I argomento: Microbiologia di base

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1 I argomento: Microbiologia di base 1) Lavorare in sterilità 2)Preparazione di piastre Petri selettive per coltura di microorganismi 3)Conta cellulare e diluizioni seriali 4)Vari metodi di semina su piastra e conteggio di colonie 5)Tecnica di Replica Plating 6) Prelievo di campioni 7) Semina dei campioni prelevati in terreno selettivo 1. Lavorare in sterilità - Prima di qualsiasi esperimento è opportuno disinfettare il bancone con alcol 70% o alcool denaturato; - La plasticheria di laboratorio (Piastre Petri, Falcon, Pipette, puntali, eppendorf, etc.) e confezionata sterilmente; - La vetreria viene lavata in lavastoviglie con opportuni detersivi, disinfettanti; - Tutta la plastica termoresistente, la vetreria, le soluzioni e i terreni di coltura vengono sterilizzati in autoclave, sterilizzatore a vapore ad alta temperatura (121 C) e pressione di 1 atm, per 20 min.; - Le sostanze termolabili vengono sterilizzate mediante filtrazione con filtri da 0.22µ e aggiunte alle soluzioni preventivamente sterilizzate in autoclave; - Le provette e le bottiglie si passano alla fiamma del bunsen, prima e dopo il loro uso; - Le anse e gli spreaders che si usano per le semine su piastra, si passano al bunsen prima e dopo l uso per evitare contaminazioni di colonie microbiche; - Alla fine di ogni esperimento va pulito e disinfettato il bancone. 2. Preparazione di piastre Petri per batteri Gli studenti avranno a disposizione 6 piastre Petri e una bottiglia di Terreno PCA e Terreno Rosa Bengala (RB), mantenuti liquidi (50 C). Preparare 3 piastre di PCA e 3 piastre di RB (caldi, ancora liquidi!), versando all incirca 20 ml di terreno per piastra.prima di procedere agitare per omogeneizzare la soluzione. N.B. Le piastre vanno siglate con il nome del gruppo di lavoro, nome del terreno (3 di PCA, 3 di RB) e data di preparazione. Le piastre solidificate verranno conservate sterilmente (coprire con parafilm) a 4 C e utilizzate il secondo giorno di laboratorio per la semina dei microorganismi raccolti.

2 Distribuzione del terreno nelle piastre Dopo ogni versamento il collo della bottiglia viene flambato alla fiamma per sterilizzarlo. Si possono fare più piastre contemporaneamente impilandole e partendo dal basso. (Fotografia di Forestan, Ammirabile, Campagnolo e Marcello, esercitazioni 2001/02, nel seguito qs fonte è citata col simbolo ) 3. Conta cellulare La crescita di una popolazione di lievito in terreno liquido viene valutata seguendo nel tempo la variazione del numero di cellule. Le operazioni fatte sono valide, in linea di principio, anche per una popolazione batterica. In questo caso, verrà analizzata una sospensione cellulare di W303 diploide, cioè un lievito gemmante S. cerevisiae, cresciuto in terreno ricco di nutrienti YPDAT per ore a 30 C, che è la temperatura standard di crescita dei lieviti non temperatura sensibili. Il numero di cellule di una popolazione può essere misurato contando le cellule al microscopio, un metodo chiamato conta diretta mediante speciali camere di conta. Questo tipo di conteggio indica la DENSITA di cellule in una sospensione cellulare e quindi, in un dato volume di sospensione, il numero di cellule TOTALI. Nelle camere di conta (sono molto usate quelle di Thomas-Zeiss o di Burker), sulla superficie del vetrino, è inciso un reticolo quadrettato di cui è nota l'area di ogni riquadro (Fig. 1). Al microscopio, si conta il numero di cellule presenti in ogni riquadro del reticolo (n) e questo valore viene convertito in numero di cellule per ml di sospensione semplicemente moltiplicandolo per un fattore di conversione basato sul volume della camera (n x 10 4 ) (Fig. 2). In laboratorio, verrà utilizzata la camera di Burker: essa è munita di due reticoli di conta indipendenti (alto/basso o nord/sud); sul margine esterno del vetrino, appoggiandosi con il puntale, si pipettano 10µl della sospensione cellulare-preventivamente diluita, vedi sotto*-, permettendo al liquido di riempire per capillarita la camera di conteggio. Per il conteggio, BASTA RIEMPIRE UNA SOLA SEMI CAMERA. ATTENZIONE I LIEVITI SEDIMENTANO RAPIDAMENTE: è necessario SONICARE per disgregare i clusters cellulari E VORTEXARE PRIMA DI OGNI DILUIZIONE/PIASTRATURA La sonicazione viene effettuata in ambiente sterile-cioè pulendo il puntale con alcool rosa e poi con acqua milliq, quindi asciugando con carta assorbente pulita-, mettendo a contatto la punta del sonicatore col menisco della sospensione cellulare. La sospensione viene sonicata 2 volte per 5 sec, a media intensità della scala del sonicatore. *Per ottenere un numero di cellule appropriato per il conteggio (non troppo concentrato), il campione deve quasi sempre venire diluito. Poiché raramente si conosce in anticipo, anche approssimativamente, il numero delle cellule in sospensione, è solitamente necessario effettuare più di una diluizione.

