Seconda Università di Napoli Dipartimento di Pediatria F. Fede

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1 Seconda Università di Napoli Dipartimento di Pediatria F. Fede FIMPAGGIORNA 2005 Bruno Nobili La lettura dell esame emocromocitometrico Caserta 12 maggio 2005

2 L osservazione che il sangue è in parte costituito da elementi corpuscolati risale alla seconda metà del 1600 (Leeuwenhoek, Malpighi)

3 La scoperta del microscopio ottico (1877) e l utilizzo dei coloranti di anilina per il riconoscimento delle cellule del sangue periferico ha dato inizio all era morfologica dell ematologia.

4 Strumenti diagnostici del laboratorio di ematologia agli inizi del secolo scorso

5 LA RIVOLUZIONE TECNOLOGICA DEGLI ANNI SI E CONCRETIZZATA NELLA HEMATOLOGY BEYOND MICROSCOPY

6 Elettrodo interno interno La variazione d Impedenza Principio di Coulter (1956) Vuoto Vuotoregolato U Elettrodo esterno esterno Temps Conta Conta del del numero numero di di particelle particelle nell unità nell unità di di tempo tempo Flusso Flussodel del diluente Volume Volume delle delle particelle particelle Calcolo Calcolo automatico automatico del del Hct Hcte e degli degli Indici Indici di di Wintrobe Wintrobe

7 METODI AUTOMATIZZATI PER LA ESECUZIONE DELL ESAME EMOCROMOCITOMETRICO CONTAGLOBULI DI I GENERAZIONE (anni 60) Determinazione separata delle concentrazioni di Hb, Ht,, GR, GB, con calcolo degli indici derivati.

8 MCV MCV ( Volume Corpuscolare Medio ) rappresenta il volume medio dei globuli rossi; indice di normo,micro micro e macrocitosi,, è ben radicato nella cultura diagnostica. MCV = Ht x 1000 / G.R. ( x10 12 /l ) espresso in femtolitri ( fl = ) 15 )

9 MCH MCH ( Emoglobina corpuscolare media ) rappresenta il contenuto emoglobinico medio dei globuli rossi; meno utilizzato dell MCV. MCH = Ht x 1000 / G.R. ( x10 12 /l ) espresso in femtolitri ( fl = ) 15 )

10 MCHC (Concentrazione emoglobina corpuscolare media ) misura la concentrazione emoglobinica media dei globuli rossi; utilizzato quasi esclusivamente nella diagnostica delle anemie emolitiche. MCHC = Hb (g/dl) / Ht espresso g/dl

11 METODI AUTOMATIZZATI PER LA ESECUZIONE DELL ESAME EMOCROMOCITOMETRICO CONTAGLOBULI DI II e III GENERAZIONE Conteggio totale dei globuli bianchi ( WBC ) Conteggio totale dei globuli rossi ( RBC ) Emoglobina ( HGB ) Ematocrito ( HCT ) Volume Corpuscolare Medio ( MCV ) Contenuto Medio Emoglobinico ( MCH ) Concentrazione Corpuscolare Media Emoglobinica (MCHC) Conteggio totale delle piastrine ( PLT )

12 NUOVI PARAMETRI FORNITI DAI CONTAGLOBULI DI II E III GENERAZIONE (a) Indice di distribuzione volumetrica dei globuli rossi ( RDW ) Indice di distribuzione della concentrazione emoglobini ( HDW ) Piastrinocrito ( PTC ) Volume Piastrinico Medio ( MPV ) Indice di distribuzione volumetrica delle piastrine ( PDW )

13 NUOVI PARAMETRI FORNITI DAI CONTAGLOBULI DI II E III GENERAZIONE (b) Leucocitogramma a tre popolazioni : - Linfociti, cellule intermedie ( monociti, eosinofili, basofili ), neutrofili. Leucocitogramma a cinque popolazioni : - Linfociti, monociti, eosinofili, basofili e neutrofili.

