Medical area. Influence of vitamin C moderate dose supplementation on exerciseinduced. lipid peroxidation, muscle damage and inflammation.

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1 Medical area Area medica MED SORT 2012;65: Influence of vitamin C moderate dose supplementation on exerciseinduced lipid peroxidation, muscle damage and inflammation Effetti di una moderata integrazione di vitamina C su perossidazione lipidica, infiammazione e danno muscolare indotti dall esercizio fisico S. BOHLOOLI 1, F. RAHMANI-NIA 2,. BABAEI 3, B. NAKHOSTIN-ROOHI 4 1Department of harmacology, School of Medicine, Ardabil University of Medical Sciences, Ardabil, Iran 2Department of Exercise hysiology, Guilan University, Rasht, Iran 3Cellular and Molecular Research Center, Guilan University of Medical Sciences, Rasht, Iran 4Department of Exercise hysiology, Ardabil Branch, Islamic Azad University, Ardabil, Iran SUMMARY Aim. The purpose of this study was to evaluate the effect of moderate dose vitamin C supplementation on exerciseinduced lipid peroxidation, muscle damage and inflammation. Methods. Sixteen healthy untrained male individuals participated in a 30-min exercise at 75% VO2max. Subjects were randomly assigned to one of two groups: 1) placebo () and 2) vitamin C (: 500 mg vitamin C). Blood samples were obtained prior to supplementation (baseline), 2 h after supplementation (immediately pre-exercise), immediately, 2 and 24 h after exercise. lasma levels of vitamin C, total antioxidant capacity (TAC), creatine kinase (CK), malondealdehyde (MDA), total leukocytes, neutrophils, lymphocytes, interleukin-6 (IL-6), and CR were measured. Results. With supplementation, plasma vitamin C concentration increased significantly only in the group (<0.05). TAC decreased significantly just in group, 2 and 24 h after exercise (<0.05). Although MDA levels were similar between groups at the baseline, only in the group it increased significantly after exercise (<0.05). CK increased immediately and 2 h after exercise in both groups and 24 h after exercise just in placebo group compared with preexercise (<0.05). Markers of inflammation (total leukocytes, neutrophils, CR and IL-6) increased significantly in response to the exercise in both groups (<0.05). Conclusion. In conclusion, it seems that vitamin C acute moderate dose supplementation affects exercise-induced lipid peroxidation and muscle damage, but not inflammatory markers. Key words: Dietary supplements - Exercise - Ascorbic acid - Inflammation. RIASSUNTO Obiettivo. Obiettivo del presente studio è stato quello di esaminare l effetto di una moderata integrazione di vitamina C sulla perossidazione lipidica, sull infiammazione e sul danno muscolare indotti dall esercizio fisico. Metodi. Sessanta individui di sesso maschile non allenati hanno eseguito un esercizio di 30 minuti al 75 % del VO2max. I soggetti sono stati assegnati in maniera casuale in uno di due gruppi: 1) placebo () e 2) vitamina C (: 500 mg di vitamina C). I campioni ematici sono stati raccolti prima della somministrazione dell integratore (baseline), 2 ore dopo (immediatamente prima dell esercizio), immediatamente, 2 e 24 ore dopo l esercizio. Sono stati poi misurati i livelli plasmatici di vitamina C, capacità antiossidante totale (CAT), creatinchinasi (CK), malondialdeide (MDA), leucociti, neutrofili e linfociti totali, interleuchina-6 (IL-6), e CR. Risultati. Con l integrazione, la concentrazione plasmatica di vitamina C è aumentata in maniera significativa solo nel gruppo (<0,05). La CAT è diminuita in maniera significativa solo nel gruppo, 2 e 24 ore dopo l esercizio (<0,05). Sebbene i livelli basali di MDA fossero simili tra i gruppi, l MDA è aumentata in maniera significativa solo nel Vol No. 2 MEDICINA DELLO SORT 187

2 BOHLOOLI INfLuENCE Of VITAMIN C gruppo dopo l esercizio (<0,05). La CK è aumentata immediatamente e 2 ore dopo l esercizio in entrambi i gruppi e 24 ore dopo l esercizio solo nel gruppo placebo rispetto a prima dell esercizio (<0,05). I marcatori infiammatori (leucociti totali, neutrofili, CR e IL-6) sono aumentati in maniera significativa in risposta all esercizio in entrambi i gruppi (<0,05). Conclusioni. er concludere, sembra che una moderata integrazione di vitamina C si ripercuota sulla perossidazione lipidica e sul danno muscolare indotti dall esercizio fisico, ma non sui marcatori infiammatori. arole chiave: Integratori alimentari - Esercizio fisico - Acido ascorbico - Infiammazione. hysical exercise may increase accumulation of free radicals and induce oxidative stress as a response to the increased oxygen consumption.1 free radicals or, more generally, reactive oxygen/nitrogen species (RONS) are products of normal cellular metabolism. RONS are well known for playing a dual role as both deleterious and beneficial species, since they can be either harmful or beneficial to living systems. The excess RONS can damage cellular lipids, proteins, or DNA, impairing their normal function.2 Evidence for increased RONS production during and following exercise is provided by numerous investigations noting an increase in various oxidative stress biomarkers following both acute