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1 ,, Ministero dell' Istruzione, dell' Università e della Ricerca Dipartimento per l'università, l'alta Formazione Artistica, Musicale e Coreutica e per la Ricerca Direzione Generale per il Coordinamento e lo Sviluppo della Ricerca PROGRAMMI DI RICERCA SCIENTIFICA DI RILEVANTE INTERESSE NAZIONALE RICHIESTA DI COFINANZIAMENTO (D.M. 1152/ric del 27/12/2011) PROGETTO DI UNA UNITÀ DI RICERCA - MODELLO B Anno prot XZEPR_ Area Scientifico-disciplinare 05: Scienze biologiche 100% 2 - Coordinatore Scientifico BALLARIN LORIANO Professore Associato confermato Università degli Studi di PADOVA Facoltà di SCIENZE MATEMATICHE FISICHE e NATURALI Dipartimento di BIOLOGIA 3 - Responsabile dell'unità di Ricerca COLOMBO (Cognome) Primo ricercatore (Qualifica) PAOLO (Nome) 20/03/1960 (Data di nascita) CLMPLA60C20G273X (Codice fiscale) Consiglio Nazionale delle Ricerche (Università/Ente) Istituto di biomedicina e di immunologia molecolare "Alberto Monroy" (Dipartimento) (telefono) (fax) ( ) 4 - Curriculum scientifico Testo italiano -I Ricercatore a tempo indeterminato, II livello, presso l' Istituto di Biomedicina e di Immunologia Molecolare del CNR di Palermo dal 01/01/2007 ad oggi -Ricercatore a tempo indeterminato III livello presso l' Istituto di Biomedicina e di Immunologia Molecolare del CNR di Palermo dal 16/02/1998 al 31/12/2006 -Ricercatore III livello a contratto a norma dell'art.23 del D.P.R. 171/91 presso l'istituto di Biologia dello Sviluppo del CNR di Palermo dal 01/12/1994 al 31/05/1998 -Borsa di studio e di formazione del Consiglio Nazionale delle Ricerche (biennale), bando n del 31 /12/88 codice n , dal 01/01/1990 al 31/12/1991 -EMBO Short Term Fellowship presso il laboratorio del Dr. Michael Fried, Imperial Cancer Research Fund, Londra, Regno Unito, periodo di attività dal 01/01/1994 al 01/02/1994 -Assegno di ricerca finalizzata dell'assessorato Regionale alla Sanità della Regione Siciliana dal 01/10/1992 al 01/04/1993 -Incarico per prestazione d'opera presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo dell'università degli Studi di Palermo, 01/06/1992 al 30/18/1992 -Borsa di studio e di formazione del Consiglio Nazionale delle Ricerche (biennale), bando n del 31 /12/88 codice n , presso l'istituto di Biologia dello Sviluppo del CNR di Palermo periodo di attività dal 01/01/1990 al 31/12/1991 -Visiting Scientist presso l' Eukaryotic Gene Organization and Expression Laboratory dell'imperial Cancer Research Fund di Londra sotto la super visione del Dott. Michael Fried periodo di attività dal 01/10/1989 al 01/10/1992 -Assegno di ricerca finalizzata dell'assessorato alla Sanità della Regione Siciliana, dal 28/05/1987 al 28/05/1989 Professore a contratto presso l'università degli Studi di Palermo, Corso di Laurea in Scienze Biologiche dal 2005 al 2009 Testo inglese EDUCATION *1984 Degree in Bioligical Science, University of Palermo PROFESSIONAL EXPERIENCE * Regional Health Organization, Long term fellowship, Istituto di Biologia dello Sviluppo, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Palermo, Italy. * Long term fellowship, Istituto di Biologia dello Sviluppo, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Palermo, Italy * Visiting Scientist, Imperial Cancer Research Fund, London, UK; *1994 EMBO Short Term Fellowship, Imperial Cancer Research Fund, London, UK;

2 * Researcher, Istituto di Biomedicina e di Immunologia Molecolare, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Palermo, Italy; *2007-today Senior Researcher, Istituto di Biomedicina e di Immunologia Molecolare, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Palermo, Italy. TEACHING ACTIVITY * Invited Professor, Università degli Studi di Palermo, Biological Science 5 - Pubblicazioni scientifiche più significative del Responsabile dell'unità di Ricerca 1. Angela Bonura, Rosa Passantino, Maria Assunta Costa, Giovanna Montana, Mario Melis, M.Luisa Bondì, Cinzia Butteroni, Bianca Barletta, Silvia Corinti, Gabriella Di Felice, COLOMBO P. (2012). Characterization of a Par j 1/Par j 2 mutant hybrid with reduced allergenicity for immunotherapy of Parietaria allergy. CLINICAL AND EXPERIMENTAL ALLERGY, vol. 42; p , ISSN: A. Bonura, COLOMBO P. (2011). Novel strategies for the development of a vaccine for Parietaria allergy. INTERNATIONAL JOURNAL OF IMMUNOPATHOLOGY AND PHARMACOLOGY, ISSN: Angela Bonura, Daniela Giacomazza, Silvia Corinti, Gabriella Di Felice, Fabrizio Gianguzza, COLOMBO P. (2011). FATTORE ANTI-LPS DA PARIETARIA JUDAICA. In: Atti del I Convegno nazionale Sostanze naturali: dalla ricerca di base all'applicazione clinica, ISBN/ISSN: Maria Luisa Bondì, Giovanna Montana, Emanuela Fabiola Craparo, Roberto Di Gesù, Gaetano Giammona, Angela Bonura, COLOMBO P. (2011). Lipid nanoparticles as delivery vehicles for the Parietaria judaica major allergen Par j 2. INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE, ISSN: Angela Bonura, Aiti Vizzini, Giuseppina Salerno, Daniela Parrinello, Nicolò Parrinello, Valeria Longo, Giovanna Montana, COLOMBO P. (2010). Cloning and expression of a novel component of the CAP superfamily enhanced in the inflammatory response to LPS of the ascidian Ciona intestinalis. CELL AND TISSUE RESEARCH, ISSN: X 6. MARIA ANTONIETTA CIARDIELLO, PAOLA PALAZZO, MARIA LIVIA BERNARDI, IVANA GIANGRIECO, VALERIA LONGO, MARIO MELIS, MAURIZIO TAMBURRINI, DANILA ZENNARO, COLOMBO P. (2010). Biochemical, immunological and clinical characterization of a cross-reactive non-specific lipid transfer protein 1 from MULBERRY. ALLERGY, vol. 65; p , ISSN: ANGELA BONURA, AITI VIZZINI, GIUSEPPINA SALERNO, NICOLÒ PARRINELLO, VALERIA LONGO, COLOMBO P. (2009). Isolation and Expression of a novel MBL-Like Collectin cdna enhanced by LPS injection in the body wall of the ascidian Ciona Intestinalis. MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 46; p , ISSN: COLOMBO P. (2009). ANTI-LPS FACTOR FROM PARIETARIA JUDAICA AND METHODS OF USE THEREOF. C07K14/ COLOMBO P. (2009). Genetic engineering of allergenes for Immunotherapy. INFLAMMATION & ALLERGY - DRUG TARGETS, vol. 8; p , ISSN: COLOMBO P., SILVIA CORINTI, CINZIA BUTTERONI, CLAUDIA AFFERNI, ANGELA BONURA, MONICA BOIRIVANT, PAOLO COLOMBO, AND GABRIELLA DI FELICE (2009). Effects of live and inactivated VSL#3 probiotic preparations in the modulation of in vitro and in vivo allergen-induced Th2 responses. INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, vol. 150; p , ISSN: BONURA A, GULINO L, TRAPANI A, DI FELICE G, TINGHINO R, AMOROSO S, GERACI D, VALENTA R, WESTRITSCHNIG K, SCALA E, COLOMBO P. (2008). ISOLATION, EXPRESSION AND IMMUNOLOGICAL CHARACTERIZATION OF A CALCIUM BINDING PROTEIN