSTANS e dai geni della via integrata FT e SOC1 (Blazquez et al., 2006), descritti nel prossimo paragrafo. I geni delle vie metaboliche che controllano il tempo della fioritura: flowering time genes In Arabidopsis sono state identificate quattro vie metaboliche (del fotoperiodo, della vernalizzazione, quella autonoma e quella delle gibberelline) che regolano l induzione della fioritura e sono integrate fra loro da una quinta via metabolica, definita integrativa (tab. 3). Il gene FLOWERING LOCUS C (FLC) codifica un fattore di trascrizione, che è principalmente espresso negli apici vegetativo e radicale, e agisce come repressore della fioritura, regolando negativamente i geni della via metabolica integrata FLOWERING TIME (FT), LFY e SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1 (SOC1). Una volta espressi i geni FT, LFY e SOC1a loro volta attivano i geni dell identità dei meristemi fiorali, dando inizio al processo di fioritura. Diverse vie metaboli- Tab. 3 - Alcuni geni rappresentativi delle vie metaboliche che in Arabidopsis portano all induzione della fioritura. Tab 3 - Representative genes of the different genetic pathways that participate to flower induction in Arabidopsis thaliana. Via metabolica Abbreviazione Nome del gene Famiglia genica Bibliografia Fotoperiodo (luce dipendente) Vernalizzazione Autonoma Gibberelline Integrativa CO PHY CRY FRI VIP VNR2 FCA LD FPA FLD GA FLC SOC1 FT CONSTANS PHYTOCHROME CRYPTOCHROME FRIGIDA VERNALIZATION INDEPENDENCE VERNALIZATION2 FLOWERING CA LUMINIDEPENDENS FLOWERING PA FLOWERING LOCUS D GIBBERELLIN FLOWERING LOCUS C SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS FLOWERING LOCUS T Fattore di trascrizione a dita di zinco Fitocromo Criptocromo Genebank accession AF PcG (Polycomb Group) PcG (Polycomb Group) Dominio che si lega all RNA Omeodominio Dominio che si lega all RNA Istone deacetilasi Ormone vegetale PEBP simile a inibitori della Raf1 kinase Putteril et al., 1995 Mathews e Sharrock, 1997 Levy e Dean, 1998 Johanson et al., 2000 Zhang e van Nocker, 2002 Gendall et al., 2001 Macknight et al., 1997 Lee et al., 1994 Schomburg et al., 2001 He et al., 2003 Wilson et al., 1992 Michaels e Amasino, 1999 Samach et al., 2000 Kardailsky et al.,

5 Giovannini che convergono per regolare i livelli di espressione di FLC. Esso inoltre gioca un ruolo centrale nella risposta alla vernalizzazione ed è negativamente regolato dalla via autonoma. E stato proposto (Sung et al., 2003) che i geni EMBRIONIC FLOWER (EMF) possano funzionare indipendentemente da una via metabolica e che siano dei repressori dello sviluppo che permettono alla pianta di mantenere uno stato vegetativo. Un nuovo meccanismo di regolazione, basato sulla struttura della cromatina, è stato ipotizzato come spiegazione dell azione repressiva dei geni EMFs (Moon et al., 2003). Il gene EARLY BOLTING IN SHORT DAYS (EBS) fa parte di un complesso repressore trascrizionale che modula la struttura della cromatina ed è necessario per reprimere l espressione di FT e bloccare la fioritura nei giorni corti (Piñeiro et al., 2003). Fotoperiodo Uno dei fattori esterni che maggiormente influenzano la fioritura è la qualità e la durata dello stimolo luminoso. Lo sviluppo riproduttivo avviene quando i giorni sono sufficientemente corti (piante brevidiurne) o sufficientemente lunghi (piante longidiurne). In Arabidopsis thaliana, che fiorisce in condizioni di giorno lungo in primavera, la percezione della lunghezza del giorno nelle foglie avviene per opera di geni che agiscono a cascata nella traduzione del segnale. La luce rossa è accettata da proteine del citocromo codificate dai geni PHYTOCHROME (PHYA- PHYE). I recettori per la luce