aerobic and anaerobic exercise.3 It was claimed that adaptations to oxidative stress mediated by free radicals play an important role in maintaining cell viability in tissues routinely subjected to repeated stresses (e.g. muscle following regular exercise, etc.).4 In fact, some investigators have found that regular exercise could also exert protective and beneficial effect on oxidative stress related disease.5-7 Nevertheless, there is an agreement that acute and intense bout of exercise may induce malicious increase in RONS 7 which may lead to cell and organ damage in lack of sufficient defensive antioxidative system. Therefore, some investigators believe that supplementation with antioxidants may be one intervention to reduce oxidative stress in such conditions.8, 9 Interkeukine (IL-6) is one of the cytokines, most often classified as an inflammatory cytokine.10, 11 IL-6 production is modulated by carbohydrate availability in muscles, which functions as an energy sensor. It is released from contracting muscles in large amounts and exerts its endocrine effect on adipose tissue, inducing lipolysis and gene transcription in abdominal subcutaneous fat. IL-6 also known as exercise factor and belongs to myokine family.10 In addition, immune cells are mobilized and activated during exercise in response to muscle damage and also via the actions of stress hormones (cat- L esercizio fisico può aumentare l accumulo di radicali liberi e indurre uno stress ossidativo in risposta all aumentato consumo di ossigeno 1. I radicali liberi, o più in generale le specie reattive dell ossigeno/azoto (RONS), sono prodotti del normale metabolismo cellulare. È noto che le RONS rivestono il duplice ruolo di specie sia benefiche che nocive, in quanto possono apportare sia danni che benefici ai sistemi viventi. RONS in eccesso possono danneggiare i lipidi, le proteine o il DNA cellulari, riducendo la normale funzionalità cellulare 2. Numerose ricerche hanno osservato un aumentata produzione di RONS durante e in seguito all esercizio fisico, indicata dall aumento di diversi biomarcatori dello stress ossidativo, in seguito a un esercizio aerobico e anaerobico intenso 3. È stato evidenziato come gli adattamenti allo stress ossidativo mediato dai radicali liberi rivestano un importante ruolo nel mantenimento della vitalità cellulare in tessuti normalmente sottoposti a stress ripetitivi (ad es. nei muscoli in seguito al regolare esercizio fisico ecc.) 4. In realtà, alcuni ricercatori hanno osservato che l esercizio fisico regolare potrebbe anche esercitare un effetto benefico e protettivo sulle patologie correlate allo stress ossidativo 5-7. Ciononostante, vi è consenso sul fatto che una sessione di allenamento intenso può indurre aumenti pericolosi nelle RONS 7 che possono condurre al danneggiamento di cellule e organi in assenza di un adeguato sistema antiossidante. erciò, alcuni ricercatori affermano che l integrazione di antiossidanti possa rappresentare un valido intervento per ridurre lo stress ossidativo in tali condizioni 8, 9. L interleuchina (IL-6) è la citochina che più spesso è classificata come infiammatoria 10, 11. La produzione di IL-6 è modulata dalla disponibilità di carboidrati nei muscoli, i quali agiscono come sensori energetici. L IL-6 è rilasciata dai muscoli in contrazione in ampie quantità ed esercita il suo effetto endocrino sul tessuto adiposo, inducendo la lipolisi e la trascrizione genica nel grasso addominale sottocutaneo. L IL-6 è anche nota come fattore di esercizio, appartenente alla famiglia delle miochine 10. Inoltre, le cellule 188 MEDICINA DELLO SORT Giugno 2012

3 INfLuENCE Of VITAMIN C BOHLOOLI echolamines, growth hormone, cortisol) which are released in response to increased metabolic demands and core temperature during exercise.12, 13 Exercise-induced oxidative stress is another factor that affects cytokine production. Oxidative stress may result from oxidative reactions within skeletal muscle as well as from muscle damage.14 During exercise, endogenous antioxidant enzymes and dietary antioxidant supplements can potentially attenuate cytokine production by directly neutralizing RONS 15 and/or inhibiting the activity of redox-sensitive signal transduction pathways.16, 17 The available evidence suggests that the ingestion of large amounts of vitamin C offers some protection against lipid peroxidation.18 As vitamin C is water-soluble, availability may be increased with a single dose, and there may be no need for prolonged supplementation. In our previous study, an administration of a single high dose (1000 mg) vitamin C supplementation 2 h before one bout of exercise could influence lipid peroxidation and muscle damage.19 However, high dose supplementation of vitamin C has some side effects such as iron poisoning 20 and kidney stones.21 furthermore, moderate single dose supplementation may not interfere with necessary adaptive processes. The purpose of the present study was to determine whether exercise-induced lipid peroxidation and inflammation could be affected by single moderate dose (500 mg) vitamin C supplementation in untrained men participating in a 30-min running at 75% VO2max. Materials