FROM PARIETARIA POLLEN. MOLECULAR IMMUNOLOGY, vol. 45(9); p , ISSN: BONURA A, CORINTI S, ARTALE A, DI FELICE G, AMOROSO S, MELIS M, COLOMBO P. (2007). A HYBRID EXPRESSING GENETICALLY ENGINEERED MAJOR ALLERGENS OF THE PARIETARIA POLLEN AS A TOOL FOR SPECIFIC ALLERGY VACCINATION. INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, vol. 142; p , ISSN: NASTA FRANCESCA, CORINTI SILVIA, BONURA ANGELA, COLOMBO P., DI FELICE GABRIELLA AND PIOLI CLAUDIO (2007). CTLA-4 REGULATES ALLERGEN RESPONSE BY MODULATING GATA-3 PROTEIN LEVEL/CELL. IMMUNOLOGY, vol. 121(1); p , ISSN: A. BONURA, A. ARTALE, M. MARINO, S. AMOROSO, F. MARCUCCI, D.GERACI, COLOMBO P. (2006). CROSS-REACTIVITY BETWEEN PARIETARIA SPECIES USING THE MAJOR RPARJ1 AND RPARJ2 ALLERGENS. ALLERGY AND ASTHMA PROCEEDINGS, vol. 5; p , ISSN: BOUSQUET J, ANTO JM, BACHERT C, BOUSQUET PJ, COLOMBO P., CRAMERI R, DAERON M, FOKKENS W, LEYNAERT B, LAHOZ C, MAURER M, PASSALACQUA G, VALENTA R, VAN HAGE M, VAN REE R (2006). FACTORS RESPONSIBLE FOR DIFFERENCES BETWEEN ASYMPTOMATIC SUBJECTS AND PATIENTS PRESENTING AN IGE SENSITIZATION TO ALLERGENS. A GALEN PROJECT. ALLERGY, vol. 61(6); p , ISSN: VINCENZO IZZO, MARIA A COSTA, RENATA DI FIORE, GIOVANNI DURO, DANIELE BELLAVIA, ELEONORA CASCONE, COLOMBO P., MARIA C GIOVIALE AND RAINER BARBIERI (2006). ELECTROPHORESIS OF PROTEINS AND DNA ON HORIZONTAL SODIUM DODECYL SULFATE POLYACRYLAMIDE GELS. IMMUNITY & AGEING, vol. 12; p. 3-7, ISSN: COLOMBO P., GERACI D, BONURA A (2005). Fusion proteins comprising modified allergens of the ns-ltp family, use thereof and pharmaceutical compositions comprising the same;. PCT/IB2005/ ALESSIA ORLANDI, FELICIA GRASSO, SILVIA CORINTI, MARIAROSARIA MARINARO, ANGELA BONURA, MONICA BOIRIVANT, COLOMBO P., GABRIELLA DI FELICE (2004). THE RECOMBINANT MAJOR ALLERGEN OF PARIETARIA JUDAICA AND ITS HYPOALLERGENIC VARIANT: IN VIVO EVALUATION IN A MURINE MODEL OF ALLERGIC SENSITISATION. CLINICAL AND EXPERIMENTAL ALLERGY, vol. 34 (3); p. 470, ISSN: ANGELA AMORESANO, PIERO PUCCI, GIOVANNI DURO, COLOMBO P., MARIA A. COSTA, VINCENZO IZZO, DORIANO LAMBA AND DOMENICO GERACI (2003). ASSIGNMENT OF DISULPHIDE BRIDGES IN PARJ A MAJOR ALLERGEN OF PARIETARIA JUDAICA POLLEN. BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 384 (8); p , ISSN: COLOMBO P., ANGELA BONURA, MARIA ASSUNTA COSTA, VINCENZO IZZO, ROSA PASSANTINO, SAVERIO AMOROSO, DOMENICO GERACI (2003). THE ALLERGENS OF PARIETARIA. INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, vol. 130 (3); p , ISSN: STUMWALL S, WESTRITSCHNIG K, LIDHOLM J, SPITZAUER S, COLOMBO P., DURO G, KRAFT D, GERACI D AND VALENTA R (2003). IDENTIFICATION OF CROSS-REACTIVE AND GENUINE PARIETARIA JUDAICA POLLEN ALLERGENS. JOURNAL OF ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 111 (5); p , ISSN: BONURA A, AMOROSO S, LOCOROTONDO G, DI FELICE G, TINGHINO R, COLOMBO P. (2001). HYPOALLERGENIC VARIANTS OF THE PARIETARIA JUDAICA MAJOR ALLERGEN PAR J 1: A MEMBER OF THE NSLTP PLANT FAMILY. INTERNATIONAL ARCHIVES OF ALLERGY AND IMMUNOLOGY, vol. 126; p , ISSN: COSTA M.A, DURO G, IZZO V, COLOMBO P., MIRISOLA M.G, LOCOROTONDO G, COCCHIARA R. AND GERACI D (2000). THE IGE-BINDING EPITOPE OF THE RPAR J , A MAJOR ALLERGEN OF THE PARIETARIA JUDAICA POLLEN, ARE HETEROGENEOUSLY RECOGNIZED AMONG ALLERGIC SUBJECT. ALLERGY, vol. 55; p , ISSN: DE PALMA R, WU S, SALLUSTO F, DI FELICE G, MARTUCCI P, GERACI D, COLOMBO P., TROISE C, SACERDOTI G, NOCERA A. AND GORSKI J (1999). USE OF ANTAGONIST PEPTIDES TO INHIBIT IN VITRO T CELL RESPONSES TO PAR JI, THE MAJOR ALLERGEN OF PARIETARIA JUDAICA POLLEN. JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 162; p , ISSN: COLOMBO P., DURO G, COSTA M.A, IZZO V, MIRISOLA M.G, LOCOROTONDO G, COCCHIARA R, GERACI D (1998). PARIETARIA POLLEN ALLERGENS. ALLERGY, vol. 53; p , ISSN: COLOMBO P., KENNEDY D, RAMSDALE T, COSTA M.A, DURO G, IZZO V, SALVADORI S, GUERRINI S, COCCHIARA R, MIRISOLA M.G, WOOD S, GERACI D (1998). IDENTIFICATION OF AN IMMUNODOMINANT IGE EPITOPE OF THE PARIETARIA JUDAICA MAJOR ALLERGEN. JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 160 (6); p , ISSN: COLOMBO P., READ M. AND FRIED M (1996). The human L35a ribosomal protein (rpl35a) gene is located at chromosome band 3q29-qter. GENOMICS, vol. 32; p , ISSN:

3 28. COLOMBO P., J.YON, K.GARSON AND M.FRIED (1992). Conservation of the organization of five tightly clustered genes of the surfeit locus over 600 hundred million years of divergent evolution. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 89; p , ISSN: COLOMBO P., F. DI BLASI, S. MAGRIN, C. FABIANO, V, DI MARCO, L.D'AMELIO, F. LOJACONO, G. SPINELLI, A. CRAXI' (1991). Smouldering hepatitis B virus replication in patients with chronic liver disease and hepatitis delta virus superinfection. JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 1; p , ISSN: S.MAGRIN, A.CRAXI', C.CARINI, COLOMBO P., F.DIBLASI, G.SPINELLI, C.FRATAZZI, M.C.MESSINA, G.ANTONELLI, C.AUSIELLO, F.DIANZANI, L.PAGLIARO (1989). Interleukin-2, interleukin-2 receptors and gamma-interferon synthesis by peripheral blood mononuclear cells in chronic hepatitis delta virus infection. JOURNAL OF HEPATOLOGY, vol. 8; p , ISSN: Abstract dei compiti svolti dall'unità di Ricerca Testo italiano Lo studio del sistema immunitario degli invertebrati marini è di particolare interesse in quanto, essendo privi della immunità adattativa, hanno sviluppato e mantenuto durante le loro fasi evolutive sistemi di controllo delle infezioni da microrganismi particolarmente efficienti. In particolare, il Protocordato Ciona intestinalis è una specie che, per la sua posizione filogenetica, rappresenta un sistema ideale: 1) per la comprensione dei meccanismi funzionali del sistema immunitario innato; 2) per gli studi relativi all'origine del sistema immunitario dei vertebrati; 3)per la caratterizzazione di peptidi ad attività antimicrobica. Il progetto di ricerca che questa Unità Operativa intende sviluppare si riferisce all'identificazione di geni differenzialmente espressi in Ciona intestinalis dopo induzione di una risposta infiammatoria indotta da LPS batterico. Dati già pubblicati dal nostro gruppo di ricerca hanno dimostrato l'attivazione di geni dell'immunità innata dopo inoculo di LPS nella parete corporea. In questo progetto di ricerca si presterà particolare attenzione all'isolamento di molecole indotte nella fase precoce della risposta immunitaria alle endotossine batteriche con particolare riferimento ai peptidi ad attività antimicrobica. I peptidi antimicrobici (AMP) sono molecole largamente diffuse in natura, sintetizzate da organismi appartenenti sia al regno vegetale che animale. Essi sono tipici componenti del sistema innato e rappresentano la