Corso integrato di microbiologia prof. ord. e coordinatore del corso : prof. M.A.Tufano

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1 Corso integrato di microbiologia prof. ord. e coordinatore del corso : prof. M.A.Tufano Lezione : Antibiotici e antibiogramma Docente : M.R.Iovene Indirizzo Mail: mariarosaria.iovene@unina2.it 1

2 Struttura batterica 2

3 BATTERI Aerobi Gram Positivi Gram Negativi Anaerobi Gram Positivi Gram Negativi 3

4 4

5 5

6 Numerosi ceppi batterici colonizzano differenti distretti corporei 6

7 BACTERIA COMMONLY FOUND ON THE SURFACES OF THE HUMAN BODY BACTERIUM Skin Conjunctiva Nose Pharynx Mouth Lower Anterior Intestine urethra Vagina Staphylococcus epidermidis (1) Staphylococcus aureus* (2) + +/ /- + Streptococcus mitis /- + + Streptococcus salivarius Streptococcus mutans* (3) + ++ Enterococcus faecalis* (4) +/ Streptococcus pneumoniae* (5) +/- +/ /- Streptococcus pyogenes* (6) +/- +/ /- +/- Neisseria sp. (7) Neisseria meningitidis* (8) Veillonellae sp. + +/- Enterobacteriaceae* (Escherichia coli) (9) +/- +/- +/ Proteus sp. +/ Pseudomonas aeruginosa* (10) +/- +/- + +/- Haemophilus influenzae* (11) +/ Bacteroides sp.* /- Bifidobacterium bifidum (12) ++ Lactobacillus sp. (13) Clostridium sp.* (14) +/- ++ Clostridium tetani (15) +/- Corynebacteria (16) Mycobacteria + +/- +/- + + Actinomycetes + + Spirochetes Mycoplasmas /- + 7

8 Meccanismi di difesa dell ospite L integrità delle superfici corporee costituisce insieme ad una serie di fattori, una barriera all iniziale attecchimento e penetrazione dell agente patogeno 8

9 Fonti- da dove provengono i microrganismi? Madre Via trasplacentare Allattamento Canale del parto Noi stessi Altri individui Animali Ambiente Sani Portatori Malati 9

10 I batteri patogeni possono prendere il sopravvento, quando l equilibrio e i meccanismi di difesa dell ospite vengono, per fattori interni o esterni, ad alterarsi. 10

11 Il primo a dare un approccio diverso alla ricerca sulle malattie infettive fu Paul Ehrlich (1854( ). Egli propose che per combattere queste malattie,si utilizzassero farmaci precisi, i chemioterapici (termine termine coniato dallo stesso scienziato), tossici per il microrganismo patogeno 11

12 CHEMIOTERAPIA (definizione) Paul Ehrlich, 1910 Insieme dottrinale e metodologico volto alla ricerca di sostanze chimiche artificiali e naturali dotate di tossicità selettiva nei confronti di cellule procariotiche od eucariotiche responsabili di infezioni, infestioni, neoplasie o disordini immunologici. SI DISTINGUONO, IN FUNZIONE DEI DIVERSI BERSAGLI, TRE SETTORI DELLA CHEMIOTERAPIA: 1) ANTIMICROBICA (ETIOTROPA) 2) ANTIBLASTICA 3) IMMUNOMODULANTE scaricato da 12

13 (Paul Erlich ) Basi razionali della chemioterapia Tossicità selettiva Recettore specifico dell agente patogeno Screening di prototipi naturali e semisintesi di analoghi Ruolo dei modelli animali Problema della chemioresistenza Corpora non agunt nisi fixata (P. Erlich 13 giugno 1914) 13

14 Da un consiglio di Ehrlich pubblicato nel 1913 Frapper fort et frapper vite Colpisci forte e colpisci in fretta Paul Ehrlich, Lancet

