Metodi di campionamento e monitoraggio degli ambienti (MAM)

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1 Metodi di campionamento e monitoraggio degli ambienti (MAM) La contaminazione microbica è dovuta principalmente a due fattori: la contaminazione diretta da parte di presidi non sterili e la contaminazione indiretta da parte di agenti microbici aerodispersi. La sorgente di contaminazione è rappresentata soprattutto dall uomo e dai sistemi di ventilazione. Per garantire condizioni di sicurezza è quindi necessario effettuare controlli sistematici su aria e superfici di un ambiente a rischio. Sulla base di tali considerazioni si è andato sviluppando nel tempo il concetto di MAM (Monitoraggio Microbiologico Ambientale), un sistema che si prefigge di quantificare la carica microbica in un ambiente confinato.

2 Il Monitoraggio Microbiologico Ambientale MAM - è una metodica che si compone di due momenti: il controllo dell aria il controllo delle superfici L aria è il veicolo tramite il quale gli agenti microbici (legati a particelle inerti di almeno 10 mµ di diametro) si muovono nell ambiente, raggiungono le superfici e vi si depositano. Il monitoraggio delle superfici è essenziale per conoscere il fall - out microbico, cioè quella parte di bioaerosol e di microrganismi in esso presenti che si deposita sulle superfici costituendo un potenziale veicolo di infezione.

3 Il MAM costituisce quindi un primo fondamentale passo verso la bonifica degli ambienti di lavoro a biorischio rivelandosi uno strumento prezioso nel controllo e nella prevenzione delle infezioni in ambito ospedaliero. Linee guida MAM: uno strumento guida nella misura e prevenzione del rischio biologico indoor. In Italia l importanza del MAM relativo alle sale operatorie è ribadita dall ISPESL (Istituto Superiore per la Prevenzione e Sicurezza del Lavoro) che ha emanato le Linee Guida per la definizione degli standard di sicurezza e di igiene ambientale dei reparti operatori (Luglio 1999) e recepita dalla Regione Sicilia che con la Circolare Amministrativa C.A. n 1047 del 27 marzo 2001, suggerisce tale indagine per il controllo delle infezioni nosocomiali.

4 Fattori che influenzano la sopravvivenza dei microrganismi nell aria a) resistenza propria del microrganismo b) umidità relativa dell aria c) temperatura dell aria e luce solare d) composizione dell aerosol e) modalità di campionamento dell aerosol

5 I controlli ambientali: l aria l L aria può essere veicolo di contaminazione di semilavorati e del prodotto finito. Per questo motivo molte aree nelle aziende sono dotate di sistemi di filtrazione dell aria a vari livelli di efficienza che minimizzano la presenza di microrganismi. E dunque necessario un controllo costante di tali aree per valutare l efficacia dei sistemi di filtrazione. Occorre validare il sistema di filtrazione dell aria e garantirne il buon funzionamento con il monitoraggio

6 I controlli ambientali: l aria Validazione: Consiste nell effettuare per 3 mesi consecutivi in zone critiche prefissate, campionamenti d aria settimanali per ottenere un dato statisticamente significativo che rispetti i limiti previsti dalle Norme di Buona Fabbricazione. Il monitoraggio ambientale prevede controlli mensili

7 Parametri microbiologici che vengono generalmente determinati nel corso del monitoraggio Carica Batterica Totale a 36 C C (batteri mesofili): temperatura ottimale di sviluppo fra 25 e 40 C. In questa categoria si collocano i batteri patogeni convenzionali o opportunusti e tutti i batteri che costituiscono la flora normale dell uomo. Carica Batterica Totale a 20 C C (batteri psicrofili psicrofili): temperatura di C. In questa categoria sono compresi tutti i microrganismi saprofiti che sono in grado di compiere il proprio ciclo vitale a spese di sostanze organiche in decomposizione, per cui sono in grado di colonizzare il suolo e gli ambienti umidi. Carica micetica totale: i funghi di interesse comprendono muffe e lieviti. La determinazione del parametro micetico nei campioni ambientali è necessaria poiché la loro presenza è spesso correlata alla presenza di polvere e può essere considerevole in presenza di elevata umidità. Staphylococcus spp.: Staphylococcus spp.: sono cocchi Gram positivi e sono numericamente i più rappresentati nella popolazione microbica normale della cute e dell orofaringe dell uomo.

