MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE E TERAPIE SPERIMENTALI. Rosario Gulino

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1 MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE E TERAPIE SPERIMENTALI Rosario Gulino

2 IL MIDOLLO SPINALE

3 CAUSE DI LESIONE SPINALE NELL UOMO

4 ETA MEDIA DELLE PERSONE COLPITE DA LESIONE TRAUMATICA

5 CONSEGUENZE DELLA LESIONE SPINALE Dipendono dal livello e dall entità della lesione spinale Perdita della motricità: paraplegia, tetraplegia; Spasticità muscolare; Dolore cronico; Perdita/alterazione sensoriale; Disriflessia autonomica: alterata risposta del sistema nervoso autonomo; Disfunzioni sessuali; Problemi vescicali e intestinali; Problemi circolatori e respiratori; Ipersensibilità a caldo e freddo.

6 MIGLIORAMENTI AUSPICATI DAI PAZIENTI

7 APPROCCI TERAPEUTICI REALI E POSSIBILI Ridurre il danno in fase acuta (rimozione di coaguli, riduzione dell infiammazione ecc..); Ridurre i fattori che impediscono la rigenerazione (cicatrice gliale, fattori biochimici che impediscono la crescita delle fibre nervose ecc..); Favorire attivamente la rigenerazione (esercizio, riabilitazione, farmaci, trapianti); Protesi e altri ausili tecnici (stimolatori muscolari ecc..); Cure sintomatiche (dolore, piaghe, infezioni, problemi psicologici ecc..);

8 COME VENGONO SCOPERTE LE NUOVE CURE? COME VENGONO TESTATE? Innanzitutto è necessario aumentare le conoscenze di base sulla fisiologia del midollo spinale (ricerca di base); Non tutte le ricerche si possono effettuare direttamente sull uomo; Alcune si possono effettuare con l utilizzo di cellule provenienti da biopsie oppure da animali; Altre ricerche richiedono modelli animali.

9 I MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE Creare situazioni sperimentali simili alle varie condizioni cliniche per: Studiare gli effetti della lesione, dal punto di vista: a) istologico (taglio delle fibre nervose, necrosi tissutale, infiammazione, gliosi ecc..); b) cellulare (morte cellulare, stress, cambiamenti biochimici, alterazioni sinaptiche ecc..); c) biochimico (alterazioni metaboliche, enzimi, recettori ecc..); d) funzionale (attività motoria, autonomica, dolore cronico ecc..). Studiare il possibile recupero spontaneo, dal punto di vista: a) istologico (sprouting delle fibre nervose risparmiate dalla lesione, cicatrizzazione, neurogenesi); b) cellulare (plasticità sinaptica); c) biochimico (cambiamenti dell espressione di proteine, enzimi, ecc..); d) funzionale (recupero dell attività motoria, ripristino delle funzioni viscerali ecc..). Studiare strategie di riparazione, utilizzando: a) esercizio fisico (ginnastica passiva, locomozione); b) somministrazione di fattori neurotrofici (con mezzi fisici o tramite cellule che li producono); c) protesi robottizzate; d) trapianti neurali (di tessuto, di cellule mature, di cellule staminali, di cellule producenti molecole farmacologicamente attive).

10 MODELLI ANIMALI DI LESIONE SPINALE Contusione; Transezione incompleta (emisezione spinale); Transezione totale; Taglio di specifiche vie nervose; Deafferentazione; Nerve crush; Lesioni neurotossiche selettive: eliminazione selettiva dei motoneuroni, demielinizzazione (con tossine retrograde o con iniezione diretta nel midollo).

11 SISTEMI DI STEREOTASSIA E CHIRURGIA SPINALE A B Sono sistemi che servono a fissare l animale anestetizzato per poi raggiungere le varie strutture nervose tramite l utilizzo di coordinate cartesiane riportate in appositi atlanti di anatomia. Si possono utilizzare sia per strutture cerebrali (A) che per la chirurgia spinale (B).

12 ATLANTE STEREOTASSICO DEL SNC DEL RATTO

13 ALCUNI TEST PER VALUTARE IL DEFICIT MOTORIO A) Basso, Beattie, Bresnahan A rating scale: è un criterio di valutazione qualitativa della funzionalità motoria degli arti, che si basa sull attribuzione di punteggi arbitrari sulla base delle capacità di movimento e coordinazione motoria. B C B) Grid walk test: è una specie di scala orizzontale all interno di un corridoio, sulla quale gli animali devono camminare. L abilità motoria viene valutata in base al numero di inforcamenti degli arti tra i pioli. C) Rota-rod test: gli animali devono aggrapparsi a un tubo rotante e mantenersi in equilibrio camminando su di esso. Si misura il tempo dall inizio del test alla caduta. Il test prevede una durata massima e può essere effettuato a velocità costante o in accelerazione.