blu denominati criptocromi sono proteine codificate dai geni CRYPTOCH- ROME CRY1 e CRY2 (Levy e Dean, 1998). In presenza di luce rossa PHYB reprime la funzione di CON- STANS (Putteril et al., 1995). Il gene CONSTANS è un fattore trascrizionale che contiene il dominio denominato dita di zinco e stimola la fioritura attivando l espressione dei geni FT, LFY e SOC1 (Samach et al., 2000). L espressione di CO oscilla in modo circadiano con un picco di mrna intorno al crepuscolo nei giorni lunghi e durante la notte in giorni corti (Valverde et al., 2004). La proteina CO è molto labile al buio, viene degradata dal proteasoma e si accumula solo nei giorni lunghi inducendo la trascrizione del gene FT nella foglia. Il trascritto del gene FT si muove dalla foglia all apice vegetativo, dove la proteina tradotta induce la formazione dei meristemi fiorali (Huang et al., 2005). Sotto la luce blu CRY2 inibisce PHYB e induce la fioritura (Lin, 2002). CRY1 coopera con CRY2 per reprimere la funzione dei geni CONSTANS (CO) e GIGANTEA (GI). Una mutazione puntiforme nel gene CRY2 conferisce un fenotipo a fioritura precoce in condizioni di giorno corto in una accessione tropicale di Arabidopsis (El-Din El-Assal, 2001). La proteina GI è espressa con un ritmo circadiano. Vernalizzazione Il controllo genetico del fenomeno della vernalizzazione è stato scoperto grazie agli incroci effettuati fra ecotipi annuali, che per fiorire richiedono un periodo di freddo ed ecotipi estivi, che non lo necessitano (Michaels e Amasino, 2000). Diversi geni sono stati isolati fra i quali FRIGIDA (FRI), un regolatore positivo di FLC. L ecotipo di Arabidopsis a fioritura precoce Columbia presenta delle mutazioni nel gene FRI (Johanson et al., 2000). L analisi molecolare dei geni suggerisce che la vernalizzazione agisce riducendo l espressione del repressore della fioritura (FLC) in risposta ad un estesa esposizione al freddo. Il gene VERNALIZATION INSENSITIVE3 (VIN3) codifica per una proteina che contiene un dominio PHD ed è tradotto solo dopo un prolungato periodo di freddo (Sung e Amasino, 2004). Altri due geni VERNALIZA- TION (VRN) 1 e VRN2 (Gendall et al., 2001) hanno un azione repressiva su FLC, mantenendo la cromatina in uno stato non codificante. I geni VERNALIZA- TION INDEPENDENCE (VIP1-VIP7) codificano anch essi per proteine regolatrici della struttura della cromatina (Zhang e van Nocker, 2002). Autonoma La via metabolica autonoma è stata identificata studiando piante mutanti che fioriscono tardi in qualsiasi condizione di fotoperiodo e sono molto sensibili alla vernalizzazione (Koornneef et al., 1991). Dal momento che tutti i mutanti contengono alti livelli di mrna del repressore FLC è ipotizzabile che nelle piante normali i geni della via autonoma regolano negativamente l espressione di FLC. Alcuni geni della via metabolica sono stati clonati fra i quali LUMINIDEPENDENS (LD), FCA e FPA, che sono maggiormente espressi nell apice e nelle infiorescenze e poco espressi nelle foglie mature e nelle radici (Simpson et al., 2004). Il gene FLOWERING LOCUS D (FLD) codifica per una proteina, omologa ad un membro del complesso dell istone deacetilasi umana che, deacetilando la cromatina di FLC, ne previene la trascrizione (He et al., 2003). Gibberelline Le gibberelline (GAs) sono ormoni vegetali coinvolti in molti aspetti della crescita delle piante ed in Arabidopsis promuovono la fioritura (Wilson et al., 1992). Alcuni geni coinvolti nella biosintesi delle gibberelline sono stati isolati e clonati, e sembra agiscano 54