and methods Subjects and supplementation This was a double-blind, placebo-controlled study. Sixteen healthy, non-smoking, untrained young men were recruited for participation in this study. All subjects who took part in this study had approval from Guilan university Advisory Committee. Study was based on the Declaration of Helsinki. All participants were informed verbally and in writing about the nature and demands of study, and subsequently completed a health history questionnaire and gave their written informed consent. Subjects were free of vitamin/mineral supplementation for six weeks prior to the study. The subjects were randomly and evenly divided into a supplemented () group and a placebo () group. hysical immunitarie sono mobilizzate e attivate durante l esercizio fisico, in risposta al danno muscolare e mediante le azioni degli ormoni dello stress (catecolamine, ormone della crescita, cortisolo), i quali sono rilasciati in risposta a un aumento del fabbisogno metabolico e della temperatura basale corporea durante l esercizio fisico 12, 13. Lo stress ossidativo indotto dall esercizio fisico è un altro fattore che si ripercuote sulla produzione di citochine. Lo stress ossidativo può derivare da reazioni ossidative nei muscoli scheletrici, oltre che dal danno muscolare 14. Durante l esercizio fisico, gli enzimi antiossidanti endogeni e gli integratori alimentari di antiossidanti possono potenzialmente attenuare la produzione di citochine, neutralizzando direttamente le RONS 15 e/o inibendo l attività dei pathway di trasduzione del segnale redox-sensibile 16, 17. L evidenza disponibile suggerisce che l assunzione di grandi quantità di vitamina C offre una certa protezione contro la perossidazione lipidica 18. oiché la vitamina C è idrosolubile, la sua disponibilità può essere aumentata con una dose singola e potrebbe non essere necessario un regime di integrazione prolungato nel tempo. Nel nostro precedente studio, la somministrazione di una singola dose elevata (1000 mg) di vitamina C due ore prima di una sessione di allenamento era in grado di influenzare la perossidazione lipidica e il danno muscolare 19. Tuttavia, un elevata dose di vitamina C ha alcuni effetti collaterali come l avvelenamento da ferro 20 e i calcoli renali 21. Inoltre, una moderata integrazione a dose singola potrebbe non interferire con i necessari processi adattativi. Obiettivo del presente studio è stato quello di determinare se l infiammazione e la perossidazione lipidica indotte dall esercizio fisico possano essere influenzate da una moderata integrazione di vitamina C a dose singola (500 mg) in uomini non allenati partecipanti a una corsa da 30 minuti al 75% del VO2max. Soggetti e integrazione Materiali e metodi Si è trattato di uno studio in doppio cieco, controllato con placebo. Sessanta uomini giovani, sani e non allenati, hanno preso parte allo studio. Tutti i soggetti che hanno preso parte allo studio hanno ricevuto l approvazione da parte del Comitato consultivo dell Università di Guilan. Lo studio è stato condotto in accordo ai principi della dichiarazione di Helsinki. Tutti i partecipanti sono stati informati a voce e per iscritto Vol No. 2 MEDICINA DELLO SORT 189

4 BOHLOOLI INfLuENCE Of VITAMIN C Table I. Subjects characteristics in vitamin C () and placebo () groups. Values for each group represent means (SEM) (N.=8). Tabella I. Caratteristiche dei soggetti nel gruppo con vitamina C () e nel gruppo placebo (). I valori per ciascun gruppo rappresentano le medie (ESM) (N.=8). Skin folds (mm) Vo2max (ml.kg-1.min-1) BMI (kg.m2) Body mass (kg) Height (cm) Age (years) Group 43.9± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.6 characteristics and skinfold measurement taken from four sites (biceps, triceps, subscapular and suprailiac) were similar in both groups (Table I). The supplementation consisted of capsule containing 500 mg of vitamin C, whereas the placebo consisted of similar capsule containing 500 mg of lactose. Capsule was administered orally 2 h before exercise. reliminary measurements The Bruce protocol was used for the VO2max test. Subjects ran on a treadmill beginning at a moderate pace; every three-min the grade and intensity was increased until exhaustion. This was performed at least two weeks before the main trial.22 Experimental design and procedures On the day of the test, subjects arrived at the laboratory after an overnight fast of at least 10 h. A venous blood sample was taken after subjects had been standing for at least 15-min, after which subjects consumed a light standardized meal (two boiled eggs) and a tablet of vitamin C (500 mg) or placebo (lactose) and rested for 2 h. After rest, venous blood sample was taken. following a 10-min warm-up consisting of running at 50% VO2max (5-min) and stretching (5- min), subjects ran on treadmill for 30 min at 75% VO2max. Blood samples were taken immediately, 2 and 24 h after exercise. Blood sampling and analysis Approximately 8 ml of whole-blood was withdrawn at each time point, and 3 ml of whole-blood was added to tubes containing ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA) as an anticoagulant. Two small aliquot of