3 N.B. Per la conta: Fig. 1 CONSIDERARE MADRE + GEMMA = 1 CELLULA FORMULA DEL CONTEGGIO IN CAMERA DI BURKER: (N cellule in n1) x 10 4 x FD = cellule/ml nella sospensione originaria n1 è tutto il quadrato grande della Burker, costituito da 16 quadrati piccoli, e due bordi interni a scelta, escludendo le cellule che cadono sulle righe della zigrinatura FD è il fattore di diluizione: se la coltura è a saturazione-molto concentrata: il terreno è torbido-, diluendo circa 1:50 (FD = 50) o 1:100 (FD = 100) si conta agevolmente su tutta la superficie di n1 ; quindi basta moltiplicare il numero ottenuto dal conteggio per 10 4 e per la diluizione adottata, per avere le cellule/ml nella beuta originale. Bisogna contare almeno 100 cellule totali è un fattore di conversione volumetrica della camera Bisogna VORTEXARE SEMPRE prima di effettuare UN PRELIEVO O UNA DILUIZIONE

4 n1 1 Schema dettagliato della camera di Burker 0,04 mm 2 1 X25 X mm 0.2 mm Il reticolo grande della figura (1 mm 2 ) corrisponde a quello denominato più sopra, nelle dispense, come n1. Per la conta., considerare madre+gemma pari a 1 0,1 1mm Fig. 2 Se la coltura non è a saturazione-il terreno è trasparente-, si possono diluire meno le cellule: se rimangono ben separate, è sufficiente contare una parte di n1, cioè uno o più quadrati piccoli, fino ad un totale di almeno 100 cellule. Nel caso vengano contati più quadratini, dividere per il numero di quadratini contati). Un quadrato piccolo senza bordi (marcato in rosso) è 1/25 della superficie di n1,mentre se consideriamo il quadrato + 2 bordi (marcato in nero) è 1/16 di n1. La formula quindi diventa: 1mm (N cellule in quadratino/i rosso/i) x 10 4 x FD x 25 = cellule/ml nella sospensione originaria N quadratini rossi contati oppure (N cellule in quadrato/i nero/i) x 10 4 x FD x 16 = cellule/ml nella sospensione originaria N quadratini neri contati

5 Diluizioni seriali La sospensione cellulare di W303, cresciuta in terreno YPDAT, verrà diluita in serie nello stesso terreno di crescita (Fig. 3), per poi seminare su piastra YPDAT/agar un numero di cellule dell ordine delle centinaia e migliaia: questo allo scopo di ottenere sulle piastre colonie isolate. Il numero di cellule presenti nella sospensione cellulare verra determinato mediante conta diretta del campione diluito, con camera di Burker (come descritto sopra); per rendere agevole la conta alla camera di Burker, i lieviti devono essere sonicati e vortexati prima di diluirli alla concentrazione per una conta dell ordine delle centinaia. Dopo 2 giorni a 30 C, saranno visibili le colonie su piastra: queste verranno contate allo scopo di determinare la la reale vitalità del ceppo. Infatti, questo secondo conteggio è una conta indiretta, perché mentre dal conteggio in camera di Burker non è possibile valutare se e quanto un ceppo sia o meno vitale, confrontando il numero di cellule teoricamente seminate e il numero di colonie contate dopo la crescita, si può ricavare la % di vitalità del ceppo. Cellule vitali:colonie contate/conta diretta Le diluizioni seriali servono: a rendere più agevole il conteggio di una sospensione concentrata, riuscendo poi a risalire, moltiplicando per il fattore di diluizione, alla concentrazione della sospensione originaria a rendere possibile la successiva semina su piastra (su una piastra non possono essere seminate troppe cellule, o le colonie diventano competitive per i nutrienti e non sono distinguibili fra loro) a subclonare, cioè, partendo da una singola colonia (costituita da molte cellule), ad isolare le singole cellule fra loro ESPERIMENTO: diluizioni seriali Preparare 6 provette siglate con il nome 10 7 (dalla coltura madre di partenza), 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2 Nelle provette siglate con 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, preparare 900µl di YPDAT per le varie diluizioni. N.B. La coltura madre di partenza conterrà una densità cellulare N x 10 7 cellule/ml, dove N potrà essere un numero variabile, dipendente dal conteggio preventivamente effettuato (1, 2, 3, 4 ecc..). N x 10 7 cellule/ml (dalla coltura madre di partenza) DILUIZIONI SUCCESSIVE: 100µl cellule (dalla coltura madre di partenza) + 900µl di YPDAT N x 10 6 cellule/ml 100µl cellule dalla provetta µl di YPDAT N x 10 5 cellule/ml 100µl dalla provetta µl di YPDAT N x 10 4 cellule/ml 100µl dalla provetta µl di YPDAT sonicare e piastrare con 2 metodi di semina-vedi sotto-200µl N x 10 3 cellule/ml 100µl dalla provetta µl di YPDAT sonicare e piastrare con 2 metodi di semina-vedi sotto-200µl N x 10 2 cellule/ml