prima linea di difesa contro molti patogeni. Questa classe di molecole è nota nel mondo scientifico da almeno due decadi e negli ultimi anni è diventata argomento di notevole interesse in quanto gli AMP rappresentano delle nuove possibili formulazioni terapeutiche in grado di sopperire alla sempre maggiore diffusione di microrganismi patogeni resistenti ai comuni antibiotici utilizzati sia in campo umano che veterinario. Ad oggi più di 1300 di queste sostanze sono state isolate da una serie di organismi filogeneticamente lontani, quali mammiferi, pesci, anfibi e insetti con un ampio spettro di attività contro virus, batteri, funghi e protozoi patogeni. Questa Unità di ricerca si propone di combinare le conoscenze di biologia cellulare relative alla risposta infiammatoria in Ciona intestinalis con la tecnologia dell'analisi di differenza di rappresentatività per l'isolamento e la caratterizzazione di geni dell'immunità innata indotti da endotossine. In particolare ci si propone di identificare, mediante una tecnica low throughput screening (LTS), geni attivati dall'inoculo di LPS batterico nella parete corporea dell'animale versus animali non trattati. I geni differenziamenti espressi saranno in seguito clonati all'interno di vettori di espressione e caratterizzati per la loro capacità di inibire la crescita batterica. Tale analisi sarà condotta in stretta collaborazione con l'unità UNIPA (gene profiling e localizzazione tissutale). Inoltre le caratteristiche biologiche di tali peptidi saranno studiate in collaborazione con le Unità UNIVT (valutazione degli effetti funzionali nei mammiferi), UNILE (analisi microbiologiche). Infine saranno sviluppate interazioni con le Unità UNIMORE (confronto con Drosophila melanogaster), UNIPD (analisi di EST da Botryllus) per la ricerca di omologhi in altri sistemi biologici. Testo inglese The innate immune system is the first line of defence capable of recognizing foreign agents killing a large set of pathogens through a variety of inducible cellular and humoral effectors mechanisms. Ascidians (subphylum Tunicata) are chordate invertebrates, closely related to vertebrate which represent an intriguing biological system from the viewpoint of: 1)the evolution of the innate immune system; 2)the understanding of the mechanisms behind the immune response to exogenous agents; 3)the characterization of novel peptides with antimicrobial activity. Novel therapeutic strategies are urgently needed for the treatment of serious diseases caused by viral, bacterial and parasitic infections, because currently used drugs are facing the problem of rapidly emerging resistance. There is also an urgent need for agents that act on novel pathogen-specific targets, in order to expand the repertoire of possible therapies. Antimicrobial peptides (AMPs) are small molecular weight proteins with broad spectrum antimicrobial activity against bacteria, viruses, and fungi. So far about 1300 AMPs have been isolated from different species from plant to invertebrate and vertebrate animals. Acting on microorganism membrane or having intracellular targets, they can also act as effectors of the innate immune response resulting on non-specific mechanisms of action. From this point of view, invertebrate animals represent a relevant source of natural antibiotics since they certainly survive in a microbe-laden environment strongly suggesting that these animals possess a very robust innate immune system. The aim of this Unit is the identification of genes differentially expressed in C. intestinalis after injection with bacterial LPS. Recently published data from our group have shown the activation of several genes of the innate immunity a few hours after injection. The general aim is to combine our background about inflammation in C. intestinalis with a subtractive hybridization strategy focusing our attention on the isolation and characterization of peptides with antimicrobial activity. A specific strategy has been already developed in our laboratories. These analyses will be performed in tight collaboration with Unit UNIPA (gene profiling and in situ hybridization). In addition, the biological activity of these genes with be further studied in collaboration with Unit UNIVT (effects on mammalian cells) and Unit UNILE (Microbiological Analysis). Finally, a search for homologous genes will be performed in collaboration with the Unit UNIMORE (Drosophila melanogaster) and Unit UNIPD (EST analysis from Botryllus). 7 - Settori di ricerca ERC (European Research Council) LS Life Sciences LS6 Immunity and infection: immunobiology, aetiology of immune disorders, microbiology, virology, parasitology, global and other infectious diseases, population dynamics of infectious diseases, veterinary medicine LS6_1 Innate immunity LS7 Diagnostic tools, therapies and public health: aetiology, diagnosis and treatment of disease, public health, epidemiology, pharmacology, clinical medicine, regenerative medicine, medical ethics LS7_3 Pharmacology, pharmacogenomics, drug discovery and design, drug therapy

4 8 - Collaborazioni con altri organismi di ricerca pubblici e privati, nazionali e internazionali, e indicazione degli eventuali collegamenti con gli obiettivi di Horizon 2020 Testo italiano Testo inglese 9 - Parole chiave Testo italiano CIONA INTESTINALIS IMMUNITÀ INNATA PEPTIDI ANTIMICROBICI Testo inglese CIONA INTESTINALIS INNATE IMMUNITY ANTIMICROBIAL PEPTIDES 10 - Stato dell'arte Testo italiano La risposta immunitaria innata rappresenta la prima linea di difesa di tutti gli organismi animali e vegetali. Inoltre il sistema innato è chiamato in causa anche in numerosi processi fisiologici come, ad esempio il rimodellamento tissutale e le fasi dello sviluppo embrionale. Tutto ciò grazie alla capacità delle cellule del sistema innato di riconoscere segnali di danno cellulare sia in assenza che in presenza di patogeni come suggerito dal modello proposto da Matzinger (Seung-Yong and Matzinger, 2004). Secondo questo modello, le cellule sono in grado di riconoscere, mediante opportuni sensori, porzioni idrofobiche di molecole derivanti da infezioni esterne o da processi degradativi cellulari. Ciò attiva una cascata di eventi cellulari che ha come finalità quella di indurre numerose classi di proteine come le collectine, le proteine del complemento, fattori di coagulazione, ecc. in grado di eliminare l'agente estraneo. In natura, tale meccanismo di difesa è solitamente attivato da una serie di molecole in grado di riconoscere alcune componenti delle membrane batteriche e/o virali. Un esempio di molecola immunostimolatoria è rappresentato dal lipopolisaccaride batterico (LPS), una delle molecole costituenti la