EDTAtreated blood were removed for determination of differential Leukocyte using Cell counter (K-1000 Sysmax, Japan). An aliquot of EDTAtreated blood (1.5 ml) was subsequently centrifuged at 3000 g for 15 min (4 C) to obtain della natura e delle richieste dello studio, hanno compilato un questionario sulla loro storia clinica e hanno fornito il loro consenso informato. I soggetti non avevano assunto nessuna integrazione di minerali/vitamina C nelle 6 settimane antecedenti lo studio. I soggetti sono stati divisi in maniera casuale e uniforme in un gruppo con integrazione di vitamina C () e in un gruppo con assunzione di placebo (). Le caratteristiche fisiche e le misurazioni delle pliche cutanee prese da quattro punti (bicipitale, tricipitale, sottoscapolare e soprailiaco) erano simili in entrambi i gruppi (Tabella I). L integrazione consisteva di una capsula contenente 500 mg di vitamina C, mentre il placebo consisteva di una capsula simile contenente 500 mg di lattosio. La capsula è stata assunta per via orale due ore prima dell esercizio. Misurazioni preliminari Il protocollo di Bruce è stato utilizzato per il test del VO2max. I soggetti hanno effettuato una corsa su un tapis roulant a passo moderato; ogni tre minuti il grado e l intensità sono stati aumentati fino alla spossatezza. Tale test è stato realizzato almeno 2 settimane prima della prova principale 22. Disegno sperimentale e procedure Il giorno del test, i soggetti sono arrivati al laboratorio dopo un digiuno notturno di almeno 10 ore. Un campione di sangue venoso è stato prelevato dopo che i soggetti erano rimasti in posizione eretta per almeno 15 minuti, dopo che i soggetti avevano consumato un leggero pasto standardizzato (due uova bollite) e una compressa di vitamina C (500 mg) o placebo (lattosio) e aver riposato per due ore. Dopo il riposo, è stato prelevato il campione di sangue venoso. Dopo 10 minuti di riscaldamento consistente di una corsa al 50% del VO2max (5 minuti) e di stretching (5 minuti), i soggetti hanno effettuato una corsa sul tapis roulant per 30 minuti al 75% del VO2max. I campioni ematici sono stati prelevati immediatamente, 2 e 24 ore dopo l esercizio. 190 MEDICINA DELLO SORT Giugno 2012

5 INfLuENCE Of VITAMIN C BOHLOOLI plasma. for sample vitamin C analysis, 0.03 ml of distilled water and 0.06 ml of 10% metaphosphoric acid (Merck, Germany) were added to 0.03 ml of plasma and vortexed in a 1.5-mL centrifuged tube for ~10 s. The suspension was placed over ice for at least 10-min and sheltered from strong light. The mixture was then centrifuged at g for 10 min at 4 C. A 0.05 ml sample of supernatant was immediately injected to HLC ( Jasco, Japan) to determine vitamin C concentration of plasma.23 Serum was obtained by allowing whole blood (~4 ml) to clot for 20-min, followed by chilled centrifugation (4 C) at 3000 g. Serum creatine kinase (CK) were determined at 37 C using commercially available methods (Roche Hittachi-911, Germany and Japan). Serum IL-6 and TAC was analyzed using a commercially available solid-phase high-sensivity ELISA (Dynex, usa). CR was measured by a nephlometric procedure (Binding, England). for MDA measurement, an aliquot portion of 0.05 ml serum was added to 0.25 ml of 0.1 M TCA and to 0.7 ml of distilled water. Then the sample was centrifuged at 4500 g for 5 min and used for HLC ( Jasco, Japan) analysis.24 Statistical analysis Results are expressed as means±sem, and <0.05 was considered statistically significant. An independent two-way analysis of variance with repeated measures was used to compare results between treatments and over time. Where significant f ratios were found, a Tukey Honest Significant Difference test was used to determine location of variance. When there were only single comparisons, a Student s t-test with Bonferroni correction for correlated data was used to determine whether any differences between treatments existed. Antioxidant markers Results Baseline resting plasma vitamin C concentrations were not different between groups (figure 1). Two hours after supplementation, plasma vitamin C significantly increased in group (<0.05). Vitamin C concentrations decreased over the course of exercise in the group but were still significantly higher immediately and 2 h after exercise (<0.05). However, 24 h after relievo e analisi dei campioni di sangue Circa 8 ml di sangue intero sono stati prelevati in ogni punto temporale e 3 ml di sangue intero sono stati aggiunti alle provette contenenti acido etilenediaminetetra-acetico (EDTA) come anticoagulante. Due piccole aliquote di sangue trattato con EDTA sono state rimosse per il conteggio differenziale dei leucociti utilizzando un contacellule (K-1000 Sysmax, Giappone). Un aliquota di sangue trattato con EDTA (1,5 ml) è stata successivamente centrifugata a 3000 g per 15 minuti (4 C) per ottenere il plasma. er l analisi della vitamina C nel campione, 0,03 ml di acqua distillata e 0,06 ml di acido metafosforico al 10% (Merck, Germania) sono stati aggiunti a 0,03 ml di plasma e sottoposti a vortice in una provetta centrifugata da 1,5 ml per ~10 s. La sospensione è stata posta su ghiaccio per almeno 10 minuti e tenuta al riparo dalla