8 I batteri più comuni degli ambienti confinati sono: Bacillus, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus, Methylobacterium, Flavobacterium. Tali germi fanno parte della normale flora microbica degli ambienti confinati e la loro presenza in generale non deve creare allarmismo. Dei batteri riscontrati maggiormente, Staphylococcus spp. è un indicatore di buone pratiche di pulizia e potenziale patogeno.

9 I controlli ambientali: le superfici Le superfici degli impianti destinati alla produzione ed al confezionamento dei prodotti devono essere mantenute in perfette condizioni igieniche al fine di evitare lo sviluppo di microrganismi che potrebbero determinare una contaminazione dei semilavorati e dei prodotti finiti. Il campionamento si effettua con la: Tecnica Swab: effettuato il lavaggio delle attrezzature con l impiego del detergente del sanitizzante idoneo, si sfrega un tampone su una superficie ben definita da campionare. Tecnica del lavaggio Tecnica delle membrane di nitrocellulosa (per 30 e incubati alle T idonee e su diversi terreni di coltura) AM: accumulo microbico INDICI DA VALUTARE: AMO: accumulo microbico orario

10 Metodi di campionamento e monitoraggio dell aria I metodi adottati per il controllo microbiologico dell aria ambientale si basano sui seguenti campionamenti: CAMPIONAMENTO PASSIVO CAMPIONAMENTO ATTIVO

11 CAMPIONAMENTO PASSIVO impiego di piastre Petri di sedimentazione. Viene tolto il coperchio della capsula Petri contenente il terreno di coltura agarizzato sterile, in modo che la superficie dell agar rimanga esposta all aria per un tempo definito. Al termine si richiude la piastra e si procede all incubazione a 37 C per 48 ore e a 25 C per altre 24 ore. Si conta il numero di colonie cresciute, ciascuna delle quali rappresenta una particella trasportante microrganismi caduta sulla superficie dell agar. I risultati vengono espressi nell unità di misura: UFC (=Unità Formante Colonia)/m 2 /ora (oppure anche UFC/dm 2 / ora).

12 Metodo di campionamento passivo INDICE DI CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA DELL ARIA IMA Standard da seguire: Piastra: 1 m da terra Durata esposizione: 1 ora Terreno di coltura: PCA Agar T e durata incubazione: 37 C per 48 ore Il numero delle UFC trovate è l indice IMA

13 Classi IMA CLASSE IMA 1 INDICE IMA 0-5 IGIENE ARIA OTTIMA GRUPPO A RISCHIO MOLTO ALTO ESEMPIO DI UTILIZZO -ULTRA CLEAN ROOM -IMPIANTI E TRAPIANTI BUONA ALTO -OPERAZIONI ASETTICHE -REPARTO INTENSIVO -PICCOLA CHIRURGIA MEDIOCRE MEDIO - AMBIENTI CON PARTICOLARE RILEVANZA D IGIENE AMBIENTALE CATTIVA BASSO - AMBIENTI SENZA PARTICOLARE RILEVANZA D IGIENE AMBIENTALE 5 Nuovo testo 76 PESSIMA NULLO - ALTRI AMBIENTI

14 Valori limite IMA (UFC/piastra) Le quattro classi di contaminazione microbica dell aria definite dall IMA variano in relazione alla tipologia dell ambiente: Tipologia di ambiente (UFC/piastra) Ambienti ad altissimo rischio Ultra clean room, isolamento protettivo, sale operatorie per protesi auricolari, alcune lavorazioni dell industria elettronica e farmaceutica 5 Ambienti ad alto rischio Clean room sale operatorie per chirurgia generale, rianimazione, dialisi, alcune lavorazioni dell industria elettronica e farmaceutica, laboratori di microbiologia 25 Ambienti a medio rischio Ambulatori, laboratori, industrie alimentari, cucine, ristoranti, opifici 50 Ambienti a basso rischio Corsie d ospedali, servizi, uffici 75