15 Tra gli scienziati che parteciparono attivamente alle ricerche sui chemioterapici vi fu anche Alexander Fleming ( ) casualmente, scoprì nel 1928 una sostanza che presentava effetti antibatterici e che arrivò più tardi a chiamare penicillina. Egli, infatti, mentre era intento a pulire nel suo laboratorio, fu incuriosito da una piastra di petri con Stafilococchi che era stata inquinata da una muffa. Le colonie di questa muffa, che egli stabilì essere di Penicillium notatum, avevano causato una zona di inibizione della crescita degli Stafilococchi che stavano nelle vicinanze delle stesse. Fleming ipotizzò che la muffa avesse prodotto una sostanza letale per gli Stafilococchi, che era, appunto, la penicillina 15

16 penicillium notatum 16

17 Alone di inibizione formatosi intorno a penicillum notatum inoculato con stafilococco 17

18 Howard Walter Florey ( ) Ernst Boris Chain ( ) Discovery of terapeutic effects of penicillin Nobel Prize in Physiology or Medicine for the discovery of penicillin and its therapeutic effects Sir Alexander Fleming Sir Ernst Boris Chain Baron Howard Walter Florey scaricato da penicillin culture at the Sir William Dunn School of Pathology Oxford, England,

19 A poster from World War Two 19

20 Sviluppo ed efficacia della chemioterapia antimicrobica ( ) scaricato da 20

21 I capostipiti 1935 PRONTOSIL ROSSO (Domagk) 1941 PENICILLINA G (1929) (Fleming, Chain, Florey) 1944 STREPTOMICINA (Waksman, Shatz, Bugle) 1945 CEFALOSPORINE P,N,C (Brotzu) 1947 CLORTETRACICLINA (Duggar) 1947 CLORAMFENICOLO (Burkholder) 1952 ISONIAZIDE (Fox) 1952 ERITROMICINA (Mc Guire) 1955 VANCOMICINA (Mc Cormick) 1955 AMFOTERICINE A,B (Gold) 1959 RIFAMICINE A,B,C,D,E (Sensi) 1959 STAFILOMICINA (Vanderhaege) 1962 AC. NALIDIXICO (Lesher) 1987 DuP

22 ANTIBIOTICI Definizione: Con il termine antibiotico si intende una molecola naturale, metabolita secondario di Eubatteri, Actinomiceti e Funghi inferiori, prodotta in coincidenza della differenziazione di strutture cellulari specializzate per la sopravvivenza microbica quando il substrato è esaurito, questa molecola è in grado di inibire la crescita di altri microrganismi. Dal momento che attualmente molte molecole vengono prodotte per via sintetica o semisintetica è più corretto utilizzare il termine CHEMIOANTIBIOTICO. 22

23 Produzione di sostanze antibiotiche indotta dalla carenza di metaboliti azotati ESAURIMENTO SUBSTRATO CRESCITA PRE-SPORULAZIONE CRESCITA ESPONENZIALE CRESCITA POST-LOGARITMICA LISI SPORE DEPRESSIONE CATABOLICA Actimomiceti Funghi inferiori ANTIBIOTICI ESOENZIMI ESOTOSSINE Bacillacee 23

24 Classificazione degli ANTIBIOTICI Esistono diversi sistemi di classificazione in considerazione del notevole numero di molecole utilizzate nella pratica clinica. 24

25 CLASSIFICAZIONE 1. Classificazione in FAMIGLIE 2. Secondo l' ORIGINE 3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE 4. Secondo il TIPO D'AZIONE 5. In base al MECCANISMO D'AZIONE 25

26 1.Classificazione in FAMIGLIE Vengono classificati in "famiglie" molecole che presentano caratteristiche simili (es. penicilline, cefalosporine,aminoglucosidi, tetracicline etc.) 26

27 Classificazione degli ANTIBIOTICI 2. Secondo l' ORIGINE Estrattiva: da batteri e funghi (Penicillium,Cephalosporium, Streptomyces) Semisintetica: partendo da una struttura base, ottenuta per estrazione (fermentazione) e aggiungendo catene di sintesi Sintesi chimica: molti composti si ottengono per sintesi chimica (chinoloni, monobattami, cloramfenicolo etc) 27

28 Classificazione degli ANTIBIOTICI 3. Secondo lo SPETTRO D'AZIONE Si intende per spettro d'azione, il ventaglio delle specie batteriche nei riguardi delle quali l'antibiotico mostra attività. Ampio: (Gram positivi e negativi) Medio: (Gram + ed alcuni Gram -) Ristretto: (solo Gram - o solo Gram +) 28