luce intensa. La miscela è stata centrifugata a g per 10 minuti a 4 C. Un campione di supernatante da 0,05 ml è stato immediatamente iniettato nell HLC (Jasco, Giappone) per determinare la concentrazione plasmatica di vitamina C 23. Il siero è stato ottenuto permettendo al sangue intero (~4 ml) di coagulare per 20 minuti, seguito dalla centrifugazione a freddo (4 C) a 3000 g. La creatinchinasi (CK) sierica è stata determinata a 37 C utilizzando metodi commercialmente disponibili (Roche Hittachi-911, Germania e Giappone). L IL-6 e la CAT sieriche sono state analizzate utilizzando un dosaggio immuno-enzimatico in fase solida (ELISA) ad alta sensibilità (Dynex, USA). La CR è stata misurata mediante una procedura nefelometrica (Binding, Inghilterra). er la misurazione dell MDA, una parte aliquota di 0,05 ml di siero è stata aggiunta a 0,25 ml di acido tricloroacetico (0,1 M) e a 0,7 ml di acqua distillata. Il campione è stato quindi centrifugato a 4500 g per 5 minuti e utilizzato per l analisi con HLC (Jasco, Giappone) 24. Analisi statistica I risultati sono espressi come medie±esm e p<0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Un analisi della varianza a due vie per misure ripetute è stata utilizzata per confrontare i risultati tra i trattamenti e nel tempo. Laddove sono stati rilevati rapporti F significativi, un test HSD di Tukey è stato utilizzato per determinare il luogo della varianza. Quando vi erano solo confronti singoli, un test t di Student con correzione di Bonferroni per i dati correlati è stato utilizzato per determinare se esistessero differenze tra i trattamenti. Vol No. 2 MEDICINA DELLO SORT 191

6 concentrations ( mol/l BOHLOOLI INfLuENCE Of VITAMIN C * -2 re E 2 24 Time (h) group * group figure 1. Vitamin C concentrations in plasma. Values represent means ± SEM (N.=8). * significantly above baseline and placebo values (<0.05). : vitamin C; : placebo; -2: baseline; E: postexercise. figura 1. Concentrazioni plasmatiche di vitamina C. I valori rappresentano medie ± ESM (N.=8). *In maniera significativa oltre il valori basali e i valori placebo (<0,05). : vitamina C; : placebo; -2: baseline; E: postesercizio. the exercise, plasma vitamin C concentrations were almost similar to the baseline values in both groups. Baseline resting serum TAC was not different between groups (Table II). TAC increased immediately after exercise in placebo group (>0.05) and decreased 2 and 24 hours after exercise even compared with baseline values (<0.05). In group, TAC increased after supplementation and continued to increase after exercise and after 2 h, returning to baseline values after 24 h. Neither of differences were significant between the two groups (>0.05). * Marcatori antiossidanti Risultati Le concentrazioni plasmatiche basali di vitamina C a riposo non erano diverse tra i gruppi (Figura 1). Due ore dopo l integrazione, la vitamina C nel plasma è aumentata in maniera significativa nel gruppo (<0,05). Le concentrazioni di vitamina C sono diminuite nel corso dell esercizio nel gruppo ma erano ancora significativamente più elevate immediatamente e due ore dopo l esercizio (<0,05). Tuttavia, 24 h dopo l esercizio, le concentrazioni plasmatiche di vitamina C erano quasi simili ai valori basali in entrambi i gruppi. La CAT sierica basale a riposo non era diversa tra i gruppi (Tabella II). La CAT è aumentata immediatamente dopo l esercizio nel gruppo placebo (>0,05) ed è diminuita 2 e 24 ore dopo l esercizio quando confrontata con i valori basali (<0,05). Nel gruppo, la CAT è aumentata dopo l integrazione e ha continuato ad aumentare dopo l esercizio e dopo due ore, tornando ai valori basali dopo 24 ore. Nessuna delle differenze era significativa tra i due gruppi (>0,05). Marcatori di perossidazione lipidica e danno muscolare La malondialdeide sierica (MDA) è mostrata nella Tabella II. Le concentrazioni sieriche di MDA sono aumentate due ore dopo l esercizio solo nel gruppo placebo (<0,05). Non sono state rilevate differenze significative tra i gruppi per l MDA nel corso dell esercizio (<0,05). La creatinchinasi (CK) sierica è mostrata nella Figura 2. La CK è aumentata oltre i valori basali dopo l esercizio Table II. TAC, MDA, CR and blood leukocyte subpopulations. Tabella II. CAT, MDA, CR e sottopopolazioni di leucociti ematici. Variable TAC (u/ml) MDA (nmol/ml) WBC (µl) Neutrophils (/µl) Lymphocytes (µl) CR (mg/dl) Groups Baseline (-2) 10± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.10 re-exercise 11.21± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.26 Time ost-exercise 11.4± ± ± ± ± ±554* 5161±658* 4825± ± ± ± 0.26* 2.76±0.33* 2h 8.5± ± ±0.08* 1.48± ±864* 9913±755* 8267±751* 7483± ± ± ± ±0.23* 24 h 8.2± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± MEDICINA DELLO SORT Giugno 2012