14 CONTUSIONE SPINALE Impactor: consiste in un braccio recante l applicatore di pressione, che va montato sul sistema di stereotassia. Si anestetizza l animale; Dopo aver fissato la colonna vertebrale, si pratica un foro sulla vertebra; Con l utilizzo di uno strumento (Spinal Impactor) si applica, sulla superficie del midollo, una pressione di entità e durata regolabile, in base all entità del danno che si vuole sperimentalmente provocare. Questo tipo di lesione determina trauma locale, con infiammazione e degenerazione del tessuto.

15 EMISEZIONE SPINALE Si anestetizza l animale; Dopo aver fissato la colonna vertebrale, si pratica un foro sulla vertebra; Si incide la dura madre e, con l utilizzo di una microlama, si taglia metà del midollo spinale. L emisezione determina: Trauma locale, con necrosi e infiammazione; Taglio delle vie spinali ascendenti e discendenti di un lato del midollo.

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17 TRANSEZIONE SPINALE COMPLETA Consiste nel taglio completo del midollo spinale, e quindi nella totale interruzione delle vie nervose che corrono lungo il midollo stesso; Si può utilizzare, oltre che come modello di lesione su cui testare nuove terapie, anche come modello per ricerche di base in cui si studiano gli automatismi del midollo spinale e i meccanismi compensatori.

18 NERVE CRUSH Consiste nel danneggiamento di un nervo periferico, ad esempio il nervo sciatico; La lesione periferica determina, oltre ai problemi di conduzione dei segnali motori e sensoriali, anche la degenerazione dei neuroni spinali le cui fibre vengono danneggiate dalla lesione; Questi modelli possono servire come ricerca di base, o anche per sperimentare terapie mirate alla prevenzione della morte cellulare o a favorire la reinnervazione.

19 LESIONI NEUROTOSSICHE SELETTIVE Si avvalgono dell utilizzo di sostanze citotossiche, cioè in grado di uccidere le cellule una volta al loro interno. Alcune di queste tossine possono essere coniugate con molecole che riconoscono selettivamente soltanto alcuni tipi di cellule. Esistono così tossine selettive per i neuroni che producono dopamina, o tossine selettive per i motoneuroni, ecc Iniettando queste tossine in prossimità delle cellule, queste penetrano selettivamente all interno dello specifico tipo cellulare e ne provocano la morte. Alcune tossine, come la volkensina o la Cholera Toxin B-saporin, sono selettive per i motoneuroni, e possono ucciderli se iniettate nel muscolo, in quanto vengono captate dalle terminazioni nervose dei motoneuroni che innervano il muscolo, vengono trasportate lungo l assone, arrivano al corpo cellulare e uccidono la cellula.

20 Lesione neurotossica selettiva per i motoneuroni spinali: ottenuta tramite l iniezione di volkensina nel muscolo gastrocnemio mediale di ratti neonati Trapianto di motoneuroni di origine embrionale nel midollo spinale lesionato: il trapianto sopravvive ed è funzionalmente attivo

21 COSA PUO' FAVORIRE LA RIPARAZIONE? 1) Plasticità sinaptica 2) Ripristino spontaneo dell'innervazione tramite sprouting 3) Cell replacement spontaneo tramite neurogenesi 4) Cell replacement tramite trapianti di cellule staminali o neuroni 5) Uso dei trapianti per veicolare farmaci e per trasferire geni all'interno del tessuto nervoso

22 NEUROPLASTICITA

23 PLASTICITA' SINAPTICA Consiste nel cambiamento a lungo termine della risposta sinaptica agli impulsi in arrivo. A parità di impulsi, aumentano o diminuiscono il rilascio di neurotrasmettitori e/o la risposta post-sinaptica. La plasticità sinaptica è attivitàdipendente, è mediata da neuromodulatori come il BDNF, e dipende dalla sintesi di nuove proteine.

24 PLASTICITA' SINAPTICA (a livello presinaptico)

25 ESERCIZIO FISICO

26 NEUROGENESI NELLA ZONA SUBVENTRICOLARE (SVZ)

27 NEUROGENESI NELL'IPPOCAMPO

28 NEUROGENESI NEL MIDOLLO SPINALE

29 NEUROGENESI E RIGENERAZIONE Tuttavia, la neurogenesi spontaneo nel midollo spinale è molto scarsa e porta alla produzione di glia. Sono in studio metodi sperimentali per stimolarla

30 MECCANISMI MOLECOLARI DELLA NEUROGENESI

31 MECCANISMI MOLECOLARI DELLA NEUROGENESI: FATTORI MORFOGENETICI

32 GLI STESSI FATTORI POSSONO REGOLARE ANCHE ALTRI FENOMENI PLASTICI COME LA PLASTICITA SINAPTICA

33 TRAPIANTI DI CELLULE STAMINALI NEURALI IMPORTANTE!! I trapianti neurali sono ancora allo stadio di sperimentazione sui modelli animali. Non esistono protocolli validati di trapianto nella lesione spinale dell uomo. Si tratta di approcci terapeutici promettenti ma ancora da verificare.