14 RDW ( Red cell Distribution Width ) misura l ampiezza della curva di distribuzione volumetrica dei globuli rossi RDW -RDW-DS DS (fl) = Indice di anisocitosi assoluta; rappresenta la deviazione standard della distribuzione dei volumi di una popolazione di globuli rossi -RDW-CV (%) = Indice di anisocitosi relativa; rappresenta il coefficiente di variazione (CV) della popolazione di globuli rossi rispetto al valore medio

15 HDW ( Hemoglobin Distribution Width ) HDW rappresenta l ampiezza di distribuzione statistica della concentrazione emoglobinica corpuscolare media Indice di Anisocromia HDW ( % ) = DS / MCHC x 100

16 MCV CHCM 60 fl 120 fl 28 g/dl 41 g/dl RDW Anisocitosi Fisiologica HDW Anisocromia Fisiologica

17 INDICI PIASTRINICI (a) MPV : esprime la media analitica dei volumi piastrinici ( non esiste un MPV normale, ma l MPV normale per quel numero di piastrine ) più rallentato è il tasso di produzione delle piastrine più basso è l MPV MPV : piastrinopenie centrali MPV : piastrinopenie periferiche ( in rapporto alla velocità di produzione )

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19 INDICI PIASTRINICI (b) PTC (%): esprime la massa piastrinica per unità di volume di sangue -Rappresenta la massa emostatica attiva ed è il vero indice del reale rischio di sanguinamento PDW : esprime l anisocitosi piastrinica -Rappresenta la distribuzione volumetrica delle piastrine (utile nella diagnostica delle mielodisplasie)

20 V O L U M E Reticolociti Neociti Normociti Gerociti Sferociti Densità (concentrazione Hb)

21 Macrocitiche ipocromiche Macrocitiche normocromiche Macrocitiche ipercromiche Normocitiche ipocromiche Normocitiche normocromiche Normocitiche ipercromiche Microcitiche ipocromiche Microcitiche normocromiche Microcitiche ipercromiche

22 Sindrome Mieloproliferativa LMMC LMMC Sindrome Mielodisplastica

23 L osservazione del vetrino permette di confermare o contraddire i numeri forniti dai contaglobuli: -conta leucocitaria falsamente alta per la presenza di eritroblasti in circolo -falsa piastrinopenia da aggregazione -falsa piastrinosi da frammenti eritrocitari o per marcata microcitemia

24 La strumentazione ematologica non fa diagnosi. I I punti di contatto fra i numeri forniti dai moderni analizzatori e lo studio morfologico delle emazie permettono una diagnostica completa che libera il morfologo dalla ripetitività della routine integrando i dati forniti dalle misurazioni automatiche con le qualità della memoria, dell intuizione e della fantasia.

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26 L ESAME EMOCROMOCITOMETRICO Necessità di orientarsi bene fra le tante sigle e numeri dei moderni contaglobuli elettronici Necessità di individuare un numero non elevato di parametri informativi per il sospetto diagnostico

27 Una corretta interpretazione dei dati forniti dall esame emocromocitometrico deve tener conto delle variazioni proprie delle varie età, dal periodo neonatale all adolescenza.

28 E presente:- anemia, poliglobulia? - leucocitosi, leucopenia? - piastrinosi, piastrinopenia? Sono interessate più linee cellulari?

29 Globuli Rossi Globuli Bianchi Piastrine Aplasia Anemia Poliglobulia Leucopenia Leucocitosi Piastrinopenia Piastrinosi

30 Cosa ci indicano i globuli rossi Numero: valore assoluto ematocrito reticolociti Emoglobina Indici eritrocitari (MCV, MCH, MCHC, RDW, HDW) Morfologia

31 Reticolociti Globuli Globuli Rossi Rossi circolanti che che contengono residui residui di di organuli citoplasmatici (soprattutto di di derivazione ribosomiale); questi questi ultimi ultimi precipitano per per effetto effetto dei dei coloranti sopravitali, formando un un reticolo di di granuli granuli e e filamenti basofili basofili che che è è alla alla base base della della loro loro denominazione.