15 MINISTERO DELLA SANITA Istituto Superiore per la Prevenzione e la Sicurezza del Lavoro (ISPESL) LINEE GUIDA PER LA DEFINIZIONE DEGLI STANDARD DI SICUREZZA E DI IGIENE AMBIENTALE DEI REPARTI OPERATORI Tipo di campionamento Situazione sala operatoria Valori limite ISPESL (IMA) Aria (CFU/m 3 ) Sala pronta (a riposo) Sala in attività (flusso turbolento) < 35 <180 Superfici (CFU/m 3 ) Sala pronta (a riposo) < 0.5

16 CAMPIONAMENTO ATTIVO attraverso l uso di una apparecchiatura SAS Surface Air System portatile una quantità misurata di aria è aspirata in un coperchio sotto il quale è collocata una capsula petri contenente terreno agarizzato. Le piastre Petri vengono incubate a 37 C per 48 ore e a 25 C per altre 24 ore. Le colonie cresciute sulla superficie dell agar vengono contate e i risultati espressi in UFC/m3 in rapporto al volume d aria aspirato ed analizzato.

17 La conta totale delle colonie batteriche delle piastre di TSA (Triptic Soy Agar), di MSA (Mannitol Salt Agar) e di SAB (Sabouraud Agar) effettuata dopo incubazione è stata espressa in CFU/m 3 ed è stata calcolata nel seguente modo: il numero totale (N) delle colonie cresciute è stato diviso per il volume d aria campionato (V, espresso in litri), e il risultato moltiplicato per 1000 (1 m 3 =1000 l). CFU/m 3 = (N / V) x 1000 Le piastre di TSA sono state incubate a 22 C e a 36 C per 48h. Le piastre di MSA sono state incubate a 36 C per 48h. I risultati delle letture sono stati espressi in CFU/m 3

18 Valori di carica batterica e valutazione della qualità dell aria (European Collaborative Action, 1993) Categoria di inquinamento microbiologico (batterica) Case UFC/m 3 Ambienti non industriali (UFC/m 3 ) Molto bassa < 100 <50 Bassa <500 <100 Intermedia <2500 <500 Alta <10000 <2000 Molto alta >10000 >2000

19 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO PASSIVO S.A.S. I.M.A.

20 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA CAMPIONAMENTO I.M.A. Indice Microbico Aria Esposizione all aria di Piastre Petri contenenti agar, per un tempo di 1 ora a 1 m di altezza a 1 m da ogni ostacolo Particelle > 10 µm PASSIVO I.M.A.

21 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA CAMPIONAMENTO PASSIVO I.M.A.

22 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA

23 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO S.A.S. Surface Air System: Campionatore ad impatto convoglia l aria aspirata direttamente su agar. Flusso 180 L/min 1,5 m di altezza 1,5 m dal paziente

24 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA CAMPIONAMENTO ATTIVO S.A.S.

25 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA

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29 METODI DI RILEVAZIONE DELLA CONTAMINAZIONE MICROBICA DELL ARIA parametri di valutazione I.M.A. (Pitzurra, 1997) S.A.S. (Orpianesi et al., 1983) GIUDIZIO I.M.A. (ufc/ dm 2 /h) ufc/m 3 ottimo 0 9 buono mediocre cattivo pessimo > 124 > 375

30 CONTAMINAZIONE MICROBIOLOGICA VALORI DI NORMATIVA Raccomandazioni ISPESL strumento di misura SAS A sala operatoria at rest 35 CFU/m3 - A sala operatoria in operation 180 CFU/m3 Flusso turbolento A sala operatoria in operation 20 CFU/m3 Flusso laminare

31 H 2 O qualche concetto di base sulle diluizioni:

32 L acqua potabilizzata può contenere una flora microbica autoctona e alloctona, capace di resistere ai trattamenti di potabilizzazione. Alcuni di questi microrganismi possono trovare condizioni favorevoli al loro mantenimento in rete.