6 Geni della fioritura aumentando l attività trascrizionale del gene LEAFY (Blázquez et al., 1998). In Lolium temulentum (King ed Evans, 2003), l aumento di GA nella foglia ed il trasporto verso l apice in giornate lunghe è uno dei fattori che stimola la fioritura. Nella cultivar di uva champagne Pinot Meunier invece le gibberelline inibiscono la fioritura (Boss e Thomas, 2002). Applicazioni in alcune specie di interesse commerciale Le tecniche di colture in vitro, rigenerazione e trasformazione genetica applicate alle piante ornamentali hanno permesso di ottenere piante transgeniche in più di 40 specie (Brand, 2006), comprese le specie commercialmente più importanti (rosa, crisantemo, garofano, petunia, orchidea, ciclamino, geranio, ecc.). Il miglioratore genetico molecolare è sempre a caccia di nuovi geni che possano modificare il colore e la struttura del fiore, l architettura e l altezza delle pianta, l aroma, la durata del fiore o del vaso fiorito, la resistenza ad insetti o malattie, una volta trasferiti ed espressi nella specie di interesse (Yalcin-Mendi et al., 2006). I recenti sviluppi delle conoscenze scientifiche sulle vie metaboliche di trasmissione del segnale, che inducono la fioritura in Arabidopsis, hanno portato all identificazione di nuove classi di geni utilizzabili per ottenere precocità di fioritura (Roux et al., 2006). In alcuni casi questi geni hanno modificato il tempo della fioritura in specie evolutivamente lontane da quelle in cui sono stati isolati. L espressione del gene PHYB1 di tabacco in crisantemo ha prodotto piante di statura ridotta, ma con pochi effetti sulla formazione e lo sviluppo del fiore (Zheng et al., 2001). La sovraespressione del gene PHYA di avena nella cultivar di Aster Sun Karlo ha ridotto la durata della lunghezza critica del giorno richiesta per l induzione della fioritura. La sovraespressione dei geni PHYA e PHYB (di Arabidopsis) ha inoltre aumentato il numero di rami fioriti prodotti per pianta, migliorando la resa produttiva delle colture transgeniche di Aster (Wallerstein et al., 2002). In altre specie (Populus) l espressione costitutiva dei fitocromi ha prodotto alterazioni morfologiche e fisiologiche commercialmente inutilizzabili (Olsen et al., 1997). L uso di promotori inducibili e tessuto specifici, che permettano un espressione temporale e spaziale mirata è auspicabile per poter ottenere dei vantaggi produttivi nel settore delle piante ornamentali (Franklin e Whitelam, 2006). Il gene CONSTANS (CO) di A. thaliana Landsberg erecta (Putteril et al., 1995) è stato trasferito nel genoma della pianta ornamentale Osteospermum ecklonis (Asteraceae) con lo scopo di alterare l induzione della fioritura. Il cdna di CO è stato clonato nel vettore di espressione pgreen, sotto il controllo del promotore costitutivo 35S. La trasformazione genetica del tessuto fogliare di piante di Osteospermum micropropagate è stata effettuata utilizzando il vettore Agrobacterium tumefaciens, ceppo AGL1. L espressione del gene esogeno CO è stata riscontrata nelle foglie di piante transgeniche (Giovannini et al., 2002), ma non si è ottenuto il fenotipo a fioritura precoce, osservato in piante di Arabidopsis che sovraesprimevano il gene (Putterill et al., 1995). L espressione costitutiva del gene LFY ha indotto la fioritura nel pioppo ibrido (Coupland, 1995) e nel limone (Peña et al., 2001), riducendo la fase giovanile. Il gene AP1 è stato efficiente come LFY nell indurre la fioritura in limone senza produrre anomalie nello sviluppo, mentre non sembra aver avuto effetto nel pioppo (Weigel e Nilsson, 1995) e in O. ecklonis (Giovannini, com. pers.). L espressione di geni eterologhi non è sempre prevedibile e richiede un elevato numero di tentativi per arrivare ad un risultato efficace. La conservazione della sequenza dei geni regolatori fra specie