32 Eritroblasti Eritroblasti Ortocromatici Ortocromatici Reticolociti Reticolociti Midollari Midollari Tempo Tempo di di Permanenza Permanenza giorni giorni Barriera Barriera EMATO- EMATO- MIDOLLARE MIDOLLARE Reticolociti Reticolociti nel nel Sangue Sangue Periferico Periferico Tempo Tempo di di permanenza permanenza giorni giorni La La determinazione dei dei reticolociti permette una una valutazione della eritropoiesi senza il il ricorso a manovre invasive

33 Contengono RNA RNA (colorazioni sopravitali con con blu blu di di metilene o blu blu di di Cresile) Possono avere avere un un diverso contenuto di di RNA RNA (cioè (cioè un un diverso contenuto di di granuli e filamenti) e un un diverso volume in in rapporto al al loro loro grado grado di di maturazione Sono Sono più più grandi grandi dei dei globuli globuli rossi rossi MCVr MCVr > MCVgbr

34 RETICOLOCITI Microscopio ottico: incubazione con coloranti vitali (blu di metilene) ) in grado di legare l RNA ribosomiale

35 Metodi citofluorimetrici Usano Usano coloranti fluorescenti che che sono sono eccitati eccitati ad ad una una data data lunghezza d onda d onda ed ed emettono ad ad una una lunghezza d onda d onda maggiore RBC Reticolociti PLT

36 RETICOLOCITI Contaglobuli in citometria a flusso: i metodi automatizzati sono in grado di dare il conteggio totale* e la loro suddivisione in tre classi (L, M, H*), in rapporto al grado di maturazione, al volume ed all emoglobinizzazione *Un aumento dei reticolociti totali e di quelli H (immaturi) si ritrova in seguito ad un forte stimolo eritropoietinico ed è indice di una anticipata immissione in circolo

37 CONTA RETICOLOCITI CON CITOMETRI A FLUSSO (coloranti fluorescenti tipo arancio di tiazolo) MCVr (110 fl 20%>GR) CHCM (MCHC; 20% <GR) CH (MCH)contenuto Hb

38 Fattori che interferiscono con la conta automatica dei reticolociti Elevato numero di leucociti o piastrine Eritroblasti nel sangue periferico Corpi di Heinz (emoglobine atipiche) Malaria Emolisi Farmaci fluorescenti (angiografie)

39 L M H RMI RMI = Reticulocyte Maturity Index Index Nei Nei diversi diversi studi studi è stato stato usato usato come: come: intensità media media di di tutta tutta la la popolazione reticolocitaria reticolociti ad ad elevata elevata Fluorescenza o Assorbimento reticolociti a media media ed ed elevata elevata fluorescenza o assorbimento, che che alla alla fine fine sono sono stati stati definiti come come IRF IRF = Immature Reticulocyte Fraction

40 RETICOLOCITI BASSA INTENSITA DI FLUORESCENZA L F R % MAGGIORE INTENSITA DI FLUORESCENZA M F R H F R % 1-2 %

41 Valore Clinico del IRF Monitoraggio della rigenerazione del midollo dopo: Trapianto (BM o PBSC transplantation) Chemioterapia Determinazione del tempo per la la raccolta di di cellule staminali dal sangue periferico (dopo fattori di di crescita e/o chemioterapia)

42 RETICOLOCITI VALORE ASSOLUTO: -Ret. ( x 10 9 / l ) = Ret.. (%) x RBC ( / l ) / 100 INDICE RETICOLOCITARIO : -IR = Ret.. ( % ) x HGB ( %) / 15 ( Hb adulti normali ) INDICE DI PRODUZIONE RETICOLOCITARIA : -IPR = IR x Fs (*) espressione di attività eritropoietica: : pool di reticolociti immessi in circolo prematuramente * fattore di shift = 3,25 ( 0,15 x HGB )