33 BIOFILM Comunità batterica, altamente stratificata, adesa ad una superficie, circondata da una matrice extracellulare di natura organica e inorganica dove i microrganismi sono organizzati in una comunità funzionale.

34 Formazione di un biofilm costituito da più specie microbiche Batteri: (cariche positive) cariche -- (cariche +)

35 Protocollo disconnessione della rete idrica e applicazione di un sistema di alimentazione indipendente. modifiche tecniche al circuito per renderlo compatibile con i trattamenti. trattamento dei circuiti. ricollegamento alla rete idrica.

36 Processo di bonifica dei riuniti già in uso Trattamento: Detergente acquoso 30% etanolo 5 % tensioattivo anionico (2 flusso, 10 pausa) Disincrostante 7 % acido ortofosforico 1% tensioattivo anionico (2 flusso, 10 pausa) Disinfettante Acqua ossigenata 12-15% (2 flusso, 10 pausa)

37 FOTOGRAFIE IN MICROSCOPIA ELETTRONICA 5000 X Parete del condotto idrico del riunito prima della bonifica Parete del condotto idrico del riunito dopo la bonifica

38 Microbiologia: analisi delle acque - Parametri chimici, fisici e microbiologici (batteriologici) - Tra i microganismi (batteri e protisti, es. Giardia intestinalis) - Dai risultati delle analisi Punteggio Livelli di inquinamento Parametro Livello 1 Livello 2 Livello 3 Livello 4 Livello OD( % sat) >10 <20 <30 <50 >50 BOD 5 (O 2 mg/l) < 2.5 <4 <8 <15 >15 COD (O 2 mg/l) <5 <10 <15 <25 >25 NH 4 (N mg/l) <0.03 <0.10 <0.50 <1.5 >1.5 NO 3 (N mg/l) <0.3 <1.5 <5.0 <10.0 > 10 P (mg/l) <0.07 <0.15 <0.3 <0.6 >0.6 Escherichia coli (UFC/100 ml) <100 >1.000 < < > Punteggio

39 DILUIZIONI SERIALI E CONTA DEI MICRORGANISMI

40 SPATOLAMENTO SU PIASTRA DEI MICRORGANISMI E INCLUSIONE IN AGAR

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43 2) Sospensione del campione e diluizioni seriali a) Prelevare 10ml dal campione mediato e metterli in 90ml di soluzione fisiologica sterile preparata in una beuta di vetro. In questo modo si ottiene la diluizione 10-1 b) Mettere la beuta ad agitare per 15 minuti 9 ml c) Preparare delle provette sterili contenenti 9 ml di soluzione fisiologica 1 ml 1 ml d) Fare le diluizioni: prelevare 1 ml di soluzione dalla 9 ml Diluizioni seriali beuta di partenza (diluizione10-1 ) e metterlo in una provetta contenente 9 ml di soluzione fisiologica; procedere in successione fino ad ottenere la diluizione 10-6

44 3) Conta su piastra a) Per i batteri, dalle diluizioni 10-3, 10-4, 10-5 prelevare sterilmente 0,1 ml, versarlo sulla piastra e spargere la coltura con un'ansa sterile b) Per i funghi procedere allo stesso modo ma considerare le diluizioni 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ; 10-6 c) Inoculare 2 piastre per ciascuna diluizione per la conta batterica N.B. Ricordarsi di indicare su ciascuna piastra il tipo di terreno utilizzato specifico per batteri o funghi, il campione, la diluizione e la data. d) Incubare a 37 C e a 28 C per circa 24-48h; procedere con la conta delle colonie cresciute sulle piastre inoculate e registrare i dati raccolti per la successiva elaborazione

45 CONTA DEI MICRORGANISMI

46 Per "analisi microbiologica delle acque" si intende l'individuazione dei microrganismi presenti in esse, generalmente congiunta alla loro valutazione quantitativa. Nel caso particolare delle acque superficiali, siano esse adibite a balneazione, piuttosto che ad altri usi, attraverso l'analisi microbiologica se ne definisce la qualità. Controlli microbiologici vengono effettuati ovviamente anche su acque destinate all'approvvigionamento idrico-potabile e su acque reflue che, con il loro apporto inquinante, influenzano e modificano le caratteristiche del corpo idrico recettore (fiume, lago, mare).