29 Classificazione degli ANTIBIOTICI 4. Secondo il TIPO D'AZIONE batteriostatica: blocca la riproduzione dei batteri battericida: (determina la morte dei batteri) Si definisce battericida un antibiotico il quale dopo 24 h di contatto "in vitro determina una sopravvivenza dei germi uguale o inferiore allo 0,01%. 29

30 Classificazione degli ANTIBIOTICI 5. In base al MECCANISMO D'AZIONE 1. Antibiotici che inibiscono la sintesi della parete cellulare, tale inibizione si può verificare: nella prima fase di sintesi (inibizione della fosfoenolpiruvatotransferasi) : Fosfomicina oppure (mancata utilizzazione della alanina): Cicloserina. nella seconda fase (trasferimento e polimerizzazione del mucopeptide parietale) Vancomicina. a livello terminale (fase di transpeptidizzazione) Penicilline, Cefalosporine. 30

31 Classificazione degli ANTIBIOTICI 5. In base al MECCANISMO D'AZIONE 2. Antibiotici che inibiscono la sintesi proteica, tale inibizione può avvenire: a livello della subunità 30S dei ribosomi (aminoglicosidi,tetracicline) a livello della subunità 50S dei ribosomi (cloramfenicolo,macrolidi) 3. Antibiotici che inibiscono il meccanismo di replicazione e di trascrizione degli acidi nucleici: inibizione della RNA-polimerasi (rifamicine) inibizione della DNA-girasi o topoisomerasi (chinoloni) 31

32 Classificazione degli ANTIBIOTICI 5. In base al MECCANISMO D'AZIONE 4. Antibiotici che alterano la membrana citoplasmatica batterica o micotica (polimixine, polieni) 5. Antibiotici che agiscono come antimetaboliti (sulfamidici, trimetropim) 32

33 MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica (macrolidi, tetracicline, aminoglicosidi, oxazolidinoni) Inibizione della sintesi della parete cellulare (penicilline, cefalosporine, glicopeptidi) Inibizione della replicazione del DNA (fluorochinoloni) Trasformazioni metaboliche nel citoplasma (sulfonamidi, trimetoprim) Interferenza con la membrana citoplasmatica (polimixina) 33

34 ANTIBIOTICO RESISTENZA E la capacità dei batteri di essere o di diventare resistenti nei confronti degli antibiotici. Principale problema dell antibiotico-terapia di grande attualità e di profondo impatto pratico. Condiziona la scelta, l impiego, il futuro della chemioterapia Iniziato con la nascita della chemioterapia, ne segue costantemente il decorso 34

35 MECCANISMI DELL ANTIBIOTICO RESISTENZA I meccanismi attraverso i quali può instaurarsi una resistenza antibiotica sono: ridotta permeabilità cellulare aumentato efflusso alterazione del bersaglio produzione di enzimi inattivanti 35

36 MECCANISMI DELL ANTIBIOTICO RESISTENZA 1. Ridotta permeabilità cellulare: la penetrazione di un antibiotico può essere ridotta da cambiamenti strutturali negli involucri superficiali della cellula. Nei Gram- la resistenza può essere dovuta ad alterazione delle porine (proteine di membrana attraverso le quali penetrano molti antibiotici) 36

37 MECCANISMI DELL ANTIBIOTICO RESISTENZA 2. Aumentato efflusso: L antibiotico penetrato nella cellula batterica è allontanato da sistemi di efflusso. Nei Gram- le pompe di efflusso operano accoppiate a proteine canale che provocano l espulsione l diretta del farmaco 37

38 MECCANISMI DELL ANTIBIOTICO RESISTENZA 3. Alterazione del bersaglio: il bersaglio dell antibiotico è alterato e non è più riconosciuto dall antibiotico. antibiotico. 4. Produzione di enzimi inattivanti: l antibiotico perde la sua attività biologica, poiché viene inattivato da enzimi specifici. (beta-lattamasi,, acetiltransferasi, fosfotransferasi, adeniltransferasi) 38

39 MECCANISMI DELL ANTIBIOTICO RESISTENZA Produzione di enzimi inattivanti 1) nello spazio periplasmico per i Gram negativi (a,b,c) 2) extra cellulari per i Gram positivi (d) 39