7 CK activity (U/l IL-6 (pg/ml INfLuENCE Of VITAMIN C BOHLOOLI # * * 3 * 2.5 * re E re E 2 24 Time (h) Time (h) group group group group figure 2. Serum CK before and after exercise. Values represent means ± SEM (N.=8). *Values in placebo and vitamin C groups above pre-exercise (<0.05). # Values in placebo group above pre-exercise (<0.05). : vitamin C; : placebo; -2: baseline; E: post-exercise. figura 2. CK sierica prima e dopo l esercizio. I valori rappresentano medie±esm (N.=8). *Valori nel gruppo placebo e nel gruppo con integrazione di vitamina C superiori a quelli precedenti l esercizio (<0,05). #Valori nel gruppo placebo superiori a quelli precedenti l esercizio (<0,05). : vitamina C; : placebo; -2: baseline; E: post-esercizio. figure 3. Serum IL-6 concentrations. Values represent means ± SEM (N.=8). *Values in placebo and vitamin C groups above baseline and pre-exercise (<0.05). : vitamin C; : placebo; -2: baseline; E: post-exercise. figura 3. Concentrazioni di IL-6 sierica. I valori rappresentano medie±esm (N.=8). *Valori nel gruppo placebo e nel gruppo con integrazione di vitamina C superiori a quelli basali e a quelli precedenti l esercizio (<0,05). : vitamina C; : placebo; -2: baseline; E: post-esercizio. Markers of lipid peroxidation and muscle damage Serum malondealdehyde (MDA) is shown in Table II. Serum concentrations of MDA increased 2 h after exercise only in placebo group (<0.05). There were not significant differences between groups for MDA over the course of exercise (<0.05). Serum creatine kinase (CK) is shown in figure 2. CK increased above baseline values after exercise in both groups. The increase of CK was significant immediately and 2 h after exercise in both groups as well as 24 h after exercise only in placebo group (<0.05). There were no differences between groups for CK over the course of the experiment (>0.05). Markers of inflammation and IL-6 The effect of participation in the 30-min exercise at 75% VO2max on circulating total leukocytes, neutrophils and lymphocytes counts, as well as CR concentrations are shown in Table II. Total leukocytes and neutrophils counts, as well as CR concentrations were significantly increased in both groups after exercise, returning to pre-exercise values 24 h later (<0.05). There were no significant differences for lym- in entrambi i gruppi. L aumento di CK era significativo immediatamente e 2 ore dopo l esercizio in entrambi i gruppi e 24 ore dopo l esercizio solo nel gruppo placebo (<0,05). Non sono state rilevate differenze tra i gruppi per la CK nel corso dell esperimento (>0,05). Marcatori infiammatori e IL-6 Gli effetti della partecipazione all esercizio da 30 minuti al 75% del VO2max sulle conte di leucociti, neutrofili e linfociti totali circolanti, oltre che sulle concentrazioni di CR sono mostrati nella Tabella II. Le conte di neutrofili e leucociti totali, oltre che le concentrazioni di CR, erano aumentate in maniera significativa in entrambi i gruppi dopo l esercizio ritornando ai valori precedenti all esercizio 24 ore dopo (<0,05). Non sono state rilevate differenze significative per i linfociti in entrambi i gruppi dopo l esercizio rispetto a prima dell esercizio (>0,05). Non sono state rilevate differenze tra i gruppi per le conte di linfociti, neutrofili e leucociti totali, oltre che per la CR, nel corso dell esperimento (>0,05). L IL-6 sierica è mostrata nella Figura 3. In entrambi i gruppi, le concentrazioni di IL-6 sono aumentate dopo l esercizio (<0,05) e sono diminuite fino a quasi i livelli precedenti l esercizio 24 ore dopo l eserci- Vol No. 2 MEDICINA DELLO SORT 193

8 BOHLOOLI INfLuENCE Of VITAMIN C phocytes in both groups after exercise compared to pre-exercise (>0.05). There were no differences between groups for total leukocytes, neutrophils and lymphocytes counts as well as CR over the course of the experiment (>0.05). Serum IL-6 is shown in figure 3. IL-6 concentrations increased after exercise (<0.05) and decreased to almost pre-exercise levels 24 h after exercise in both groups. There were no detectable differences between the placebo and groups (>0.05). Discussion The main aim of this study was to investigate whether moderate dose vitamin C supplementation 2 h before exercise, would influence the lipid peroxidation, muscle damage and inflammatory responses following 30-min running at 75% VO2max. Acute supplementation of could increase plasma vitamin C levels 2 h after supplementation. Therefore, it seems that high dose and prolonged supplementation of is unnecessary and moderate acute dose vitamin C can increase vitamin C plasma concentration nearly same as prolonged 25 and high dose 19 supplementation. following acute supplementation of, total antioxidant capacity (TAC) increased in group immediately after exercise although it was not significant. Two hours after exercise TAC decreased significantly just in placebo group and continued to decrease until 24 h later showing possible effect of supplementation in group after 2 h. MDA was significantly blunted after exercise in group whereas in placebo group MDA increased significantly 2 h after exercise (Table II). The result is in agreement with our previous study 19 and Ashton 15 but not Thompson and Davidson 25, 26 and Gleeson.27, 28 The effect of vitamin C on MDA as a marker of lipid peroxidation is possibly due to fitness level or training status of our participants.29 It is possible that untrained individuals may be more responsive to antioxidant supplementation than endurance-trained athletes. Some 30, 31 but not all studies 32, 33 