membrana esterna dei batteri Gram-negativi, che è in grado di attivare una potente risposta immunitaria sia negli organismi invertebrati che nei vertebrati. Nei mammiferi, ad esempio, la risposta è mediata dal recettore Toll-like 4 (TLR-4) il quale riconosce in modo specifico tale molecola attivando una cascata di eventi intracellulari che culmina con la fosforilazione del fattore di trascrizione NF- B, il quale induce la trascrizione di una serie di importanti mediatori della risposta immunitaria innata. Simili meccanismi sono stati descritti negli invertebrati. Lo studio del sistema immunitario di questi ultimi organismi è di interesse in quanto, essendo privi della immunità adattativa, hanno sviluppato e mantenuto durante le loro fasi evolutive sistemi di controllo delle infezioni da microrganismi particolarmente efficienti. Negli ultimi anni la struttura molecolare e la funzione di numerose componenti del sistema innato sono state identificate soprattutto negli Artropodi e nei Protocordati. Questi fattori comprendono elementi quali peptidi ad attività antimicrobica, inibitori delle proteasi, fattori del complemento, lectine ed altri fattori umorali solitamente localizzati all'interno dell'emolinfa e degli emociti (vedi (Iwanaga and Lee, 2005) per una review sull'argomento). In particolare, i Tunicati della specie Ciona intestinalis rappresentano un sistema di particolare rilevanza in quanto, per la loro posizione filogenetica, sono considerati organismi modello per gli studi di evoluzione del sistema immunitario. Come tutti gli invertebrati finora studiati, i tunicati mostrano immunità cellulo-mediata e umorale (Parrinello, 1996; Parrinello et al., 2007; Parrinello et al., 2003; Parrinello et al., 1984a; Parrinello et al., 1984b). Inoltre, più recentemente, è stato osservato che l'inoculo di LPS nella tunica di Ciona induce l'attivazione di numerose componenti come, ad esempio, la produzione di molecole IL1-like e TNF-like (Parrinello et al., 2007; Parrinello et al., 2008), l'attivazione di collectine (Bonura et al., 2009), l'attivazione di componenti della famiglia delle CAP protein (Bonura et al., 2010) e l'attivazione del sistema propo (Cammarata et al., 2008), geni notoriamente coinvolti nella risposta infiammatoria. Inoltre, la conoscenza della sequenza del genoma di C.intestinalis ha permesso di osservare che tale specie non contiene omologhi delle famiglie di AMP già isolati in altri sistemi biologici o all'interno della stessa famiglia dei Tunicati. Di contro, la presenza di attività antibatteriche negli emociti di Ciona è nota in letteratura da molti anni (Smith and Davidson, 1992). Solo recentemente sono stati pubblicati dei lavori che hanno evidenziato la caratterizzazione molecolare di una nuova classe di peptidi antimicrobici in C.intestinalis (Fedders and Leippe, 2008; Fedders et al., 2008 ; Fedders et al., 2010). La progressiva e rapida comparsa di microorganismi resistenti agli antibiotici attualmente in uso ha stimolato la ricerca di nuove molecole dotate di migliore efficacia terapeutica e, possibilmente, con un meccanismo d'azione diverso da quelli degli antibiotici oggi in commercio. Gli antibiotici comunemente utilizzati intervengono principalmente nella duplicazione del DNA, nella trascrizione, nella sintesi proteica e nell'assemblaggio dei componenti della parete batterica. Ciò ha permesso ai microrganismi di modificare questi bersagli, evolvendo meccanismi che li ha resi resistenti all'azione degli antibiotici. Uno degli approcci che può essere utilizzato per risolvere questo problema di Sanità pubblica è quello della ricerca di molecole naturali normalmente prodotte dagli organismi pluricellulari per difendersi dalle infezioni da microrganismi. Tra le molecole che sono state indicate come potenziali antibiotici innovativi vi sono i così detti peptidi antimicrobici (AMP) dell'immunità innata. Questi sono ampiamente diffusi tra tutti gli organismi viventi e noti alla comunità scientifica oramai da più di venti anni. Essi sono in grado di permeabilizzare le membrane batteriche ricche di fosfolipidi anionici svolgendo una attività antimicrobica diretta. In altri casi sono state identificate sequenze proteiche le quali sembrano agire con un meccanismo di tipo non litico. Negli ultimi anni, è stata associata a questa attività antibiotica diretta, anche una potente capacità immunomodulatoria per la quale tali peptidi sono in grado di contribuire al contrasto delle infezioni microbiche mediante meccanismi che sono indipendenti dall'uccisione diretta dei microrganismi e che hanno a che vedere con l'interazione con componenti delle membrane batteriche (ad esempio il LipoPoliSaccaride, LPS) neutralizzando il potente effetto infiammatorio indotto sulle cellule dell'ospite. I peptidi che sono in grado di neutralizzare questo tipo di processo vengono oggi definiti con un termine più ampio quale quello di Host Defense Peptide (HDP). Questa ultima classe di proteine sono di particolare interesse in quanto oltre all'attività antimicrobica diretta, sono in grado di potenziare la risposta immunitaria dell'organismo, promuovendo in vitro varie risposte di difesa (ad es. migrazione di leucociti, maturazione delle cellule dendritiche) e contribuendo così al potenziamento della risposta immunitaria adattativa. La identificazione di nuove famiglie di proteine appartenenti a queste classi di peptidi rappresenta pertanto una interessante strategia di intervento per lo sviluppo di nuovi farmaci. Testo inglese The innate immune system is the first defence level which enable the organisms to recognize foreign agents and destroy bacterial, fungal and viral pathogens through a variety of inducible effectors mechanisms. This immunological response is activated by cellular receptors which are able to sense components of the membrane cell wall. This level of immunity emerged early in the evolution, and the invertebrates have developed several defence responses including hemolymph coagulation, expression of antimicrobial peptides mediated by Toll-like receptors, and the lectin/complement pathway activated by bacterial cell wall components. Invertebrates, which do not possess immunoglobulins, have developed unique modalities to detect and respond to microbial surface antigens like the lipopolysaccharides (LPS), one of the major components of the membrane of the gram-bacteria. In the last two decades, the molecular structure and the function of several components of the innate immune system of Arthropods and Protochordates have been identified (see (Iwanaga and Lee, 2005) for a review). Ascidians (subphylum Tunicata) are chordate invertebrates, closely related to vertebrates, provided of innate