43 Un valore di emoglobina < 2 DS (3 centile) per l età ed il sesso configura lo stato di Anemia

44 ANEMIA microcitica normocitica macrocitica

45 ANEMIE MICROCITICHE - DISORDINI DEL METABOLISMO DEL FERRO Anemia sideropenica Ridotto apporto Alterato assorbimento Perdite Anemia da disordine cronico Malattie infiammatorie croniche Malignomi - DISORDINI SINTESI DELL EME - DISORDINI SINTESI DELLE GLOBINE Anemie sideroblastiche Talassemie Ereditarie, secondarie (farmaci, alcool, piombo) idopatiche

46 - - DIAGNOSI DIFFERENZIALE DELLE ANEMIE MICROCITICHE Stato marziale Anemia sideropenica Anemia da disordine cr. Avvelenamento da Pb Sindromi talassemiche - Sideremia N - Transferrina N N - Transferrina sat. (%) N N - Ferritina N N - Zn-Protoporfirina N N - Recettore solubile della transferrina N N N

47 RDW (Red Distribution Width) È un un valore statistico corrispondente alla alla DS DS o al al CV CV della distribuzione dei dei Globuli Rossi. Equivale all all Indice di di Anisocitosi RDW Normale < 15,5% RDW Elevato 18 % RDW Molto Elevato 35 %

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50 Tests di conferma ANEMIA NORMOCITICA Reticolociti Leucociti piastrine normali: CDA 2 AdDC Ipotiroidismo Ipopituitarismo PRCA Leucociti e piastrine normali o M. renali Farmaci Infezioni-Splenomegalia Leucociti e piastrine Aplasia midollare acquisita Leucemia Alterata Negativo Morfologia eritrocitaria Emorragie? NO Test di Coombs Normale Positivo Anemie emolitica autoimmune Agoaspirato midollare Deficit enzimatici Hb instabili

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52 ANEMIA MACROCITICA Con midollo megaloblastico: - Deficit vit.b12, ac.folico, orotico-aciduria,, anemia tiamino- sensibile Senza midollo megaloblastico - Anemia aplastica acquisita, anemia di Fanconi, anemia di Blackfan-Diamond, diskeratosi congenita, CAD I e III, epatopatie, osteopetrosi

53 ANEMIE MACROCITICHE CARENZA DI VIT.B12: CARENZA DI FOLATI: Difetto di assorbimento Inadeguata nutrizione Difetto di trasporto Difetto di metabolismo Difetto di assorbimento Inadeguata nutrizione Aumentata richiesta Inibitori di folati Difetto di sintesi purine e pirimidine EPATOPATIE IPOTIROIDISMO A. DI FANCONI A. DI BlACKFAN-DIAMOND A. DISERITROPOIETICA I DISERITROPOIETICA III ALTRE CAUSE

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55 LEUCOCITOSI FALSA VERA aggregati piastrinici crioglobuline

56 Infezioni: CAUSE DI LINFOCITOSI pertosse, mononucleosi infettiva, epatite, cytomegalovirus, toxoplasmosi, lue, brucellosi, molte comuni malattie virali M. Emato-oncologiche: Varie: leucemie, neutropenie (linfocitosi relativa) tireotossicosi, m. di Addison (linfocitosi relativa)

57 CAUSE DI LINFOPENIA Infezioni: Collagenopatie: tbc in fase attiva, alcuni casi di malaria LES, enterite regionale M.emato-oncologiche: m. di Hodgkin, anemia aplastica, alcuni tumori solidi Alcune sindromi da immunodeficienza Perdita: linfagectasia intestinale Disordini endocrini: iperadrenalismo

58 NEUTROPENIA Fra le due settimane e la fine del primo anno il limite inferiore è di 1.000/mL Succesivamente > 1.500/mL Neutropenia lieve /ml moderata /mL grave < 500/mL Tale classificazione può essere utile per predire il rischio di infezione, poichè solamente i pazienti con neutropenia grave e prolungata hanno una particolare suscettibilità alle infezioni molto gravi (batteri endogeni, infezioni nosocomiali)

