Spettroscopia molecolare: interazioni luce-materia
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- Floriano Di Martino
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1 Spettroscopia molecolare: interazioni luce-materia Nella spettroscopia molecolare il campione è irradiato con luce avente λ nell UV, nel visibile o nell infrarosso. Le molecole di cui è costituito il campione assorbono l energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrare i loro gruppi funzionali (visibile, IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV, visibile). La risposta del campione viene registrata e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole. Il tipo di interazione fornisce la risposta analitica: qualitativa identificazione attraverso le λ assorbite. quantitativa calibrazione con soluzioni a concentrazione nota, legge di Lambert-Beer (A = εbc)
2 I livelli energetici delle molecole sono quantizzati, pertanto solo i fotoni aventi energia pari a quella di separazione tra due livelli ( E= E stato finale E stato iniziale ) vengono assorbite. A differenza degli atomi, nelle molecole vi sono livelli energetici vibrazionali e rotazionali che si aggiungono ai livelli elettronici. S 1 vibrational levels rotational levels IR microonde S 0 v 2 v 1 E = hν electronic levels UV-Vis-NIR
3 λ Nella spettroscopia atomica gli spettri di assorbimento ed emissione sono spettri a righe (sinistra), mentre nella spettroscopia molecolare gli spettri sono a bande (destra) aventi λ massime caratteristiche, in quanto le transizioni avvengono contemporaneamente a livelli diversi di energia (elettronica, vibrazionale o rotazionale) λ
4 Spettrofotometria UV-vis-NIR La tecnica si basa sull assorbimento di fotoni da parte delle molecole, le quali passano dallo stato energetico fondamentale ad uno stato eccitato. hν M Energy Excited states Ground state
5 Energia Energia delle radiazioni Nella tecnica UV-vis-NIR si impiegano radiazioni nell intervallo nm, la cui energia è sufficiente ad attivare transizioni elettroniche, che causano il passaggio di elettroni degli strati esterni a stati eccitati UV (Ultravioletto) nm (lontano UV) Visibile nm NIR (Near Infrared) nm (vicino IR)
6 Elettroni n e π Gli elettroni coinvolti nelle transizioni possono essere di tipo π (legami multipli) oppure n (non legame); gli elettroni di tipo σ (legami semplici) richiedono, per il salto dallo stato fondamentale agli stati eccitati, energie superiori all UV.
7 Transizioni elettroniche Le transizioni elettroniche più comuni sono illustrare nella figura sottostante. Esse si verificano se nel campione sono presenti molecole aventi cromofori,, cioè gruppi funzionali in grado di assorbire la luce, come il gruppo NO 2 (nitro), -N 2 - (azo). Solo le transizioni di elettroni n e π hanno energie nel range nm,, quindi rivelabili con l UVl UV-visibile
8 Gruppi cromofori Alcuni esempi di gruppi cromofori con i relativi coefficienti di estinzione molare o assorbività molare (ε) Cromoforo Esempio Transizione λ max, nm ε Solvente C=C Etene π π* ,000 esano C C 1-Esino π π* ,000 esano C=O Etanale n π* π π* ,000 esano N=O Nitrometano n π* π π* ,000 etanolo C-X X=Br X=I Metil bromuro o ioduro n σ* n σ* esano
9 Le transizioni elettroniche promosse dalla radiazione UV-vis-NIR coinvolgono anche i vari livelli vibrazionali. Per questo motivo lo spettro è del tipo a bande. Questa caratteristica complica notevolmente il riconoscimento e la quantificazione di composti in miscela Esempio di spettro UV-visibile di un aldeide insatura. La banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (~ 400 nm) Le bande di assorbimento in UV-vis-NIR sono in numero minore rispetto all IR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuare determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer.