40 RESISTENZA NATURALE (origine naturale) Insensibilità costituzionale di un microrganismo verso un determinato antibiotico Immutabile nel tempo, geneticamente determinata Si manifesta in tutti i ceppi di una stessa specie Dipende: caratteristiche dell antibiotico strutture del microrganismo mancata penetrazione del farmaco attraverso le strutture esterne del microrganismo Es. insensibilità degli Enterobatteri per la penicillina o dei batteri Gram negativi per i glicopeptidi 40

41 RESISTENZA ACQUISITA (variazione informazionale) Comparsa di ceppi che, nell ambito di una specie microbica originariamente sensibile ad un chemioterapico, hanno perduto la sensibilità verso concentrazioni del farmaco terapeuticamente raggiungibili in vivo. 41

42 E favorita dall elevata velocità con cui i batteri si moltiplicano Distinguiamo : cromosomica o endogena extracromosomica o esogena 42

43 RESISTENZA CROMOSOMICA Costituisce solo il 10-15% 15% di tutte le resistenze acquisite (bassa frequenza di insorgenza) Si realizza tramite un alterazione mutazionale spontanea dell informazione genetica cromosomica L antibiotico esercita un azione selettiva (seleziona i mutanti resistenti inibendo le cellule sensibili) Tale resistenza interessa solo l antibiotico l verso il quale sono stati isolati i mutanti resistenti Gli stessi mutanti possono essere resistenti anche ad altri antibiotici con caratteristiche simili (resistenza crociata o cross - resistenza) Si trasmette verticalmente tramite la discendenza (da cellula madre a cellula figlia) scaricato da 43

44 Può essere: RESISTENZA CROMOSOMICA multi-step step: sono necessarie più mutazioni perché possa instaurarsi (es. beta-lattamine, macrolidi, cloramfenicolo) one-step step: è sufficiente una sola mutazione per determinare la comparsa di ceppi totalmente resistenti (es. rifamicine, chinoloni) 44

45 RESISTENZA EXTRACROMOSOMICA Costituisce il 90% di tutte le resistenze (alta frequenza di insorgenza) Si origina per acquisizione di nuova informazione genetica che deriva da altri microrganismi e che penetra nella cellula mediante i meccanismi di coniugazione, trasformazione e trasduzione Riguarda più antibiotici contemporaneamente ( (resistenza multipla) E a trasmissione orizzontale ( (tramite lo scambio genetico) Può essere trasferita anche a microrganismi appartenente a specie differenti (resistenza contagiosa) E dovuta a geni presenti su plasmidi o trasposoni ( (elementi genici mobili) 45

46 46

47 Trasduzione : Un batteriofago funge da vettore e trasferisce il DNA contenente un gene di resistenza da una cellula batterica ad un'altra. 47

48 Principali meccanismi di resistenza antibatterica Modifica della sede bersaglio (intra o extracellulare; β-lattamici, macrolidi, chinoloni, glicopeptidi) Ridotta permeabilità (co-trimossazolo) Degradazione enzimatica intra o extracellulare; β-lattamici, aminoglucosidi) X Deflusso (macrolidi, chinoloni) scaricato da Bypass (co-trimossazolo) 48

49 Classi di Antibiotici Betalattamici Aminoglucosidi Chinoloni Glicopeptidi Oxazolidinoni Macrolidi Ketolidi Lincosamidi Rifamicine Tetracicline Cloramfenicolo Polipeptidici Polimixine Streptogramine Altri Vari Fosfomicina Acido fusidico Spectinomicina Novobiocina 49

50 MECCANISMI DI AZIONE DELLE PRINCIPALI CLASSI di ANTIBIOTICI Inibizione della sintesi proteica (macrolidi, tetracicline, aminoglicosidi, oxazolidinoni) Inibizione della sintesi della parete cellulare (penicilline, cefalosporine, glicopeptidi) Inibizione della replicazione del DNA (fluorochinoloni) Trasformazioni metaboliche nel citoplasma (sulfonamidi, trimetoprim) Interferenza con la membrana citoplasmatica (polimixina) 50