59 CAUSE DI NEUTROPENIA (a) DIFETTI INTRINSECI DELLE CELLULE MIELOIDI O DEI LORO PROGENITORI -Disgenesia reticolare -S. di Kostmann -Neutropenia ciclica -Diskeratosi congenita -Anemia di Fanconi -S. di Chediak-Higashi -Aplasia midollare

60 CAUSE DI NEUTROPENIA (b) FATTORI ESTRINSECI -Infezioni virali: epatite A-B, VRS, varicella, morbillo, rosolia -Infezioni batteriche: tifo, paratifo, tbc, brucella -Farmaci: analgesici, antinfiammatori, antibiotici, anticonvulsivanti, tranquillanti -Neutropenia autoimmune -Neutropenia immune neonatale -Infiltrazione midollare

61 CAUSE DI NEUTROFILIA (a) AUMENTATA PRODUZIONE -Infezioni croniche -Infiammazioni croniche -Malattie mieloproliferative -Farmaci -Neutrofilia cronica idiopatica -Reazioni leucemoidi

62 CAUSE DI NEUTROFILIA (b) AUMENTATO RILASCIO DAL POOL MIDOLLARE -Steroidi, stress, ipossia, infezioni acute RALLENTATA ELIMINAZIONE DAL CIRCOLO -Steroidi, splenectomia, attività fisica, epinefrina

63 Disordini associati con monocitosi o monocitopenia Monocitosi Patologie oncoematologiche (linfomi, leucemie ecc) Collagenopatie (LES, miosite, artrite reumatoide ) Malattia granulomatosa Infezioni (protozoi, Tbc,brucellosi sifilide ) Alcune neoplasie Varie (postsplenectomia, avvelenamento tetracloroetano ) Monocitopenia Somministrazione di glucocorticoidi Infezioni associate a tossiemia

64 Disordini associati con basofilia e basofilopenia Basofilia Reazioni di ipersensibilità (farmaci, orticaria ) Infezioni (sinusite cronica, varicella ) Malatie oncoematologiche (alcune a. emolitiche, linfomi, leucemia ) Endocrinopatie ( ipotiroidismo) Ovulazione, gravidanza Basofilopenia Somministrazione di glucocorticoidi Tireotossicosi

65 Disordini associati con eosinofilia Reazioni allergiche (asma, febbre da fieno, reaioni a farmaci, orticaria ) Dermatiti ( pemfigo, dermatite erpetiforme, dermatite atopica ) Infezioni parassitarie e non: (toxocara, elminti echinococco, clamidia ) Neoplasie ( cerebrali, linfomi, disordini mieloproliferativi..) Eosinofilia congenita Varie (connettiviti, s. di Loffler )

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67 PIASTRINOPENIA Il conteggio delle piastrine è il dato più facilmente soggetto ad errore nell ematologia di laboratorio -VERA - FALSA: coaguli micro-macroaggregati piastrinici trombocitopenia EDTA-dipendente

68 Piastrinopenia Aumentata distruzione trombocitopenie immunomediate (PTI, disordini autoimmuni, HIV, trombocitopenia neonatale, farmaci.) trombocitopenie non immunomediate (postinfettiva, microangiopatia trombotica, sindrome uremico-emolitica, farmaci, cardiopatie congenite, CID, ) Diminuita produzione Disordini ereditari ( A. di Fanconi, TAR, Discheratosi congenita, May-Hegglin, Wiskott-Aldrich,.) Patologie acquisite ( Anemia aplastica, MDS, infiltrazione midollare, osteopetrosi..) Sequestro

69 INDICI PIASTRINICI (a) MPV : esprime la media analitica dei volumi piastrinici ( non esiste un MPV normale, ma l MPV normale per quel numero di piastrine ) più rallentato è il tasso di produzione delle piastrine più basso è l MPV MPV : piastrinopenie centrali MPV : πιαστρινοπενιε περιφεριχηε ( ιν ραππορτο αλλα ϖελοχιτ δι προδυζιονε )

