PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

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1 PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA

2 PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA Generalità I virus sono parassiti endocellulari obbligati, la particella virale completa (virione) presenta il genoma costituito da un solo tipo di acido nucleico (DNA O RNA), un limitato numero di enzimi (tra cui DNA polimerasi o RNA polimerasi) il tutto racchiuso in un involucro di rivestimento (capside) costituito da numerose subunità (capsomeri) la cui disposizione assume forme geometriche ben definite. Alcuni virioni presentano un ulteriore involucro di natura lipoproteica (envelope): in alcuni virus (virus influenzale) sulla superficie dell envelope sono presenti spicole glicoproteiche con proprietà emoagglutinante e neuroaminidasica..

3 PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA La diagnosi di infezione virale si può attuare mediante: Ricerca del virus Ricerca di anticorpi o dei suoi antigeni Tecniche di amplificazione e/o ibridazione dell acido nucleico virale Con l osservazione microscopico mediante microscopio ottico si possono valutare aspetti patognomici delle cellule: cellule giganti presenza di corpi inclusi Con la microscopia elettronica è possibile discriminare i caratteri morfologici del virus colorando i campioni negativamente con acido fosfotungstenico La metodica più significativa a livello diagnostico è l isolamento virale in quanto consente di valutare non solo l esistenza dell agente infettante ma anche di coltivarlo e dimostrare il suo potere patogeno.

4 PRINCIPI DI DIAGNOSTICA VIROLOGICA Il prelievo differenziato a seconda dei campioni clinici deve essere raccolto asetticamente possibilmente nei primi giorni di malattia; Inviato in contenitore refrigerato in laboratorio Seminato immediatamente in coltura applicando metodi biologici di infezione di colture cellulari o in linee cellulari stabili, uova embrionate e/o inoculazione in animali di laboratorio; Osservazione dell effetto citopatico o della formazione di placche di lisi indotte dal virus, comparsa di lesioni tipiche negli animali o lesioni macroscopiche su membrane di uova di pollo.

5 Diagnosi eziologica delle malattie infettive (approcci) Dimostrazione nel materiale patologico dell agente infettivo o di suoi componenti Diagnosi diretta Dimostrazione nell organismo infettato di una risposta anticorpale specifica recente Diagnosi indiretta Tempi di Diagnosi Metodi convenzionali (giorni settimane) Metodi rapidi (ore giorni) Esame microscopico Ricerca antigeni Metodiche molecolari

6 Coltivazione dei virus I virus sono parassiti endocellulari obbligati pertanto devono: Entrare in contatto (aderire) Penetrare in una cellula ospite dentro la quale si possa svolgere il loro ciclo replicativo Cellula sensibile e permissiva

7 Coltivazione dei virus

8 Coltivazione del virus nell uovo embrionato

9 Supporti per colture cellulari fiasche di vetro o plastica provette piastre con pozzetti di diverso diametro Shell vials (tubi di Leighton) Supporti per microcolture

10 Richiesta di crescita da parte delle cellule in coltura

11 Terreni per colture cellulari Principali componenti Terreni di crescita Con siero bovino fetale al 10 % Terreni di mantenimento Con siero bovino fetale al 3 % Terreni serum-free Soluzione bilanciata di sali inorganici Sistema tampone (bicarbonato/co 2 Carboidrati Aminoacidi Vitamine Ormoni e fattori di crescita Proteine e peptidi Acidi grassi e lipidi Antibiotici???

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19 Mantenimento di una coltura cellulare: Cambiamento del mezzo è necessario sostituire il mezzo periodicamente perché la cellula oltre sfruttarne le componenti nutrizionali riversa nel mezzo i suoi cataboliti ph tra 7 e 7.4 Concentrazione cellulare arresto della crescita o deterioramento Il passaggio Salvaguardia delle colture cellulari: Instabilità Contaminazioni

20 La misura delle Unita Formanti Placche (PFU) viene utilizzata per calcolare la concentrazione di unità virali infettanti.

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24 TIPI DI COLTURE CELLULARI Colture primarie Colture secondarie (semicontinue, stipiti cellulari) Linee cellulari continue cellule in monostrato Cellule in sospensione (es.emopoietiche)

25 Allestimento delle colture

26 Colture primarie Derivano direttamente da un tessuto espiantato Rappresentative del tessuto d origine Cariotipo diploidee Possono contenere tipi di cellule differenti Adatte per coltivazione di un elevato numero di virus Laboriose da preparare Molto viariabili cellule di rene di scimmia cellule di rene di coniglio

27 Colture semicontinue (stipiti cellulari) Cellule di seconda generazione Possono essere sub-coltivate per un limitato numero di passaggi dopo la coltura primaria (circa passaggi) Costituite da un solo tipo di cellule Mantengono il fenotipo normale (cariotipo diploide) Fibroblasti umani MRC-5 Polmone di embrione umano WI-38.3

28 Linee cellulari continue Derivano dai tessuti neoplastici o da cellule trasformate e immortalizzate per mutazione spontanea o indotta da carcinogeni chimici Radiazione ionizzante Infezione in vitro con agenti immortalizzanti Cariotipo aneuploide Possono essere subcoltivati senza limiti temporali Moltiplicazione di cellule normali in coltura e possibile origine di linee cellulari continue

29 Linee continue 1952 Hela (Henrietta Lacks cell line) carcinoma della cervice uterina KB carcinoma epidermoide della bocca umano Hep-2 carcinoma epidermoide della laringe umano VERO MDCK BHK cellule di rene di scimmia cellule di rene normale di cane baby hamster kidney

30 Colture cellulari I passaggi (subcolture) Staccare le cellule -Lavare con tripsina-edta -Incubare 3-30 minuti Quando il tappeto cellulare diventa opaco risospendere le cellule nel terreno di coltura Suddividere la sospensione cellulare in nuovi recipienti contenenti terreno di crescita preriscaldato (diluizione 1:3 1:5) Incubare Registrare il numero del passaggio!!!