10 Applicazioni generali dell UV-vis-NIR misure di concentrazione a λ singola (A = εbc) misure λ singola per seguire reazioni chimiche spettri di assorbimento in intervalli di λ per identificare gruppi cromofori e molecole rivelazione in sistemi cromatografici: eluente I o eluente + analita I pompa HPLC colonna di separazione rivelatore a doppio raggio cromatogramma
11 EXP n.2: Determinazione della concentrazione di una soluzione mediante misure spettrofotometriche L'applicazione diretta della legge di Lambert-Beer, valida per soluzioni diluite, (legge dell assorbimento, A = ε b c), dove ε = assorbività molare (o coefficiente di estinzione molare): dipende dall'analita e dalla lunghezza d'onda b = lunghezza del percorso del raggio nel campione c = concentrazione molare della specie assorbente consente il calcolo della concentrazione molare di una soluzione incognita, mediante determinazione dell'assorbanza della soluzione in esame ad una ben definita lunghezza d onda, laddove sia noto il valore del coefficiente di estinzione molare ε per il soluto a quella stessa lunghezza d onda.
12 Esempio di spettrofotometro UV-visibile Gli spettrofotometri UV-vis vis-nir sono estremamente diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo. La maggior parte degli strumenti hanno range strumentale limitato all UV UV-visibile ( nm), dove comunque quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti. Strumenti più sofisticati arrivano fino al NIR. Un utilizzo molto comune si ha come rivelatore per cromatografia.
13 Spettrofotometro a doppio raggio
14 Onde minimizzare gli errori associati sia al calcolo dell ε, sia alla determinazione dell assorbanza A, ci si riferisce generalmente alla lunghezza d onda cui il campione mostra un massimo di assorbimento. Il parametro b corrisponde allo spessore della cella: è un valore sempre noto e costante e, generalmente, pari a 1.00 cm. Purtroppo, ε dipende da vari fattori, anche strumentali, e non può essere tabulata in modo preciso. Di conseguenza, qualsiasi metodica spettrofotometrica che voglia raggiungere una certa precisione deve prevedere il calcolo del coefficiente di estinzione molare ε nelle condizioni sperimentali dell'analisi.
15 Determinazione dell ε mediante costruzione della retta di taratura Uno dei metodi più usati in spettrofotometria UV/Vis è quello della retta di taratura. Questo metodo consiste nella preparazione di diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e crescenti della specie da analizzare. Riportando su un grafico i valori di assorbanza misurati con lo spettrofotometro ad una determinata lunghezza d onda (generalmente il massimo o uno dei massimi di assorbimento) in funzione della concentrazione molare, si ottiene una retta passante per lo zero.
16 Abs ppm Parallelamente, si misura l'assorbanza del campione incognito; una volta ottenuta la retta di taratura, con l'ausilio del grafico, si determina per interpolazione la concentrazione incognita del campione.
17 Esecuzione Dalla soluzione madre del colorante blu di metilene prelevare con le pipette automatiche volumi di 1.0 ml, 3.0 ml, 5.0 ml; trasferirli in tre matracci tarati da 10 ml e portare a volume con acqua distillata (contraddistinguere i matracci numerandoli). Riempire un quarto matraccio da 10 ml con la soluzione a titolo incognito del colorante. Me N Me N S N Me Me Cl Struttura del colorante noto come Blu di Metilene
18 Effettuare la lettura dell assorbimento di tutti i campioni a 665 nm, dopo aver azzerato con acqua. Utilizzare per le misure una cella di materiale plastico (celle monouso in policarbonato). Riportare in grafico i valori di assorbanza dei campioni a concentrazione nota di blu di metilene, constatare che i punti segnati sono allineati su di una retta passante per l origine e ricavare la concentrazione della soluzione a titolo incognito in corrispondenza del valore di assorbanza letto sulla retta di taratura costruita. Ricavare il valore del coefficiente di estinzione molare ε tenendo presente che la lunghezza del cammino ottico è di 1.00 cm. Il peso molecolare del blu di metilene è 319 g/mol.
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