e generi diversi ha permesso di identificare famiglie geniche basandosi sulla somiglianza del DNA. Le tecniche di biologia molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR) con primer oligonucleotidici degenerati (miscela di corti oligonucleotidi che si appaiono con tutte le possibili combinazioni di codoni) e lo screening di genoteche (insieme di frammenti di DNA o cdna isolati casualmente) hanno facilitato l isolamento di geni omologhi da organismi modello. Entrambe le tecniche si fondano sulla capacità di individuare la somiglianza di sequenze attraverso l ibridazione di acidi nucleici. L avvento dei progetti di sequenziamento dei genomi ha messo a disposizione una grande quantità di dati computerizzati da utilizzare per il confronto di sequenze. La facilità di studiare sequenze di DNA differenzialmente espresse (microarray, Expressed Sequence Tag data base) ed il confronto immediato in banche dati, accessibili a tutti (GenBank, EMBL- Nucleotide Datatbase, ecc.), hanno fatto aumentare il numero di geni depositati ogni anno in modo esponenziale. Più di 100 specie vegetali sono ormai rappresentate in banche dati di geni espressi (EST data base) con più di entrate ( incluse le specie ornamentali Antirrhinum majus, Zinnia elegans, Petunia, Rosa e Alstroemeria peruviana. Geni omologhi ai principali fattori di trascrizione coinvolti nella fioritura, sono stati identifi- 55

7 cati nelle specie ornamentali Lilium longiflorum Thunb. (Benedito et al., 2004), Phalaenopsis (Chen et al., 2005), Gerbera hybrida (Laitinen et al., 2005) e Passiflora spp. (Dornelas et al., 2006), aprendo nuove prospettive al miglioramento genetico molecolare. Il gene omologo al gene induttore della fioritura FT di Arabidopsis è stato isolato nella specie forestale Populus trichocarpa (PtFT1) ed espresso in modo costitutivo nella specie Populus tremula x tremuloides. I tessuti trasformati hanno sviluppato strutture fiorali direttamente dagli steli co-coltivati in quattro settimane, rispetto al tempo normale di fioritura del pioppo, che varia da otto a venti anni. Gli autori hanno anche rigenerato una linea transgenica di una pianta femminile di Populus tremula a fioritura precoce con fiori normali (Böhlenius et al., 2006). La strategia del silenziamento genico è stata applicata con successo da Fang et al. (2006), che hanno ottenuto un fenotipo di Thellungiella halophila (crescione) a fioritura precoce, eliminando la necessità del trattamento al freddo. Inizialmente hanno isolato il gene omologo al gene repressore della fioritura FLC di Arabidopsis, utilizzando primers costruiti sulle parti conservate del gene. In un secondo tempo hanno costruito un RNAi (RNA interference) per silenziare il gene FLC di Thellungiella (ThFLC) a livello post-trascrizionale. Le piante transgeniche contenenti il costrutto ThFLC RNAi non esprimevano la proteina codificata da ThFCL: il ciclo vitale della pianta è risultato ridotto da venti a quindici settimane, la fioritura è avvenuta dopo otto settimane, rispetto alle quarantacinque necessarie ai controlli per fiorire in assenza di vernalizzazione. Prospettive future Un giorno, quando il diagramma fiorale sarà definitivamente compreso e saranno stati isolati i corrispettivi geni nelle specie ornamentali, si riuscirà a programmare a tavolino l aspetto dei nuovi fiori del futuro, manipolando i geni coinvolti nella determinazione degli organi. L Università della California ha già attuato dei programmi di ricerca al fine di produrre fiori transgenici, con strutture uniche ed esotiche, in cui tutti e quattro gli organi sono sepali (attraverso la soppressione dell azione dei geni SEPALLATA), o fiori in cui si ha una trasformazione