Ingegneria genetica nelle piante
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- Emma Pini
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1 PAS Percorsi Abilitanti Speciali Classe di abilitazione A057 Scienza degli alimenti Tracciabilità genetica degli alimenti Ingegneria genetica nelle piante 1
2 Struttura del DNA
3 Flusso dell informazione genetica
4 Promotore eucariotico elemento (scatola: box) sequenza posizione TATA TATAAA -30 CAAT GGCCAATCT -80 GC GGGCGG da -100 Paolo Edomi - Genetica 4
5 Il codice genetico 4 nucleotidi 43 = 64 1 tripletta 1 aminoacido 20 aminoacidi Paolo Edomi - Genetica 5
6 Definizione funzionale di gene un gene è una sequenza di DNA che codifica per un polipeptide (o un RNA) 1 gene : Edomi 1 polipeptide Paolo - Genetica 6
7 Struttura dei geni e mrna eucariotici GENE 5 ESONE 1 INTRONE 1 ESONE 2 INTRONE 2 ESONE 3 3 TRASCRITTO mrna struttura del gene funzione del gene 5 UTR ORF 3 UTR Paolo Edomi - Genetica 7
8 Vettori plasmidici
9 Enzimi di restrizione
10 Ligazione
11 Clonaggio
12 Trasformazione batterica
13 Ricombinazione omologa o generalizzata: crossing-over non omologa o integrativa: trasposizione
14 Clonaggio per ricombinazione
15 Clonaggio nelle piante finalità proprietà resistenza consumo piante transgeniche (transgene) capacità di rigenerazione (vs cell animali) trasformazione in planta (embrioni, semi, polline)
16 Tipologie di clonaggio 3 tipi vettori basati su plasmidi di Agrobacterium trasferimento diretto vettori virali
17 Agrobacterium tumefaciens plasmide tumorigenico Ti batterio del suolo crown gall dicotiledoni
18 Ciclo di Agrobacerium
19 Plasmide Ti e T-DNA plasmide Ti 200 kb geni infettivi geni tumorali (T-DNA) T-DNA (23 kb): integrazione per ricombinazione non-omologa geni per tumore (citochina, auxina) opine: derivati degli aa, vantaggio selettivo per Agrobatteri sequenze confine: integrazione stabile geni virulenza vir ori
20 Plasmide Ti come vettore plasmide Ti come vettore rimozione geni tumorali dal T-DNA inserto tra regioni confine problema: grandezza (siti, manipolazione) 2 strategie vettori co-integrazione vettori binari
21 Vettori di co-integrazione ricombinazione tra plasmide (di clonaggio) e plasmide Ti in Agrobacterium
22 Vettori binari T-DNA modificato per clonaggio + plasmide Ti senza T-DNA
23 Selezione di plasmidi Ti resistenza ad antibiotici (kanamicina) resistenza ad erbicidi (csr-1 di Arabidopsis, acetolattato sintetasi) incubazione di tessuto fogliare con Agrobacterium ricombinante (lesioni nel prelievo) selezione in terreno con citochine (crescita), ampicillina (eliminazione dei batteri), kanamicina (piante trasformate)
24 Trasformazione con Agrobacterium
25 Problemi nell'uso di Agrobacterium monocotiledoni resistenti (lignificazione delle lesioni) utilizzo di sostanze chimiche o embrioni (divisione cellulare agevola integrazione) espressione promotori forti (35S CaMV) promotori tessuto specifici (semi) effetto di posizione numero di copie (silenziamento del transgene)
26 Trasformazione diretta
27 Trasformazione biolistica particelle di metallo (oro, tungsteno) rivestite di DNA e sparate (gene-gun) nelle cellule (gas ad alta P, scariche elettriche) destino complesso del DNA: inserzione casuale in copie multiple
28 Trasformazione di protoplasti senza parete (trattamento con pectinasi e enzimi che degradano la cellulosa) ricrescita 10gg trasformati per trattamento chimico, elettroporazione o con liposomi integrazione e selezione con marcatori
29 Vettori virali Virus del mosaico del cavolfiore: DNA circolare, ds, 8kb, 8 geni limite all'impaccamento (8,3 kb): inserto da 1 kb intermedio a RNA (errori di replicazione) poche specie Geminivirus: DNA ss, replica ds ma: riarrangiamenti, delezioni Virus del mosaico del tabacco genoma a RNA
30 Ingegnerizzazione di cloroplasti genoma plastidico: circolare, ds, geni in operoni, policistroni poliploidi, migliaia di cloroplasti: alti livelli di espressione non nel polline inserzione per ricombinazione omologa: regioni di omologia di almeno 400 bp promotori e terminatori cloroplasto-specifici
31 Selezione di cloroplasti trasformati aada: resistenza alla spectinomicina (inibitore della sintesi proteica in batteri e cloroplasti) kanamicina: questione del trasferimento orizzontale BADH (betaina aldeide deidrogenasi): trasforma la aldeide betaina (tossica) in glicin-betaina (innocua) rimozione di marcatori con Cre-lox
32 Trasformazione di cloroplasti metodi biolistici (per la doppia membrana) induzione dell'omoplasmia
33 Manipolazione di cloroplasti ampio utilizzo resistenza a erbicidi, insetti, siccità produzione di farmaci produzione in piante commestibili forma attiva della proteina espressione di più geni (operoni) incrocio di piante transgeniche diverse 3 geni di Bt
34 Piante transgeniche
35 Ingegneria genetica nelle piante aggiunta di un gene sottrazione di un gene
36 Resistenza a insetti: Bt OGM per gene cry di Bacillus thuringiensis cristalli citoplasmatici solubili solo nell'intestino (ph 9,5) di larve di lepidotteri
37 La proteina Cry di Bt pro-tossina deltaendotossina, 60 kda: squilibrio ionico, lisi cellulare, ph minore e sporulazione uso in campo
38 Il caso del mais CryIA(b) trasformazione di embrioni mediante biolistica
39 Il caso del tabacco CryIIA(a2) effetto anche su ditteri trasformazione di cloroplasti 45% delle proteine totali
40 Resistenza a erbicidi glifosolato: inibitore della sintesi di aa aromatici blocca la EPSPSasi 1) sovraespressione della EPSPSasi 2) EPSPSasi mutata piante Roundup ready ma: eccesso di erbicidi
41 Alternativa alle piante roundup ready B. licheniformis
42 La tecnologia antisenso
43 Maturazione ritardata pomodori: molti geni implicati poligalacturonasi (della parte cellulare del pericarpo): rende soffice la parete ritardare azione dell'enzima: maturazione più lenta utilizzo di sequenze antisenso al 5' sotto controllo del promotore 35S del CamV in Agrobacterium: riduzione del 6%
44 Pomodori OGM FlavrSavr
45 Resistenza a virus principio della resistenza alla sovrainfezione espressione di proteine del virus impedisce l'infezione ma: altri virus possono ancora infettare
46 Resistenza a funghi espressione di proteine anti-fungine es: piante di tabacco esprimenti la chitinasi del fagiolo sotto promoteore 35S del CaMV crescono in presenza del fungo Rhizoctonia solani, in quanto la chitinasi idrolizza la chitina della parete cellulare del fungo
47 La tecnologia terminator inibizione della sintesi proteica per inattivazione dei ribosomi piante normali, semi sterili
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