47 1. Dalla difficoltà di utilizzare di routine tecniche finalizzate alla ricerca di tutti i possibili microrganismi patogeni, é sorta la necessità di ricercare, per la definizione della qualità di un'acqua, microrganismi indicatori di contaminazione, la cui presenza può essere indice della presenza di patogeni. 2. Un efficace indicatore microbiologico di contaminazione deve: a) poter sopravvivere sufficientemente a lungo nell'ambiente per consentire la sua evidenziazione b) deve poter essere identificato con metodologie poco complesse e sufficientemente rapide.

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50 Sistema delle membrane filtranti: quantitativo e qualitativo Volume prestabilito di acqua da saggiare Risultato UFC/ml di H 2 O filtrata

51 Microbiologia: metodo delle membrane filtranti Metodo delle membrane filtranti N Colonie/100 ml = (N colonie contate/ volume campione filtrato) *100

52 Microbiologia: analisi delle acque - Conta dei coliformi totali (UFC/ml) - Conta dei coliformi fecali (UFC/ ml) - Conta delgi Streptococchi fecali TERRENO DI COLTURA T INC. TEMPO INC. CONTA BATTERICA TOTALE PCA (Plate Agar Count) 22 C 36 C 72h 48h COLIFORMI TOTALI Membrane endo agar less 36 C 24h COLIFORMI FECALI Membrane faecal coliform 44 C 24h STREPTOCOCCHI FECALI KF streptococcus 36 C 48h

53 Microbiologia: Coliformi totali. Chi sono e come si cercano - Coliforme : simile ad Escerichia coli, fam. Enterobacteriaceae. - Aerobi o anaerobi facoltativi, G-, non sporigeni, lattosio-fermentanti - Organismi indicatori" e in genere non sono patogeni - Generi : Klebsiella, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter spp. -Colore rosso scuro, nel caso di riflesso metallico verdastro - Escherichia coli.

54 Microbiologia: Coliformi fecali - Sinonimo di Coliformi termoresistenti - Fermentano il lattosio a C

55 Microbiologia: Streptococchi fecali - Gram positivi - Indicatori di inquinamento non recente (vita media>) - Terreno BEA - Sodio azide (inibitore di altri microrganismi) - Colonie scure con alone attorno

56 Microbiologia: Streptococchi fecali - Chi sono e come si cercano Species Enterococcus faecalis Enterococcus hirae Enterococcus equinus Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Lactobacillus plantarum Escherichia coli Enterobacter cloacae Pseudomonas aeruginosa Colonia rossa + + (poor) + (poor) Alone giallo

57 Caratteristiche dell acqua di processo

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62 Controllo ambientale inquinamento benessere radioattivo temperatura biologico velocità aria chimico umidità fisico attività

63 Ecologia delle popolazioni microbiche del suolo Analisi microbiologica dei campioni Metodi di rilevamento Il numero delle cellule microbiche nel suolo può essere determinato: Sospensione di terreno ml 2 1 ml ml 1 ml ml ml Metodo delle diluizioni di sospensioni di suolo 8 1 ml Tecnica del vetrino interrato Se la superficie del vetrino è pulita, non è selettiva, e agisce come le particelle minerali del suolo Conte dirette al microscopio ottico o all epifluorescenza o elettronico a scansione Valori in difetto Valori in eccesso

64 Il numero dei batteri calcolato con metodi colturali è di circa batteri per grammo di terra secca, mentre quello ottenuto per microscopia diretta è di circa volte superiore. Conte dirette I valori sono approssimati per eccesso in quanto vengono calcolate anche le cellule morte Colorazioni vitali Permettono di distinguere le cellule ancora in grado di respirare da quelle che non metabolizzano più. Conte batteriche in cam pioni di suolo ottenute con m etodi diversi Cam pione Conta diretta Conta vitale A 5.0 x x 10 7 B 1.1 x x 10 7 C 2.0 x x 10 8