indicate that endurance training improves endogenous antioxidant defense system. Watson et al.34 pointed out that the plasma level of lipid soluble antioxidants in trained subjects is higher than normal untrained subjects with the same diet regimen denoting higher level of protection against lipid peroxidation zio. Non sono state osservate differenze rilevabili tra il gruppo placebo e il gruppo (>0,05). Discussione Obiettivo del presente studio è stato quello di valutare se una moderata integrazione di vitamina C due ore prima dell esercizio possa influenzare la perossidazione lipidica, il danno muscolare e le risposte infiammatorie in seguito a una corsa di 30 minuti al 75% del VO2max. L integrazione acuta di potrebbe aumentare i livelli di vitamina C nel plasma 2 ore dopo l integrazione. erciò, sembra che una dose elevata e una prolungata integrazione di sia inutile, mentre una dose moderatamente acuta di vitamina C può aumentare la concentrazione plasmatica di vitamina C per la stessa durata 25 di una dose elevata 19. In seguito a un integrazione acuta di, la capacità antiossidante totale (CAT) è aumentata nel gruppo immediatamente dopo l esercizio, sebbene non in maniera significativa. Due ore dopo l esercizio la CAT è diminuita in maniera significativa solo nel gruppo placebo ed è continuata a diminuire fino a 24 ore dopo, mostrando il possibile effetto dell integrazione della nel gruppo dopo 2 ore. L MDA era significativamente attenuata dopo l esercizio nel gruppo mentre nel gruppo placebo l MDA era aumentata in maniera significativa 2 ore dopo l esercizio (Tabella II). Il risultato è in linea con il nostro precedente studio 19 e con Ashton 15, ma non con Thompson e Davidson 25, 26 e Gleeson 27, 28. L effetto della vitamina C sull MDA come marcatore di perossidazione lipidica è probabilmente dovuto al livello di fitness o allo stato di allenamento dei nostri partecipanti 29. È possibile che soggetti non allenati siano maggiormente responsivi all integrazione di antiossidanti rispetto ad atleti allenati nella resistenza. Alcuni studi 30, 31, ma non tutti 32, 33, indicano che l allenamento della resistenza migliora il sistema endogeno di difesa antiossidante. Watson et al.34 hanno evidenziato come i soggetti allenati abbiamo un maggiore livello plasmatico di antiossidanti solubili nei lipidi rispetto ai soggetti non allenati che seguono lo stesso regime nutrizionale, indicando un maggiore livello di protezione contro la perossidazione lipidica nei soggetti allenati. Secondo questo e altri studi simili 35, un significativo aumento nel livello di MDA sierica in seguito a un esercizio intenso sarebbe attendibile in soggetti non allenati con un basso livello di capacità antiossidante rispetto ai soggetti allenati. Inoltre, l effetto attenuativo dell integrazione antiossidan- 194 MEDICINA DELLO SORT Giugno 2012

9 INfLuENCE Of VITAMIN C BOHLOOLI in trained subjects. According to this and similar studies,35 significant increase in serum MDA level following acute exercise could be expectable in untrained subjects which have low level of antioxidant capacity in compare with trained subjects. Also, the tempering effect of antioxidant supplementation on lipid peroxidation and consequently lower level of serum MDA in untrained group seems reasonable. CK, as a marker of muscle damage, increased immediately and 2 h after exercise in both groups, returning to pre-exercise values after 24 h only in group (figure 2). It seems that supplementation has been able to blunt serum CK similar to MDA. The reason for vitamin C influence on CK is probably due to inhibition of lipid peroxidation in group. According to some researches, lipid peroxidation may lead to membrane permeability and the escape of muscle constituents such as CK.4, 36 It has been proposed that antioxidant supplementation could prevent exercise induced oxidative stress and protect against both oxidative damage and inflammation.37, 38 In present study, there were not significant differences in total leukocytes, Neutrophils and lymphocytes counts as well as CR concentrations between groups. Depending on the protocol of exercise, the degree of increase in serum IL-6 is different. After marathon races, serum level of IL-6 increases more than 100 times 39 whereas after 30-min of downhill running at a gradient of -18% it elevated only nearly three times.28 In our study IL-6 increased nearly two times in both groups. Discrepancy in the level of the IL-6 changes are likely due to various protocols of physical exercise which induce different types of energy metabolism, mainly depending on energy expenditure, calories intake, duration and intensity of exercise.40 In the present study, vitamin C has not been able to affect IL-6. Our result was in agreement with Thompson 28 and Davidson 26 but not Thompson.41 There are several possible explanations for the lack of effect of supplementation on IL-6 plasma level in the present study. In our study, absolute change in plasma IL-6 was too low (nearly two times). The lack of any effect of vitamin C in the present study could be due to probably minimal uptake of vitamin C into leukocytes and muscle tissue, where it