34 TIPI DI CELLULE DA TRAPIANTARE NEL SISTEMA NERVOSO tessuto nervoso; cellule staminali embrionali (ES); cellule staminali neurali; neuroni ottenuti da tessuto fetale o da ES o da altre cellule staminali; olfactory ensheating cells; cellule staminali ematopoietiche; cellule stromali del midollo osseo; cellule staminali del cordone ombelicale.

35 TRAPIANTO Le cellule vengono raccolte dalle fiasche, centrifugate e risospese in una soluzione fisiologica iniettabile. Poi vengono iniettate nel Sistema Nervoso Centrale utilizzando delle microsiringhe.

36 APPLICAZIONI DEI TRAPIANTI NEURALI Diseases with progressive cell degeneration myelin disorders Acute diseases stroke spinal cord injury Parkinson s disease Alzheimer s disease Amyotrophic lateral sclerosis Huntington s disease Lysosomal storage diseases Krabbe disease or globoid cell leukodystrophy Batten disease or S-acylated proteins ceroid lipofuscinosis Gaucher disease,

37 DOPO IL TRAPIANTO, LE CELLULE POSSONO INDURRE MIGLIORAMENTI DOVUTI A Meccanismo Meccanismo d azione Limitazione del danno tissutale risposte plastiche compensatorie indotte dall infiammazione interferenza con i circuiti residenti Correzione di deficit biochimici Rilascio di trasmettitori mancanti ( mini-pump ) Secrezione di fattori trofici Stimolazione di fenomeni plastici e aumentata capacità di sopravvivenza e mantenimento funzionale delle cellule Reinnervazione locale Ripristino del rilascio sinaptico di neurotrasmettitore Ricostruzione dei circuiti nervosi Ripristino delle connessioni nervose afferenti ed efferenti

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39 CELLULE STAMINALI NEURALI SI POSSONO OTTENERE DA TESSUTO FETALE Neural stem cells Mitogens Mitogens Embryonic brain Ventricular system

40 Neurosfere Live Live egfp egfp egfp egfp

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42 Other stem cells Bone marrow stromal cells (BMSCs) Transplantation of either human or rat BMSCs into the 6-OHDA-treated rat striatum induces improvement in rotational behavior. Some surviving tyrosine hydroxylase-positive immunoreactive cells extend processes into the striatum. To date, no evidence of tumor formation or unanticipated side effects in these models. problem: difficult to derive large numbers of dopamine neurons from BMSCs or to induce survival of meaningful numbers of cells following transplantation.

43 Umbilical stem cells The umbilical cord matrix contains primitive stem cells. Medicetty et al. demonstrated that transplanted porcine umbilical stem cells survive and proliferate in the striatum of 6-OHDA-lesioned rats. By 8 weeks post-surgery 6% had spontaneously differentiated into tyrosine hydroxylase-positive cells. Rejection was not observed. (Medicetty S, Bledsoe AR, Fahrenholtz CB, et al. Transplantation of pig stem cells into rat brain: proliferation during the first 8 weeks. Exp Neurol 2004;190:32 41) It is far from clear that these cells can be induced to readily differentiate into dopamine neurons and provide sufficient benefits in laboratory models of parkinsonism to warrant consideration of trials in Parkinson s disease patients.

44 Transplantation of neural stem cells in animal models of spinal cord injury

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46 Differentiation of engrafted cells and positive effects on locomotor behaviour

47 Transplantation of neurospheres in animal models of multiple sclerosis Bimodal mechanism of action: - direct anatomical and functional re-ensheathing of myelin at the lesion site - inhibition of astrogliosis, with positive effects on remyelination and reducing axonal loss Pluchino et al. and Martino, 2003

48 Conti et al., 2005

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50 NS cells trapianto

51 Siti di iniezione del trapianto Corteccia Ippocampo Striato

52 Predifferentiated Cor1-eGFP in the Hippocampus egfp NeuN Overlay (egfp+neun)

53 Predifferentiated Cor1-eGFP in the Striatum egfp NeuN Overlay (egfp+neun)

54 Predifferentiated Cor1-eGFP in the Cortex egfp NeuN Overlay (egfp+neun)

55 Fattori che influenzano il differenziamento in vivo Tipo di cellule staminali Numero di cellule trapiantate Trattamento in vitro (numero di passaggi, modifiche genetiche, differenziamento) Sede del trapianto (neurogenicità) Presenza di lesioni e loro effetti tissutali Sfasamento tra lo stato differenziativo del trapianto e gli stimoli ricevuti dal tessuto

56 Applicabilità alla terapia Requisiti richiesti: Quantità di cellule sufficiente Sufficiente varietà di fonti Compatibilità istologica Sicurezza sanitaria accertata

57 Fonti di staminali umane adulte: Midollo osseo Sangue periferico Cordone ombelicale Biopsie di vari tessuti

58 Problemi: Scarsa disponibilità e varietà di fonti Problemi di istocompatibilità in caso di donazione (rigetto) Cellule non pluripotenti controversie sul transdifferenziamento

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60 Transplantation of stem cells in humans (1)

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