immunity including allorecognition, inflammatory humoral and cellular responses (Parrinello, 1996; Parrinello et al., 2007; Parrinello et al., 2003; Parrinello et al., 1984a; Parrinello et al., 1984b), and a lectin-dependent complement-like system. The activation pathway includes Mannose-Binding Lectins (MBLs), MBL-Associated Serine Proteases MASPs, C3-like and corresponding CR3/CR4 receptors identified on macrophage-like cells. The inflammatory reaction in the tunic of C. intestinalis described for the first time by Parrinello and co-workers (Parrinello, 1996; Parrinello et al., 2007; Parrinello et al., 2003; Parrinello et al., 1984a; Parrinello et al., 1984b) is an intriguing model for the analysis of inducible host defence molecules. Recent reports showed that the injection of LPS induces the activation of several cellular and humoral components of the innate immune system including the enhanced expression of a type IX-like collagen (Vizzini et al., 2008), IL1-like and TNF-like molecules (Parrinello et al., 2007; Parrinello et al., 2008), components of CAP superfamily (Bonura et al., 2010), collectins (Bonura et al., 2009) and activation of the propo-system (Cammarata et al., 2008).

5 In addition, in silico analysis of the Ciona intestinalis genome sequences and the expressed sequence tag (EST) of this specie showed the absence of homologous of known antimicrobial peptide genes. On other hand, the knowledge of an antimicrobial activity in hemocytes is known since decades (Smith and Davidson, 1992). Moreover, recently published papers have shown the isolation of novel forms of AMPs from hemocytes (Fedders and Leippe, 2008; Fedders et al., 2008; Fedders et al., 2010). In conclusion, from our and published data it is clear that Tunicata represent a powerful system useful for the identification and characterization of peptides with antimicrobial activity. The availability of antibiotics has had profound effects on human health and has contributed to an increase in the average human lifespan. The availability of antibiotics has allowed for the successful treatment of many bacterial infections as well as the ability to perform invasive medical procedures including surgery and chemotherapy. Commercially available antibiotics usually interfere with the duplication of DNA, in the formation of the transcription machinery, protein synthesis and formation of the cell wall. However, many bacterial strains have evolved ways to adapt or become resistant to the currently available antibiotics. The emergence of antibiotic-resistant bacteria causes serious public health problems. Infections with these resistant bacteria occur primarily in hospitals and lead to the death of thousands of patients every year. One possible approach to tackle the problem of resistance to current antibiotics is to look to evolutionary ancient natural antibiotics. All multicellular organisms have evolved some of them without the protection of antibodies or immune effector cells. All organisms possess a variety of broad-spectrum antibiotics known as antimicrobial peptides (AMP). Microbial pathogens don't seem to acquire resistance to these peptides even though they have often been exposed to them for a very long time. Approximately 20 years ago, it was discovered that the skin of frogs, the lymph of insects, and human neutrophils all contain cationic peptides that can act as potent antimicrobials. To date more than 1300 AMP have been discovered in virtually all organisms from microbe to man. These peptides have a broad spectrum of antimicrobial activity, including activity against bacteria, eukaryotic parasites, viruses, and fungi. Antimicrobial peptides vary considerably in sequence and structure, with a few common features like the presence of specific aminoacids, and overall, a positive net charge. For these reasons they have also been named cationic peptides. Cationic peptides are usually encoded as larger precursors with signal sequences that are subsequently modified by cleavage or group addition reactions. They range in size from amino acids. Cationic peptides are amphipathic allowing them to possess both a hydrophobic region that interacts with lipids and a positively charged hydrophilic region that interacts with water or negatively charged residues. In fact, one of the hypothesized mechanism of function is that they interact with membranes that are composed of amphipathic molecules, especially negatively charged bacterial membranes leading to the formation of pores on the membrane leading to lysis of the micro-organism. Cationic peptides not only directly kill bacteria, they also have profound effects on the host system. It has been shown that cationic peptides can function to sequester LipoPolySaccaride (LPS), one of the major component of the cell wall from Gram negative bacteria. LPS is a strong inducer of the immune system inducing the production of several pro-inflammatory cytokines (i.e. IFN-a;, TNF-a;, ecc). Its presence in the blood can be dangerous leading to life-threading reactions like sepsis. AMPs can work as potent LPS binding proteins reducing the effect of its presence on the immune system. For these reasons, antimicrobial peptides have also been named with a broad term as Host Defence Peptide. In addition, cationic peptides have also been found to be potent chemo-attractants, recruiting antigen-presenting cells, which can initiate responses by the adaptive immune system and mast cells which are known to increase blood vessel permeability in order to allow other immune effectors and wound healing factors to permeate injured tissues. The identification of such factors represents an interesting strategy for the development of new drugs Riferimenti bibliografici Bibliografia Reference Bonura A., Vizzini A., Salerno G., Parrinello D., Parrinello N., Longo V., Montana G. and Colombo P. (2010) Cloning and expression of a novel component of the CAP superfamily enhanced in the inflammatory response to LPS of the ascidian Ciona intestinalis. Cell Tissue Res 342, Bonura A., Vizzini A., Salerno G., Parrinello N., Longo V. and Colombo P. (2009) Isolation and expression of a novel MBL-like collectin cdna enhanced by LPS injection in the body wall of the ascidian Ciona intestinalis. Mol Immunol 46, Cammarata M., Arizza V., Cianciolo C., Parrinello D., Vazzana M., Vizzini A., Salerno G. and Parrinello N. (2008) The prophenoloxidase system is activated during the tunic inflammatory reaction of Ciona intestinalis. Cell Tissue Res 333, Dehal P., Satou Y., Campbell R. K., Chapman J., Degnan B., De Tomaso A., Davidson B., Di Gregorio A., Gelpke M., Goodstein D. M., Harafuji N., Hastings K. E., Ho I., Hotta K., Huang W., Kawashima T., Lemaire P., Martinez D., Meinertzhagen I. A., Necula S., Nonaka M., Putnam N., Rash S., Saiga H., Satake M., Terry A., Yamada L., Wang H. G., Awazu S., Azumi K., Boore J., Branno M., Chin-Bow S., DeSantis R., Doyle S., Francino P., Keys D. N., Haga S., Hayashi H., Hino K., Imai K. S., Inaba K., Kano S., Kobayashi K., Kobayashi M., Lee B. I., Makabe K. W., Manohar C., Matassi G., Medina M., Mochizuki Y., Mount S., Morishita T., Miura S., Nakayama A., Nishizaka S., Nomoto H., Ohta F., Oishi K., Rigoutsos I., Sano M., Sasaki A., Sasakura Y., Shoguchi E., Shin-i T., Spagnuolo A., Stainier D., Suzuki M. M., Tassy O., Takatori N., Tokuoka M., Yagi K., Yoshizaki F., Wada S., Zhang C., Hyatt P. D., Larimer F., Detter C., Doggett N., Glavina T., Hawkins T., Richardson P., Lucas S., Kohara Y., Levine M., Satoh N. and Rokhsar D. 