dei sepali in petali (over espressione selettiva dei geni SEPALLATA). L ottenimento di fiori con un elevato numero di petali è da sempre stata una prerogativa del miglioratore genetico, che ha selezionato mutazioni genetiche spontanee o indotte, al fine di ottenere, ad esempio, rose con 40 petali, partendo dai 5 presenti nelle rose selvatiche. Le tecnologie di espressione selettiva e di silenziamento genico potranno essere applicate con successo anche nelle specie ornamentali, per le quali saranno stati identificati i geni che inducono (FT omologhi) o che reprimono (FLC omologhi) la fioritura, al fine di dissociare la produttività delle colture dai fenomeni ambientali esterni, come ad esempio dalla vernalizzazione. La storia delle scoperte dei geni che controllano l induzione e lo sviluppo del fiore fornisce un importante conferma della capacità di interazione fra la genetica classica e la genetica molecolare. Lo studio attento dei mutanti a livello fenotipico ha portato a fare delle previsioni riguardo all espressione molecolare dei geni, successivamente confermate da esperimenti di over espressione o soppressione della funzione genica nella pianta. Nel prossimo futuro, come auspicato da Morandini e Salamini (2003), genetisti e biologi molecolari lavoreranno fianco a fianco, sfruttando la disponibilità di geni per la regolazione molecolare della fioritura e dell architettura del fiore, al fine di migliorare la qualità, la bellezza e la produttività delle colture ornamentali. Concludo con il pensiero del grande genetista Elliot Meyerowitz: la capacità di trasformare i fiori secondo i nostri desideri non può essere considerata irrilevante, in un mondo, in cui la maggior parte del cibo per l umanità consiste in componenti dei fiori, o in loro prodotti, come semi e frutti. Ringraziamenti Un sentito ringraziamento al Dott. Enrico Farina per il gradito incoraggiamento ed i suoi preziosi consigli nella lettura critica del manoscritto. Riassunto Negli ultimi anni le tecniche di miglioramento genetico classico e quelle più avanzate di biologia molecolare sono state utilizzate insieme, contribuendo a fare luce sui meccanismi di crescita e differenziamento delle piante. La possibilità di ottenere specie ornamentali transgeniche ha aumentato le risorse disponibili per il miglioramento delle produzioni floricole. Le conoscenze sui meccanismi molecolari che sono alla base dell induzione fiorale, della determinazione dei meristemi fiorali e dello sviluppo degli organi del fiore, acquisite nelle specie modello Antirrhinum majus, Arabidopsis thaliana e Petunia hybrida, hanno portato all identificazione di numerose classi di geni, potenzialmente utili al miglioratore genetico molecolare. 56

8 Giovannini Parole chiave: Arabidopsis thaliana, agricoltura molecolare, meristema fiorale, sviluppo organogenetico, tempo della fioritura Bibliografia ARAKI T., Transition from vegetative to reproductive phase. Curr. Opin. Plant Biol. 4: AUKERMAN M, SAKAI H., Regulation of flowering time and floral organ identity by a microrna and its APETALA2-like target genes. The Plant Cell 15: BENEDITO V.A., VISSER P.B., VAN TUYL J.M., ANGENENT G.C., DE VRIES S.C., KRENS F.A., Ectopic expression of LLAG1, an AGAMOUS homologue from lily (Lilium longiflorum Thunb.) causes floral homeotic modifications in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany 55 (401): BLÁSZQUEZ M.A., GREEN R., NILSSON O., SUSSMAN M.R., WEIGEL D., Gibberellins promote flowering in Arabidopsis by activating the LEAFY promoter. Plant Cell 10: BLÁSZQUEZ M.A., FERRÁNDIZ C., MADUEÑO F., PARCY F., How floral meristems are built. 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