da Erriu, Nitti, Verniglio Element i di Fisica ed. Mondurri

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1 7.17. SEDIMENTAZIONE da Erriu, Nitti, Verniglio Element i di Fisica ed. Mondurri Se si vogliono studiare le proprietà fisiche e chimiche dei componenti subcellulari (membrane, nuclei, mitocondri, ecc.) o quelle delle proteine o degli acidi nucleici, bisogna preliminarmente procedere alla loro purificazione provvedendo ad isolarli e a raccoglierli in gruppi omogenei. Naturalmente la stessa operazione preliminare, con gli stessi scopi, va fatta su tutti i liquidi biologici, sangue compreso, che abbiano in sospensione componenti dei quali si vogliano studiare le proprietà. Un semplice metodo di separazione di componenti dispersi in un liquido, e quindi delle varie particelle contenut e in esso, consiste nel farli sedimentare. In un miscuglio di particelle o componenti diversi, infatti, le velocità di sedimentazione sotto l'effetto della gravità, sono diverse da componente a componente, il che darebbe la possibilità, con opportuni accorgimenti, di ottenerli separati l'uno dall'altro. La velocità di sedimentazione è facilmente calcolabile partendo dalla legge di Stokes, la quale dice che la forza F di attrito che un liquido di viscosità η oppone al moto di una sferetta di raggio R che scorre in esso, è direttamente proporzionale alla velocità della sferetta, al suo raggio e al coefficiente di viscosità η del liquido. Si ha cioè in modulo 7.) F = 6πηRv Si osserva che un corpo che cade in un liquido viscoso dopo qualche tempo si muove di moto rettilineo uniforme. Prendiamo in esame una sfera di raggio R e densità che venga lasciata cadere in un liquido viscoso di densità 0 e che stia scendendo in esso con moto rettilineo uniforme. In queste condizioni deve essere necessariamente nulla la risultante delle forze agenti su di essa come vuole il principio d'inerzia. La forza F 1, diretta verso il basso e causa del moto è equilibrata della forza viscosa F che si oppone al moto. F è pertanto diretta verso l'alto e il suo modulo è dato dalla legge di Stokes. Il modulo di F 1 si può calcolare facilmente osservando che esso è dato dalla differenza tra la forza peso della sferetta 1

2 7.5) mg = πr g e di quella dovuta alla spinta di Archimede 7.6) f A = πr 0 g Si ha cioè in modulo 7.7) F 1 = mg f A = πr ( - 0 )g Eguagliando la (7.) e la (7.7) si ottiene 6πηRv = πr (- 0 )g da cui si ricava facilmente 7.8) v = ( 0 )gr 9η Questa velocità prende il nome di velocità di sedimentazione. La (7.8) permette in definitiva di ricavare la velocità con cui sedimenta una sfera di raggio R e densità quando essa cade in un liquido di densità 0 < e coefficiente di viscosità η. Le velocità di sedimentazione dei componenti cellulari sono molto piccole ed è per accelerare questo processo che si ricorre alla centrifugazione che consenta di ottenere gli stessi risultati in tempi notevolmente più brevi CENTRIFUGAZIONE Una centrifuga è schematicamente costituita da un rotore al quale è legato un recipiente contenente il liquido che si vuole centrifugare e che può essere una sospensione colloidale, una emulsione o un particolare preparato biologico liquido.