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(2008) Enhanced expression of a cloned and sequenced Ciona intestinalis TNFalpha-like (CiTNF alpha) gene during the LPS-induced inflammatory response. Cell Tissue Res 334, Seong S. Y. and Matzinger P. (2004) Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses. Nat Rev Immunol 4, Smith L. C. and Davidson E. H. (1992) The echinoid immune system and the phylogenetic occurrence of immune mechanisms in deuterostomes. Immunol Today 13,

6 12 - Descrizione dei compiti dell'unità di Ricerca Testo italiano Il progetto di ricerca che questa Unità Operativa intende sviluppare si riferisce alla identificazione di geni indotti durante il processo infiammatorio in Ciona intestinalis in seguito ad inoculo con LPS nella parete corporea. In particolare si focalizzerà la propria attività sull'identificazioni di peptidi ad attività antimicrobica Il vantaggio relativo all'utilizzo di questo sistema biologico risiede nella conoscenza approfondita del genoma di C.intestinalis (Dehal et al., 2002) e nelle numerose informazioni relative alla caratterizzazione di Expressed Sequence Tag (EST) (Nori Satoh unpublished cdna library, blood cells, 56,720 ESTs e Ascidian hemocytes cdna library, 3,376 ESTs). Inoltre, l'unità UNIPA, con cui questa unità prevede di collaborare attivamente, conduce da molti anni una serie di studi sulla reazione infiammatoria nei Tunicati indotta da LPS. L'attività di questa Unità di Ricerca si svilupperà durante tre fasi di sviluppo così suddivise: I anno di attività: Azione 1 Inoculo di LPS nella parete corporea di Ciona intestinalis. Questa azione sarà svolta in stretta collaborazione con l'unità UNIPA la quale conduce da molti anni studi sulla reazione infiammatoria nei Tunicati indotta da LPS. Saranno seguiti protocolli di inoculo e stabulazione degli animali già standardizzati in precedenza dall'unità UNIPA. In particolare, Lipopolisaccaride (Escherichia coli sierotipo 055:B5, Sigma-Aldrich) sarà risospeso in una soluzione sterile contenente (Marine solution [MS]=12 mm CaCl2 X 6H2O, 11mM KCl, 26 mm MgCl2 X 6H2O, 43 mm Tris HCl, 0.4 M NaCl, ph 8.0). La soluzione contenente LPS (100 µg LPS in 100 µl MS per animale) sarà iniettata all'interno della parete corporea dell'animale (regione del faringe). Animali non iniettati o iniettati con soluzione MS senza LPS (100 µl) saranno utilizzati come controllo negativo. Questa azione è riconducibile all'interno delle attività del W.P. 3 Risposte allo stress ed immunomodulazione. Azione 2 Scopo di questa Azione è l'analisi del trascrittoma di Ciona intestinalis in risposta all'inoculo di LPS A tal fine, RNA totale verrà estratto dal faringe 4 h dopo l'inoculo con LPS. Esperimenti già condotti nei laboratori delle Unità CNRPA e UNIPA hanno dimostrato una potente attivazione di geni dell'immunità innata in questo intervallo di tempo post-inoculo (Bonura et al., 2010; Bonura et al., 2009). RNA estratti da animali non inoculati saranno usati come controlli negativi. Al fine di identificare i geni differenzialmente espressi dopo stimolazione con LPS, sarà utilizzata la tecnica definita come Analisi di differenza di rappresentatività mediante la quale è possibile combinare ad una ibridazione sottrattiva degli mrna una amplificazione mediante polimerizzazione a catena del DNA. Tale tecnica prevede la retro-trascrizione degli mrna del campione inoculato e di quello non inoculato. Questi due campioni di cdna (Tester e Driver) verranno successivamente trattati con l'enzima di restrizione RSA I al fine di generare estremità tronche. Il cdna tester verrà diviso in due aliquote che saranno incubate con l'enzima T4 DNA ligase e con differenti sequenze adattatrici. Essendo le estremità degli adattatori non fosforilate si otterranno molecole in cui ogni filamento conterrà adattatori diversi all'estremità 5'. In seguito i cdna andranno incontro a due cicli di ibridazione. Nella prima ibridazione, un eccesso di driver verrà aggiunto alle due aliquote di cdna tester precedentemente preparate. I campioni verranno denaturati al calore e lasciati ad incubare per permettere alle sequenze omologhe di accoppiarsi. Quindi verrà eseguita una seconda ibridazione in cui le due ibridazioni primarie verranno incubate senza alcuna denaturazione per permettere alle sequenze che non sono state sottratte nella precedente ibridazione di riassociarsi. Queste molecole ibride, che rappresentano le sequenze espresse in maniera differenziale, conterranno alle loro estremità sequenze adattatrici diverse. Pertanto l'intera popolazione di molecole verrà sottoposta ad un ciclo di PCR in cui verranno amplificati esclusivamente i retro-trascritti derivanti dai geni attivati in risposta a LPS. Il principale vantaggio della tecnica appena descritta risiede nel fatto che essa permette l'isolamento di frammenti di cdna differenzialmente espressi a partire da quantità di mrna estremamente basse. Tali frammenti saranno clonati all'interno di vettori di espressione procariotici ed indotti per la produzione del messaggio genetico in esso contenuto. I batteri ricombinanti saranno piastrati in replica, una delle quali sarà icubata con IPTG per l'induzione della proteina eterologa. Pertanto sarà possibile identificare le colonie che non presentano crescita dopo induzione della proteina ricombinate. Tali cloni saranno isolati e le costruzioni plasmidiche in esso contenute sequenziate. I cdna contenenti la sequenza completa dell'rna messaggero verranno poi identificati utilizzando la tecnica del 5' e 3' RACE. RACE, acronimo di Rapid Amplification of cdna Ends è una tecnica che permette di identificare le sequenze non note di un cdna alle estremità 5' e 3' al fine di ottenere la sequenza completa del cdna studiato. Tale tecnica permette l'isolamento dei geni completi a partire da brevi sequenze già identificate. Il