6 100 ul 100 ul 100 ul 100 ul 900 ul 900 ul 900 ul 900 ul 900 ul 200 ul 200 ul 4.Vari metodi di semina su piastra e conteggio di colonie 4a. Semina da coltura liquida Le operazioni di piastratura devono essere eseguite preferenzialmente vicino al bunsen che consente di creare una zona sterile

7 1) Ansa (o diffusore) di vetro (nel nostro caso una Pipetta Pasteur ripiegata ad L alla fiamma) Le pasteur DEVONO ESSERE CHIUSE ALLA ESTREMITA PRIMA di essere ripiegate; quindi vengono ripiegate ad L utilizzando il calore della fiamma, e sterilizzate immergendole in alcool e ripassate al bunsen (flambare). Mantenere le anse in verticale non appoggiandole al bancone, o la sterilità viene compromessa. Aspettare bene che l ansa sia fredda. Pipettare 200µl (vedi sopra) della diluizione 10 3 e 10 2 del campione di coltura di lievito al centro della piastra di YPDAT/agar e distribuirli uniformemente sulla superficie dell agar in tutte le direzioni con un movimento a lancetta di orologio. 2) palline di vetro. Mettere 4-6 palline (non troppe, altrimenti si intridono di cellule) sul coperchio di ogni piastra avendo cura di aprire poco le piastre, chiudere le piastre, quindi rovesciarle prima di versare il campione sul terreno, in modo che le palline poggino sull agar. Pipettare 200µl (vedi sopra) della diluizione 10 3 e 10 2 del campione di coltura di lievito al centro della piastra di YPDAT/agar e distribuirli uniformemente sulla superficie dell agar, muovendo avanti e indietro (a zig-zag) e stando attenti a NON far muovere sul bordo in modo circolare le palline e a raggiungere tutte le parti del terreno. Rovesciare di nuovo le piastre, scaricare le palline in alcool aprendo la piastra meno possibile per non inquinare, ed incubare le cellule a 30 C per 2 giorni con il tappo rivolto verso il basso. In Figura è visibile il risultato di una corretta piastratura. 4b. Semina da colonia singola Da una piastra contenente colonie singole del ceppo di lievito W303, si prelevera parte di una colonia singola-toccare appena la colonia-e si trasferira il materiale su una piastra YPDAT sterile e strisciando mediante movimenti ampi a zig-zag senza incidere il terreno e senza tornare sui punti già strisciati (Fig. 4), mediante 2 tecniche: 1.stecchini sterili; 2.loops Entrambe le tecniche servono per ottenere cloni puri da una colonia madre. Quindi, per ottenere delle colonie singole alla fine dello striscio, è opportuno togliere l eccesso di colonia prelevata dalla punta dello stecchino o del loop strisciando la maggior parte della colonia prelevata in una zona deli mitata della piastra, quindi strisciare il rimanente. Rovesciare le piastre ed incubarle a 30 C per 2 giorni. Dopo 2 giorni si apprezzerà la buona riuscita dello striscio.

8 Fig. 4 L orientamento dello striscio si dovrebbe riconoscere dal fatto che i primi strisci a zig-zag saranno molto densi, per poi diminuire via via. 5.Tecnica di Replica plating La replica plating (piastratura per replicazione) è una tecnica che permette di trasferire colonie microbiche da una piastra madre ad un altra mantenendo la disposizione spaziale originale delle colonie: permette di fare, cioè, delle copie fedeli della piastra madre (Fig. 5). La direzione del prelievo viene segnata sia sulla piastra madre sia su quella dove viene fatta la replica, in modo da poter riconoscere, in seguito, il corretto orientamento delle colonie. Questa metodica permette di risolvere bene (vedere in modo definito e distinto) fino a 1000 colonie. Per uan buona risoluzione delle colonie replicate, è necessario che sia la fase del prelievo che quella della copia vengano effettuate con estrema precisione (mano ferma), EVITANDO DI RUOTARE IL VELLUTO O LA PIASTRA NELLE VARIE FASI. La piastra madre, contenente colonie singole del ceppo di lievito W303, viene premuta leggermente su un pezzo di velluto sterile, che raccoglie alcune cellule di lievito da ciascuna colonia. Nuove piastre YPDAT vengono poi premute delicatamente sulla superficie del velluto imbibito delle colonie (possono essere effettuate fino a 10 repliche con lo stesso prelievo); le cellule vengono trasferite in modo da mantenere la stessa posizione che avevano sulla piastra di partenza, rispettando il segno di orientazione della piastra.