70 MPV AUMENTATO: - piastrinopenie autoimmuni - macrotrombocitosi mediterranea - m. mieloproliferative - splenectomia - s. di Bernard-Soulier -s. di May-Hegglin MPV DIMINUITO: - ipersplenismo - anemia megaloblastica - chemioterapia - aplasie midollari - s. di Wiskott-Aldrich

71 Piastrinosi (a) Asplenia Falsa piastrinosi (microsferociti, microciti, frammenti eritrocitocitari) Primitiva (tormbocitemia essenziale, policitemia vera, LMC, metaplasia)

72 Secondaria Piastrinosi (b) -disordini infiammatori ( infezioni acute e croniche, artrite reumatoide, sarcoidosi, m. di Kawasaki ) -disordini ematologici ( carenza marziale, a. emolitiche croniche, deficit vit.e, emorragia acuta ) -disordini neoplastici ( linfoma, neuroblastoma, altri tumori solidi ) -farmaci ( corticosteroidi, vincristina, ) -varie (esercizio fisico, interveno chirurgico, m. di Caffey)

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74 C.M. : M 6 mesi Carenza Marziale Alimentazione precoce con latte vaccino Marcato pallore Tachicardia No. DATA: 09/5/03 WBC 9.4x10 3 /µl RBC 2.68x10 3 /µl HGB g/dl HCT % MCV fl MCH pg MCHC g/dl PLT 484x10 3 /µl Limph 7.3x10 3 /µl MxD 0.9x10 3 /µl Neut 1.2x10 3 /µl RDW-CV % PDW 16.7 fl MPV fl P-LCR 35.0 %

75 R.O. : F 5 mesi Morbo di Cooley all esordio Marcato pallore Dispnea Difficoltà ad alimentarsi Epatosplenomegalia No. DATA: 11/2/02 WBC 12.8x10 3 /µl RBC 2.32x10 3 /µl HGB g/dl HCT % MCV 67.9 fl MCH 25.0 pg MCHC 36.8 g/dl PLT 382x10 3 /µl Limph 8.5x10 3 /µl MxD 1.0x10 3 /µl Neut 3.3x10 3 /µl RDW-CV % PDW fl MPV 7.8 fl P-LCR 29.9 %

76 P.A. : M 6 mesi Anemia emolitica autoimmune Marcato pallore Epatosplenomegalia Urine ipercromiche Coombs diretto, indiretto positivo No. DATA: 30/04/01 WBC 7.7x10 3 /µl RBC 1.16x10 3 /µl HGB g/dl HCT % MCV fl MCH 33.6 pg MCHC 26.4 g/dl PLT 282x10 3 /µl Limph 2.8x10 3 /µl MxD 0.6x10 3 /µl Neut 4.3x10 3 /µl RDW-CV % PDW fl MPV 8.6 fl P-LCR 16.7 %

77 C.M. : F 15 anni Crisi aplastica da Parvovirus B19 in paziente con CDA II Pallore Astenia Splenomegalia Urine normocromiche No. DATA: 17/4/03 WBC - 2.4x10 3 /µl RBC x10 3 /µl HGB g/dl HCT % MCV 80.6 fl MCH 29.4 pg MCHC 36.4 g/dl PLT 186x10 3 /µl Limph 0.8x10 3 /µl MxD 0.3x10 3 /µl Neut 1.3x10 3 /µl RDW-CV 15.6 % PDW fl MPV 8.8 fl P-LCR 19.9 %

78 D.S.V. : M 1 anno e 7 mesi Crisi emolitica da deficit di G6PD Ittero marcato Urine ipercromiche Astenia No. DATA: 14/3/03 WBC x10 3 /µl RBC x10 3 /µl HGB g/dl HCT % MCV 88.1 fl MCH 32.1 pg MCHC 36.4 g/dl PLT 230x10 3 /µl Limph + 8.7x10 3 /µl MxD 1.0x10 3 /µl Neut +13.0x10 3 /µl RDW-CV % PDW 16.2 fl MPV fl P-LCR 15.7 %

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