principale presupposto teorico consiste nella conoscenza della sequenza parziale del cdna di interesse al fine di poter costruire oligonucleotidi gene-specifici da utilizzare nei processi di amplificazione. Le sequenze geniche così identificate saranno analizzate utilizzando i più comuni algoritmi disponibili on line (FASTA, BLAST, ecc). Inoltre, grazie alla conoscenza delle sequenze contenute nel genoma di Ciona ed ai numerosi EST depositati nelle banche dati, saremo in grado di sviluppare una prima mappatura dei geni espressi in risposta allo stimolo da LPS. L'analisi di tali sequenze verrà ulteriormente implementata attraverso l'utilizzo di software specifici per l'identificazione di putativi peptidi ad attività antimicrobica disponibili on-line. Le sequenze che in silico mostreranno caratteristiche riconducibili a quelle degli AMP saranno ulteriormente analizzate nelle Azione successive. L'azione 2 precedentemente descritta è riconducibile all'interno delle attività del W.P. 2 Genomica funzionale e trascrittomica. II Anno di attività Le successive analisi saranno effettuate in collaborazione con le altre Unità operative coinvolte nel progetto. In particolare: Azione 3 1)Le sequenze geniche identificate mediante Analisi di differenza di rappresentatività saranno studiate in collaborazione con l'unità UNIPA mediante Real Time PCR condotta sugli mrna precedentemente collezionati dopo l'inoculo di LPS allo scopo di comprendere il profilo di espressione dei geni identificati. Ciò consentirà la conferma della reale attivazione di codesti geni e lo studio del time corse di attivazione nell'intervallo compreso tra 2 e 48 ore post-inoculo (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 ore). Inoltre, questa unità di ricerca identificherà le regioni ottimali da sottoporre alla analisi di Real Time. Inoltre, sarà compito di codesta Unità l'isolamento e la realizzazione delle costruzioni plasmidiche in grado di permette la produzione di sonde specifiche per gli esperimenti di ibridazione in situ per la localizzazione tissutale degli mrna identificati. Questa ultima attività sarà svolta in collaborazione con l'unità UNIPA. Le azioni descritte sono riconducibili all'interno delle attività del WP1: Caratterizzazione ed attivitè specifiche di biomolecole, espressione genica a livello cellulare e di organismo Azione 4 Contemporaneamente, le sequenze geniche identificate dalla nostra Unità e validate dagli studi effettuati dalla Unità UNIPA, saranno clonate all'interno di vettori di espressione procariotici allo scopo di: 1)studiare l'eventuale inibizione della crescita dei batteri ricombinanti indotta dalla espressione della proteina eterologa; 2)nel caso la proteina prodotta in sistemi procariotici non possieda una attività antibiotica diretta, produrre proteina ricombinante da utilizzare in esperimenti di modulazione della risposta immune quali ad esempio la capacità di inibizione del rilascio di citochine pro-infiammatorie (INF-, TNF-, ecc) da parte di PBMC umani dopo stimolazione con LPS. A tal fine saranno utilizzati protocolli (cromatografia di affinità) e vettori di espressioni (pqe30, QIAGEN) in grado di dare proteina ad elevato grado di purezza. Tali tecniche sono di routine utilizzati nei nostri laboratori. 3)nel caso le proteine identificate mostrassero attività antibiotica diretta, saranno utilizzati sistemi d'espressione eucariotici al fine di produrre tali peptidi sotto forma di proteina ricombinanti. Le azioni descritte nei punti precedenti sono riconducibili all'interno delle attività del WP4: Struttura molecolare, isolamento e produzione di biomolecole III ANNO Azione 5 I geni identificati mediante Analisi di differenza di rappresentatività ed in possesso di una attività antimicrobica saranno successivamente studiati per le loro caratteristiche biologiche. In particolare, ciò sarà reso possibile grazie alle competenze delle Unità UNIVT e UNILE le quali presentano competenze specifiche per la realizzazione dei saggi biologici in questione. All'interno di questa Azione 5 è pertanto compresa la produzione in quantità discrete di proteina ricombinante da fornire alle suddette Unità Le azioni descritte nel punto precedente sono riconducibili all'interno delle attività dei WP5: Effetti funzionali di biomolecole in vitro ed in vivo e WP6: Effetti su target microbici e trasferibilità all'impresa Azione 6 4)Infine le sequenze isolate da questa unità di ricerca e caratterizzate a livello trascrizione e tissutale dalla Unità UNIPA, saranno rese disponibili alla Unità UNIPD

7 per la ricerca di omologhi di altri componenti della famiglia dei Tunicati quali Botryllus schlosseri. L'unità operativa di Padova possiede una collezione di EST da colonie di Botrillo da cui è possibile identificare eventuali omologhi dei geni isolati in Ciona intestinalis. Stessa analisi comparativa sarà svolta in collaborazione con l'unità UNIMORE (confronto con Drosophila melanogaster). Testo inglese The inflammatory reaction in the tunic of C. intestinalis described for the first time by Parrinello and co-workers (Parrinello et al., 1990; Parrinello et al., 1984a; Parrinello et al., 1984b) is a well known model for the analysis of inducible host defence molecules. These Authors were able to show that the injection of LPS induces a capsule in the C. intestinalis tunic, whereas in the hemolymph, the concentration of lectins showing IL1-a epitopes and the opsonizing property is promptly augmented as a response to the non-specific inflammatory stimulus. The main goal of this Research Unit is to identified LPS- induced genes and new peptides with antimicrobial peptide activity after injection of LPS in the body wall of the ascidian Ciona intestinalis. The project will be developed in three years. Year I Action 1 LPS injection in the body wall of Ciona Intestinalis Lipopolysaccharide (Escherichia coli 055:B5, LPS, Sigma-Aldrich, Germany) solution will be prepared in sterile marine solution (MS) (MS=12 mm CaCl2 X 6H2O, 11mM KCl, 26 mm MgCl2 X 6H2O, 43 mm Tris HCl, 0.4 M NaCl, ph 8.0). LPS solution (100 µg LPS in 100 µl MS per animal) will be injected trough the tunic into the body wall (pharyngeal region) at the mid portion referred to the longitudinal axis. Ascidians, both untreated and injected with MS (100 µl), will be used as negative controls. The time course will be the same used in previously reported publications (Bonura et al., 2009; Bonura et al., 2010). Ascidian tissue fragments will be explanted at various times (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 hours) and total RNA extraction will be performed as previously described. These activities will be done in tight collaboration