3 Figura 7.6 Indichiamo con 0, la densità del liquido e con ed m la densità e la massa di una singola particella in sospensione. Facendo ruotare il recipiente con velocità angolare ω intorno all'asse di rotazione (fig. 7.6) le particelle in sospensione che si trovano a distanza r dall'asse sono sottoposte ciascuna ad una forza centrifuga di modulo 7.9) F = ma = mω r per ognuna di esse la situazione è analoga a quella di un corpo immerso in un liquido in quiete e soggetto alla sua forza peso ed alla spinta di Archimede. La (7.9) si può pertanto scrivere per analogia con la (7.7) 7.50) F = Vω r(- 0 ) = m rω (1-0 ) = mω r(1-0 ) dove al volume della sfera (/ πr ) è stato sostituito il volume V della particella che a sua volta è eguale a m/. Quando > 0 la forza F spinge le particelle in sospensione verso il fondo del recipiente. Ma se il liquido ha un coefficiente di viscosità, si origina una forza di frenamento F a nei confronti della particella, che risulta proporzionale alla velocità v con cui la particella stessa si dirige verso il fondo del recipiente. Si ha quindi, in modulo 7.51) F a = fv dove f è un coefficiente di proporzionalità che prende il nome di coefficiente di attrito viscoso o di resistenza viscosa.

4 Dopo una fase transitoria iniziale, nel corso della quale F a va aumentando, si arriva ad una situazione stazi onaria nella quale F a = F. In tale situazione la (7.50) e la (7.51) sono eguali. Eguagliandole si ricava pertanto con semplici passaggi mω 7.5) v = 0 (1 ) f che rappresenta la velocità costante con cui la particella sedimenta. La velocità di sedimentazione è però in questo caso diversa da quella data dalla (7.8) che si riferisce alla sedimentazione spontanea. Essa dipende infatti da ω r, cioè da parametri che sono caratteristici della centrifuga usata. Per determinare le caratteristiche di sedimentazione di un preparato indipendentemente dalle caratteristiche della centrifuga si introduce un coefficiente di sedimentazione S il cui valore, dato da S = v/ω r, si ricava dalla (7.5) e risulta espresso da 7.5) S = v ω r = 0 m(1 ) f Esso dipende dalla massa m della particella, dalla sua densità, dalla densità del liquido 0 e dal coefficiente di attrito f. Come è facile verificare, S ha le dimensioni di un tempo e la sua unità comunemente usata in biologia e in medicina prende il nome di svedberg ed è 1 svedberg = 10-1 s. Alcuni coefficienti di sedimentazione riferibili all'acqua a 0 C sono dati qui di seguito: citocromo 1,7 svedberg mioglobina ribosomi batterici 70 albumina (siero bovino), A titolo di esempio viene qui calcolata l'accelerazione cui è sottoposta una particella che venga fatta ruotare in una centrifuga con velocità angolare ω = giri/minuto =

5 1000 giri/s. Se la particella si trova a 10 cm di distanza dall'asse di rotazione si ha e quindi ω = 6 10 rad/s v = ωr = 6 10 rad/s 0,1 m = 6 10 m/s Sarà pertanto a = ω r = m/s, g Nel caso considerato la particella è quindi sottoposta ad una accelerazione più grande dell'accelerazione di gravità g di circa, volte. E facile calcolare che con una accelerazione radiale di quest'ordine di grandezza, una particella che impiegasse un minuto per separarsi dal miscuglio per centrifugazione, per sedimentazione impiegherebbe parecchi mesi. Le centrifughe usate nella ricerca biomedica sono generalmente di due tipi: quelle preparative e quelle analitiche. Quelle preparative sono di norma utilizzate per il frazionamento, in componenti omogenee, di miscugli di particelle diverse in sospensione: con esse si possono ad esempio separare i globuli rossi dai leucociti e dalle piastrine, le proteine dalle sospensioni colloidali, i sedimenti corpuscolari dai liquidi urinari. E anche possibile ottenere con esse preparati ad alto grado di purezza e a grande concentrazione. Le centrifughe analitiche dal canto loro vengono utilizzate per studiare proprietà fisicochimiche di macromolecole biologiche come proteine e acidi nucleici, delle quali si possono, con questo tipo di centrifuga, determinare peso molecolare e densità. Con esse si possono altresì studiare proprietà fisicochimiche di componenti subcellulari come nuclei, mitocondri, ribosomi ed altri. 5