might be expected to modify cytokine production. Another explanation for this finding is that blood glucose levels regulate changes in IL-6 and cortisol during exercise 37 while vitamin te sulla perossidazione lipidica e il conseguente minore livello di MDA sierica nel gruppo di soggetti non allenati sembra ragionevole. La CK, quale marcatore di danno muscolare, è aumentata immediatamente e 2 ore dopo l esercizio in entrambi i gruppi, ritornando ai valori precedenti l esercizio dopo 24 ore solo nel gruppo (Figura 2). Sembra che l integrazione di sia stata in grado di attenuare la CK sierica in maniera simile all MDA. Il motivo dell effetto della vitamina C sulla CK risiede probabilmente nell inibizione della perossidazione lipidica nel gruppo. Secondo alcune ricerche, la perossidazione lipidica potrebbe favorire la permeabilità di membrana e la fuoriuscita di costituenti muscolari come la CK 4, 36. È stato suggerito che l integrazione antiossidante potrebbe prevenire lo stress ossidativo indotto dall esercizio fisico e proteggere sia dal danno ossidativo che dall infiammazione 37, 38. Nel presente studio, non sono state rilevate differenze significative tra i gruppi nelle conte di linfociti, neutrofili e leucociti totali, oltre che nelle concentrazioni di CR. A seconda del protocollo di esercizio, l entità di aumento dell IL-6 sierica è diverso. Dopo corse di maratona, il livello sierico di IL-6 aumenta più di 100 volte 39 mentre dopo 30 minuti di corsa in discesa a un grado di -18% è aumentato di sole tre volte 28. Nel nostro studio, l IL-6 è aumentata di quasi due volte in entrambi i gruppi. La discrepanza nel livello dei cambiamenti dell IL-6 è probabilmente dovuta ai diversi protocolli di esercizio fisico che inducono diversi tipi di metabolismo energetico, a seconda soprattutto del dispendio energetico, dell apporto calorico, della durata e dell intensità dell esercizio 40. Nel presente studio, la vitamina C non è stata in grado di influenzare l IL-6. I nostri risultati sono in linea con quelli di Thompson 28 e Davidson 26 ma non con quelli di Thompson 41. Vi sono numerose spiegazioni plausibili per l assenza di effetto dell integrazione della sul livello plasmatico di IL-6 nel presente studio. Nel nostro studio, un cambiamento assoluto nell IL-6 plasmatica era troppo basso (circa 2 volte). L assenza di qualsiasi effetto della vitamina C nel presente studio potrebbe essere dovuto a un minimo assorbimento della vitamina C nei leucociti e nei tessuti muscolari, dove essa dovrebbe modificare la produzione di citochine. Un altra spiegazione per questo risultato è che i livelli di glucosio ematico regolano i cambiamenti nell IL-6 e nel cortisolo durante l esercizio 37 mentre la vitamina C ha un effetto minore. Inoltre, è possibile che la vitamina C non sia in grado di modulare Vol No. 2 MEDICINA DELLO SORT 195

10 BOHLOOLI INfLuENCE Of VITAMIN C C has less effect. furthermore, it is likely that vitamin C has not been able to modulate IL-6 because the increase did not achieve some form of critical threshold level.28 Conclusions In summary, acute moderate dose vitamin C supplementation, 2 h before exercise increased plasma concentrations of vitamin C before and after exercise and affected MDA after exercise compared to placebo group. Vitamin C did not show any effect on IL-6 and inflammatory markers such as total leukocytes, neutrophils, lymphocytes and CR. As a result, moderate dose vitamin C supplementation possibly alleviated lipid peroxidation and muscle damage but not inflammatory responses after 30-min running at 75% VO2max. furthermore, because of the same influence on vitamin C concentration and possible side effects of high dose supplementation, it seems that there is no need to a higher dose intake of vitamin C before exercise. l IL-6 perché l aumento non raggiunge un livello di soglia critica 28. Conclusioni er riassumere, l integrazione di vitamina C con dose moderatamente acuta 2 ore prima dell esercizio ha aumentato le concentrazioni plasmatiche di vitamina C prima e dopo l esercizio e ha influenzato l MDA dopo l esercizio rispetto al gruppo placebo. La vitamina C non ha mostrato nessun effetto sull IL-6 e sui marcatori infiammatori come linfociti, neutrofili e leucociti totali e sulla CR. Come risultato, una moderata integrazione di vitamina C ha probabilmente attenuato la perossidazione lipidica e il danno muscolare ma non le risposte infiammatorie dopo 30 minuti di corsa al 75% del VO2max. Inoltre, a causa della stessa influenza sulla concentrazione di vitamina C e dei possibili effetti collaterali di un integrazione a dose elevata, sembra che non vi sia la necessità di assumere una dose più elevata di vitamina C prima dell esercizio. References/Bibliografia 1) rigol M, Luchese C, Nogueira CW. Antioxidant effect of diphenyl diselenide on oxidative stress caused by acute physical exercise in skeletal muscle and lungs of mice. Cell Biochem funct 2009;27: ) Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39: ) fisher-wellman K, Bloomer RJ. Acute exercise and oxidative stress: a 30 year history. Dyn Med 2009;8:1. 4) Jackson M. 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