51 Che cosa si intende per antibiogramma? L antibiogramma è un metodo di valutazione in vitro dell interazione tra il microrganismo isolato e gli antibiotici più appropiati per il trattamento in vivo. 51

52 Isolare l agente eziologico in coltura pura, identificarlo con i test biochimici per permettere la classificazione in genere e specie L identificazione dei germi isolati dai campioni biologici, riveste importanza clinica ed epidemiologica ed è una tappa fondamentale per allestire i test di sensibilità agli antibiotici 52

53 La scelta degli antibiotici da saggiare in vitro viene fatta per via generale in base alle linee guida di NCCLS(National Committee for Clinical Laboratory Standard). In particolare, però, ogni laboratorio ha il dovere di aggiornarsi e/o partecipare attivamente agli studi epidemiologici recenti o in corso, che studiano per ogni patologia la frequenza di isolamento degli agenti patogeni da cui possiamo estrapolare le resistenze batteriche locali. 53

54 Metodi di antibiogramma PER DILUIZIONE -in terreno liquido -in terreno solido PER DIFFUSIONE -in terreno solido In ogni caso,i risultati ottenuti devono essere tradotti in categorie di sensibilità o di resistenza. 54

55 Definizione di MIC e MCB Per valutare se un antibiotico è batteriostatico o battericida si determinano le M.I.C e le M.B.C. o- M.I.C. o minima concentrazione inibente è la minima concentrazione di antibiotico in grado di impedire lo sviluppo dei microrganismi o- M.B.C. o minima concentrazione battericida è la minima concentrazione di antibiotico in grado di portare a morte le cellule batteriche. 55

56 56

57 57

58 Si prelevano con una ansa sterile tre o quattro colonie isolate 58

59 Quindi si stemperano in un brodo sterile (inoculo) 59

60 Viene misurata con un turbidimetro la torbidità dell inoculo che secondo i metodi standard non deve superare 0.5 Mac Farland(10 8 CFU/ml ), l inoculo l utilizzato dovrebbe condurre a crescita semi-confluente delle colonie dopo una incubazione notturna. Un inoculo non corretto (colonie a crescita confluente o separate) può essere rapidamente riconosciuto e le prove con inoculo non idoneo o dovrebbero essere ripetute. 60

61 Metodo per diluizione in terreno liquido 61

62 Metodo per diluizione (determinazione della MIC) ,5 0,25 0,12 62

63 Metodo per diluizione (determinazione della MIC) ,5 0,25 0,12 scaricato da MIC 63

64 64

65 Determinazione della MIC (micrometodo) scaricato da 65

66 Determinazione della MIC (micrometodo) scaricato da 66

67 Determinazione della MIC (micrometodo) scaricato da 67

68 Metodica di Antibiogramma su micropiastra per la determinazione della MIC 68

69 Metodo per diffusione in terreno solido 69

70 l'antibiogramma per diffusione Densità dell'inoculo : 0,5 McFarland = 10 8 CFU/ml Terreno di coltura: composizione (Muller-Hinton agar) spessore: 4 mm (25 ml per piastre da 9 cm, 60 ml per piastre da 15 cm) ph: 7,2-7,4 - Uso di dischetti in carta bibula (diametro 6,35 mm) imbevuti da Concentrazione standard degli antibiotici da saggiare Temperatura d'incubazione C Tempo d'incubazione 15-18h 18h 70

71 Esecuzione dell antibiogramma col metodo per diffusione 71

72 Esecuzione dell antibiogramma col metodo per diffusione 72

73 Esecuzione dell antibiogramma col metodo per diffusione 73

74 Antibiogramma per diffusione secondo Kirby-Bauer : aloni di inibizione 74

75 Misura degli aloni di inibizione scaricato da 75

76 Misura degli aloni di inibizione scaricato da 76

77 Antibiogramma per diffusione su Escherichia coli 77

78 Antibiogramma per diffusione su Pseudomonas aeruginosa 78

79 Antibiogramma per diffusione su Pseudomonas aeruginosa 79

80 VANTAGGI E SVANTAGGI DEI METODI TRADIZIONALI Metodo per diluizione in terreno liquido Pro: risultati quantitativi (MIC) Contro: lentezza e complessità di esecuzione (se non automatizzato) Metodo per diffusione in terreno solido Pro: rapidità e facilità di esecuzione Contro: risultati qualitativi (sensibile - intermedio - resistente) Etest Pro: rapidità e facilità di esecuzione Pro: risultati quantitativi (MIC) 80