with the UNIT UNIPA These activities will be performed within the work program 3: Stress response and immunomodulation Action 2 Subtractive hybridization is a powerful technique that enables researchers to compare two populations of mrnas and obtain clones of genes that are expressed in one population but not in the other. By means of this technique, the analysis of the Ciona intestinalis transcriptome will be performed. In particular we will apply a Representational Difference Analysis. This strategy is based on a PCR-based method for selective amplification of differentially expressed sequences allowing the isolation of transcripts from activated tissues. Briefly, RNA poly(a)+ from non injected (driver) and injected (tester) animals will be retro-transcribed. The tester and driver cdnas will be digested with the restriction enzyme Rsa I to yield blunt ends. The tester cdna will be then subdivided into two aliquots and each one ligated with a different cdna adaptor. The ends of the adaptor do not contain a phosphate group, so only one strand of each adaptor attaches to the 5' ends of the cdna. Then two hybridizations steps will be performed. In the first run, an excess of driver will be added to each sample of tester. The samples will then heat denatured and allowed to anneal. In the second run of hybridization, the two primary hybridization samples will be mixed together without denaturing to allow the subtracted single strand tester cdnas to re-associate. These new hybrids will be molecules with different ends, which correspond to the sequences of the two adaptors. After filling in the ends by DNA polymerase, the differentially expressed sequences will display different annealing sites for the nested primers on their 5' and 3' ends. The entire population of molecules will be subjected to PCR to amplify the desired differentially expressed sequences. This section of the Action 2 will be performed according to the manufacturer's instructions included in the PCR-Select cdna Subtraction Kit (Clontech). During the second part of the Action, PCR fragments will be cloned within prokaryotic expression vectors (pqe30, QIAGEN). Recombinant clones will be seeded and replicated in two independent Petri dishes. One of the plate will be induced with IPTG for the expression of the cloned differentially expressed cdnas. cdnas inducing cell death will be identified and plasmid isolated and sequenced. Full length transcripts will be identified using the 5' and 3' RACE. Rapid Amplification of cdna Ends (RACE) is a technique used in molecular biology to obtain the full length sequence of an RNA transcript found within a cell. RACE can provide the sequence of a full lenght RNA transcript starting from a small known sequence within the transcript of the RNA (5' RACE-PCR) or (3' RACE-PCR). The full length sequence of the cdnas will be obtained by using the GeneRacer kit (Invitrogen, USA). The kit ensures the amplification of only full length transcript via elimination of truncated messages from the amplification process. Sequence analysis will be performed using the most common algorithm on the web (FASTA, BLAST, ecc). This will allow us the identification of the pattern of expression of genes involved in the immune reaction to bacterial LPS. The search for proteins with antimicrobial peptide analysis will be performed using on line specific databases (http://aps.unmc.edu/ap/main.php). The sequences with a positive prediction will be further on characterized in the next Actions. These activities will be performed within the work program 2: Functional Genomics and Transcriptomics Year II Action 3 Next activities will be performed in tight collaboration with the Unit UNIPA. Sequences identified by means of Representational Difference Analysis will be studied for their pattern of activation and tissue localization in section from treated and un-treated Ciona intestinalis animals. This action will allow us to confirm the activation of these genes after LPS injection and the time course of activation. We are planning to analyze RNAs extracted from 2 to 48 hours after LPS injection (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 hours). Oligonucleotides specific to the LPS induced genes previously isolated will be designed for Real time PCR experiments by our Unit. In addition, our research unit will perform all the assays for the identification of the best probe for the in situ hybridization experiments. The Unit UNIPA, will perform in situ hybridizations to study the tissue distribution of the activated genes. These activities will be performed within the work program 1: Characterization and specific activities of biomolecules and gene expression at cellular and organism level. Action 4 The sequences with a positive in silico prediction and studied within the activities of the Action 3, will be cloned and expressed in E.coli to detect: 1)either a direct antibiotic activity in vivo as a consequence of the intracellular expression of the recombinant protein; 2)in absence of a direct antimicrobial activity in vivo, we will express and purify the recombinant proteins and we will study their immunological properties using PBMC from healthy donors. We are planning to look at the expression of pro-inflammatory cytokines such as IFN-g and TNF-a on the attempt to understand the biological function of the peptides. To achieve this result, we will use vectors (pqe30, QIAGEN) and protocols routinely used in our laboratories; 3)whether the identified genes will display a direct antibiotic activity, we will use eukaryotic expression systems for the expression and purification of the identified genes. Year III Action 5 Sequences identified by means of Representational Difference Analysis showing antimicrobial activities will be further on analyzed for their biological functions. Recombinant proteins produced within the activities described in Action 4 will be provided to the Units UNIVT and UNILE for in vitro and in vivo assays. Within this Action, the main activity of our Unit will be the production and purification of recombinant LPS-induced proteins. These activities will be performed within the work program 5: Functional effects of biomolecules in vitro ed in vivo and work program 6: Effects on microbial targets and transferability to enterprise. Action 6 Finally, a comparative analysis of the identified sequences will be performed in Botryllus schlosseri thanks to the EST collection available at the Unit UNIPD. The same strategy will be performed in collaboration with the Unit UNIMORE for the comparison the Drosophila melanogaster genome. ogaster genome.

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