31 Il congelamento Colture cellulari Staccare le cellule (tripsina-edta) Contarle Risospendere in terreno da congelamento* a concentrazione 1X10 6 per ml Distribuire nella criovials Incubare per 2 ore a -20 C Conservare a -80 C o in azoto liquido *siero al 20-40% e DMSO o glicerolo all 1 % Lo scongelamento Preparare il terreno di crescita preriscaldato a 37 C Scongelare rapidamente la sospensione cellulare a 37 C Centrifugare la sospensione cellulare a bassa velocità Asportare il sopranatante e risospendere le cellule nel terreno di crescita Trasferire la sospensione nell apposita fiasca Incubare

32 Fornitori di colture cellulari

33 ISOLAMENTO DEL VIRUS IN COLTURE CELLULARI Allestimento delle colture in vitro Inoculazione del campione Incubazione Identificazione e tipizzazione del virus

34 L infezione Asportare il terreno di coltura Lavare le cellule con terreno di coltura senza siero Inoculare il campione (pre-trattato) Incubare a temperatura indicata Asportare l inoculo Aggiungere il terreno di mantenimento Incubare

35 Colture cellulari Un virus che si replica può produrre: Effetto citopatico (CPE). Rigonfiamento delle cellule, formazione di sincizi- può essere specifico o non specifico Emoadsorbimento Le cellule acquisiscono la capacità di attaccarsi ai globuli rossi dei mammiferi. La conferma dell identità dei virus può essere eseguita mediante neutralizzazione, inibizione dell emoadsorbimento e prove d immunofluorescenza

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41 Effetto citopatico Formazione di sincizi in colture cellulari

42 SINCIZI causati dal virus del morbillo e EMOADSORBIMENTO di eritrociti sulla superficie del monostrato Corpi inclusi da citomegalo virus (CMV)

43 Problemi con le colture cellulari E necessario un lungo periodo di tempo per i risultati (fino a 4 settimane) Spesso una scarsa sensibilità, la sensibilità dipende in gran parte dalle condizioni del campione Sensibili alla contaminazione batterica Sensibili alle sostanze tossiche, che possono essere presenti nel campione Molti virus non si replicano nelle colture cellulari (ad. Virus dell Epatite B; parvovirus e papillomavirus Es.

44 Reazione di fissazione del complemento Emoagglutinazione neutralizzazione Tecniche diagnostiche classiche Tecniche ancora utilizzate ma largamente soppiantate da metodiche più rapide e più sensibili: ELISA RIA Test di agglutinazione al lattice Immunofluorescenza Ricerca dell acido nucleico

45 Fissazione del complemento Reazione + assenza di emolisi delle emazie presenza di anticorpo specifico Reazione Emolisi delle emazie Assenza di anticorpo specifico

46 Emoagglutinazione I virus provvisti di emoagglutinine determinano l agglutinazione delle emazie La presenza in un campione sierico di anticorpi antiemoagglutinanti inibisce l emoagglutinazione virale

47 Test di emoagglutinazione La determinazione del titolo anticorpale può essere determinata in provetta o in micropozzetti; Si allestiscono diluizioni seriali del campione di siero, si aggiungono alle diluizioni emazie e virus e si lascia riposare. L inibizione dell emoagglutinazione indicherà la presenza di anticorpi sierici che neutralizzano le emoagglutinine virali. Il titolo anticorpale è dato dal reciproco della maggiore diluizione di siero in cui si evidenzia ancora emoagglutinazione

48 Tecniche rapide Applicate per la ricerca di virus o dei suoi antigeni e per la ricerca di anticorpi (Esame Indiretto) Queste metodiche si basano su reazioni antigeneanticorpo e di un sistema di rivelazione. Queste tecniche si avvalgono dell uso di anticorpi monoclonali

49 Test Immunoenzimatico ELISA per la determinazione dell antigene Viene applicato per la ricerca di antigeni virali o dei corrispondenti anticorpi Rivela la presenza di antigeni virali Kit commerciali: virus epatite, rotavirus, HIV-1,.

50 Test Immunoenzimatico ELISA per la determinazione dell anticorpo dosaggio indiretto Rivela la presenza di anticorpi

51 IMMUNOFLUORESCENZA La tecnica si basa sulla marcatura con isotiocianato di fluoresceina degli anticorpi rivelatori e successiva osservazione con microscopio a fluorescenza. Metodo Diretto: ricerca eventuali microrganismi in un campione o anche antigeni intracellulari (Chlamidia, Rickettsiae) Metodo Indiretto: viene applicato per la ricerca di anticorpi eventualmente presenti nel siero contro antigeni noti. Il siero viene messo a contatto con l antigene noto, in seguito l anticorpo marcato (sistema rilevatore) diretto contro la regione costante della catena pesante degli anticorpi eventualmente presenti nel siero saggiato.

52 IMMUNOFLUORESCENZA Immunofluorescenza diretta Immunofluorescenza indiretta

53 Test di Agglutinazione al Lattice

54 Tecniche per la ricerca dell acido nucleico virale Sono metodiche applicate per la ricerca del DNA o RNA virale nel campione da esaminare, sono altamente sensibili in quanto permettono di rilevare un numero estremamente basso di virioni. Sono rapide