81 Caratteristiche di Etest Etest è costituito da strisce di plastica di 5 x 50 mm contenenti un gradiente corrispondente a 15 concentrazioni a raddoppio di antibiotico (in mg/ml). Queste sono variabili secondo i diversi antibiotici: La tecnica di semina è analoga a quella dell antibiogramma per diffusione secondo Kirby-Bauer. La lettura della MIC si effettua dove la crescita batterica interseca la striscia. 81

82 82

83 Applicazione della striscia 83

84 Applicazione della striscia 84

85 5 o 6 strisce sulle piastre da 15 cm strisce sulle piastre da 9 cm 85

86 E test : metodica per diffusione, lettura in MIC 86

87 Gli antibiotici battericidi formano un ellissi molto netta 87

88 Gli antibiotici batteriostati ci possono formare un ellissi sfumata 88

89 Sottopopolazione resistente di pneumococco 89

90 Sottopopolazione resistente ad elevata frequenza di mutazione 90

91 E test 91

92 METODI AUTOMATIZZATI Nuovo tipo di apparecchiatura chiusa, e computerizzata che ci da la possibilità di identificare con certezza un agente patogeno e di eseguire l antibiogramma l o MIC in automatico 92

93 ANTIMICOGRAMMA 93

94 Nei primi anni 90 i derivati azolici erano considerati la soluzione alle infezioni fungine. Attualmente, specie prima infrequenti di Candida (Candida krusei) risultano intrinsecamente resistenti al fluconazolo, mentre le altre specie possono acquisire resistenza secondaria. I ceppi di Candida con resistenza secondaria al fluconazolo sono probabilmente resistenti anche all itraconazolo Verso la flucitosina c èc un rapido sviluppo di resistenza da parte dei ceppi di Candida Amfotericina B è il farmaco a più ampio spettro di azione. Risultano resistenti Zygomiceti, Trichosporon, Fusarium e Candida lusitaniae 94

95 METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO SECONDO NCCLS (M27-A) PER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA DEI LIEVITI VERSO GLI ANTIMICOTICI Inoculo standardizzato 0.5 Mc Farland Terreno RPMI 1640, a ph 7 Metodica in piastra Microdiluizione Temperatura 35 C Durata dell incubazione 48h (Candida spp) 72h ( (C.neoformans) Gli antimicotici saggiati sono : Amfotericina B, Fluorocitosina, Ketoconazolo, Fluconazolo e Itraconazolo A diluizioni seriate di antimicotico viene aggiunto l inoculo l del lievito, la lettura è spettrofotometrica. 95

96 ATB FUNGUS (biomérieux) La lettura della galleria può essere manuale o automatica (lettore( ATB biomérieux rieux) 96

97 Controllo Amfotericina B Fluconazolo Itraconazolo Ketonazolo 5-Flucitosina SENSITRE YeastOne 97

98 METODICHE ALTERNATIVE ALLA MIC IN BRODO E TEST (AB Biodisk, Solna, Sweden) Determinazione di MIC in piastra Correlata con i test di riferimento Una crescita non uniforme del micete, e la frequente presenza di ricrescita all interno dell alone di inibizione, possono provocare difficoltà nella lettura del punto di inibizione della crescita. L uso dell E E test presuppone molta esperienza 98

99 E test (AB Biodisk.Sweden) Metodo di MIC in piastra scaricato da 99

100 100

101 METODO DELLE DILUIZIONI IN BRODO PROTOCOLLO NCCLS M38-P, PER LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA DELLE MUFFE NEI CONFRONTI DEGLI ANTIMICOTICI Inoculo 0.4x10-5x10 cfu/ml Inoculo standardizzato Metodo Terreno (Conidium and spore-forming fungi) Metodo spettrofotometrico (varia col genere di fungo) RPMI 1640 a ph7 Microdiluizione Metodo Microdiluizione Temperatura 35 C Durata dell incubazione Variabile Variabile (dipende dalla Muffa in esame) 101

102 102

103 grazie per l attenzione 103

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