9 Tampone di velluto dopo copia dalla piastra madre dove si notano le cellule che si sono staccate dalle colonie (da ) 6. Prelievo di campioni Il campionamento verra effettuato su alcune statue del giardino della Cappella degli Scrovegni in zone che presentano diversi tipi di alterazione, per condurre un analisi comparativa tra diverse aree. Per lo svolgimento delle analisi microbiologiche verranno prelevate modeste quantita di materiale, da 100 mg a pochi grammi, corrispondenti alla minima aliquota accettabile fissata dalla Commissione Normal (C.N.R., I.C.R. Normal-3/80, 1980). Per il prelievo verranno utilizzati: Bisturi: per asportare, mediante raschiamento, polveri e materiali superficiali fino ad 1 mm di profondità. Il materiale verrà imbustato in carta oleata e mantenuto chiuso in piastre Petri opportunamente siglate con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro Velluto asciutto ed imbevuto di Tampone Fosfato (PBS), su cui raccogliere del materiale, appoggiandolo alla superficie del velluto Il campionamento verra effettuato in condizioni di sterilità, nei limiti delle possibilità essendo in un ambiente aperto 7.Semina dei campioni prelevati in terreno selettivo a) Utilizzando i velluti e lo strumento già utilizzato il primo giorno di laboratorio per la replica plating, depositare il materiale raccolto sul velluto, timbrando in una piastra RB ed in una piastra PCA opportunamente siglate con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro b) Pesare i campioni contenuti nella carta oleata. i)conservare a 4 C circa 0.2g di campione, mettendolo in una provetta opportunamente siglata con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro per il III giorno di laboratorio. Su questa aliquota di campione verrà effettuata l estrazione del DNA genomico DA CAMPIONE SECCO ed analizzata, mediante PCR, la presenza di Eubatteri nei campioni prelevati ii)polverizzare il campione rimanente in mortaio sterile Aggiungere 2ml di PBS sterile (se il prelievo del campione fosse stato poco abbondante, risospendere in un volume inferiore di PBS sterile) Risospendere vortexando per qualche minuto Dividere la sospensione in 2 aliquote da 1ml (2 provette siglate con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro Centrifugare a 5000rpm per 15min

10 Eliminare il surnatante (fase liquida sopra il campione, che si depositerà sul fondo della provetta) per versamento (versare il liquido direttamente in un becker) ed aiutandosi con la pipetta per eliminare tutti i residui di surnatante. Risospendere vortexando i campioni in 500 µl di terreno PCB o RB liquido, siglando sulla provetta in quale terreno il campione è stato risospeso (RB o PCB) Seminare 100 µl della sospensione del campione in terreno RB (non buttare quello che avanza della sospensione) nelle piastre RB (per miceti) siglate con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro Seminare 100 µl della sospensione del campione in terreno PCB (non buttare quello che avanza della sospensione) nelle piastre PCA (per batteri eterotrofi aerobi) siglate con l origine del campione (ad es. statua) e nome del gruppo di lavoro. Trasferire il rimanente volume di sospensione in terreno RB in un tubo con tappo rosso siglato con l origine del campione (ad es. statua), nome del gruppo di lavoro ed RB, ed aggiungervi altri 4 ml di terreno RB Trasferire il rimanente volume di sospensione in terreno PCB in un tubo con tappo rosso siglato con l origine del campione (ad es. statua), nome del gruppo di lavoro e PCB ed aggiungervi altri 4 ml di terreno PCB Preparare anche due controlli negativi, cioè 2 tubi con tappo rosso, siglati con il nome del gruppo di lavoro e RB o PCB, rispettivamente contenenti 4 ml terreno RB o PCB senza alcun inoculo. In questi tubi non deve crescere nessun microorganismo In questo modo si ottengono colture liquide dei microorganismi. La crescita si apprezza attraverso un intorbidamento del terreno; in caso contratrio, il terreno rimarrà limpido. Le colture solide e liquide crescono a 30 C per 1 giorno. Le colonie di microorganismi eventualmente formatesi sulle piastre (colture solide) verranno quindi analizzate mediante analisi diretta al microscopio e colorazioni specifiche Le colture liquide verranno utilizzate per l estrazione del DNA genomico DA CAMPIONE LIQUIDO e per analizzare la presenza di Eubatteri nei campioni prelevati mediante PCR (associandole quindi all estrazione del DNA genomico da CAMPIONE SECCO e relativa PCR).