IDENTIFICAZIONE BIOCHIMICA

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1 Calsystem

2 La determinazione del profilo biochimico di un microrganismo è il metodo più comunemente utilizzato per l identificazione microbiologica. Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzano le tecniche della microbiologia classica e non prevedono l impiego di particolari attrezzature.

Si tratta di test di facile esecuzione che utilizzano le tecniche della

3 Il microrganismo da identificare viene coltivato su substrati diversi costituiti da fonti di carbonio specifici, verificando la capacità del microrganismo di utilizzarli e trasformarli. L insieme di queste informazioni traccia un profilo biochimico tipico di quell organismo che viene confrontato con i profili noti arrivando così alla sua identificazione.

4 FERMENTAZIONE DEI CARBOIDRATI Produzione di acidi e/o gas durante la crescita per la fermentazione degli zuccheri Terreno liquido con il carboidrato e un indicatore di ph (rosso fenolo) Differenziare gli enterobatteri

zuccheri Terreno liquido con il carboidrato e un

5 UTILIZZAZIONE DEL CITRATO La utilizzazione del citrato come unica fonte di carbonio determina una alcalinizzazione del terreno Terreno liquido con l aggiunta di citrato e un indicatore di ph (blu di bromotimolo) Differenziare Klebsiella o Enterobacter da Escherichia o Salmonella

liquido con l aggiunta di citrato e un indicatore di ph (blu di

6 DECARBOSSILASI La decarbossilasi di amminoacidi libera CO2 e ammine Terreno arricchito di amminoacidi (lisina, ornitina, arginina) con l indicatore Porpora di bromocresolo che vira al violetto se l enzima è attivo Determinare il gruppo batterico tra gli enterobatteri

arginina) con l indicatore Porpora di bromocresolo che vira al

7 B-galattosidasi (ONPG) La B-galattosidasi idrolizza lonpg l ONPG (o-nitrofenil-b- galattoside a nitrofenolo di colore giallo Terreno contenente ONPG. Se l enzima è presente il pozzetto vira al colore giallo Differenziare Citrobacter e Arizona (+) da Salmonella (-). Identificazione di alcune shigelle e Pseudomonas

ONPG. Se l enzima è presente il pozzetto vira al colore giallo Differenziare

8 LIQUEFAZIONE DELLA GELATINA Molti batteri posseggono proteasi e idrolizzano la gelatina Al brodo nutritivo si aggiunge gelatina al 12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche dopo raffreddamento. Aiuta nell identificazione di molti batteri enterici

12%. Se la gelatina è idrolizzata il terreno rimane liquido anche

9 PRODUZIONE DI H 2 S L idrogeno Lidrogeno solforato viene prodotto in seguito a degradazione di amminoacidi contenenti gruppi solforici o dalla riduzione del tiosolfato Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come solfuro di ferro (nero) in caso di produzione di H 2 S. Aiuta nell identificazione di molti batteri enterici

tiosolfato Il terreno viene arricchito con ferro che precipita come solfuro di

10 INDOLO Il triptofano presente nelle proteine è convertito ad indolo La presenza di indolo è evidenziata dall aggiunta al terreno di dimetilaminobenzaldeide Permette di differenziare Escherichia (+) da Klebsiella /enterobacter

dall aggiunta al terreno di dimetilaminobenzaldeide

11 ROSSO METILE Batteri fermentanti che producono una miscela di acidi sufficiente ad abbassare il ph al di sotto di 4.3 Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione l indicatore Rosso Metile Permette di differenziare Escherichia (rossa) da Klebsiella /enterobacter (gialle)

3 Al terreno glucosato viene aggiunto dopo incubazione l indicatore

12 RIDUZIONE DEL NITRATO Il nitrato può fungere da accettore di elettroni (respirazione anaerobia) riducendosi a nitrito o azoto Brodo nutritivo con nitrato. Dopo incubazione la presenza di nitriti i i è evidenziata i dall aggiunta di a-naftilammina/acido fil i id solfanilico che produce un colore rosso in presenza di nitriti Aiuta a differenziare molti batteri enterici di solito positivi

Dopo incubazione la presenza di nitriti i i è evidenziata i dall aggiunta di

13 FENILALANINA DEAMINASI La deaminazione produce acido piruvico. Terreno arricchito in fenilalanina. Dopo la crescita l aggiunta di cloruro ferrico determina una colorazione verde Caratterizza il genere Proteus e il gruppo Providencia

Dopo la crescita l aggiunta di cloruro ferrico determina

14 IDROLISI DELL AMIDO La soluzione Iodio/iodurata (LUGOL) dà un colore blu in presenza di amido. I batteri sono fatti crescere in un terreno agarizzato contenente amido. Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale eetuaezona oadc di chiarificazione ca oeintorno oaecoo alle colonie Aiuta a identificare batteri capaci di idrolizzare l amido ad esempio Bacillus

Dopo incubazione si inonda la piastra con liquido di Lugol e si guarda la eventuale eetuaezona oadc

15 UREASI L urea viene scissa in ammoniaca e CO2 Terreno contenente urea al 2% e fenolo come indicatore di ph Permette di distinguere Klebsiella(+) da Escherichia (-)

16 VOGES-PROSKAUER (VP) L acetoina Lacetoina viene prodotta dalla fermentazione dello zucchero Aggiunta del reattivo a-naftolo dopo incubazione. In caso di positività si sviluppa un colore rosso Permette di distinguere Klebsiella(+) e Enterobacter (+) da Escherichia (-). Caratterizza i ceppi di Bacillus

17 Questi metodi si sono evoluti nel tempo fino ad arrivare a sistemi semi-automatici, addirittura automatici, che permettono di effettuare contemporaneamente un elevato numero di prove biochimiche e confrontarle con database molto ampi, mediante codici numerici.

di effettuare contemporaneamente un elevato numero di prove

18 L identificazione di ogni e qualsiasi batterio richiederebbe un elevato numero di test biochimici di faticosa esecuzione e di difficile interpretazione. I pannelli (o gallerie) vengono organizzati a seconda dei gruppi batterici o lieviti da ricercare in funzione, intanto, dell origine del campione e in funzione di prove preliminari di orientamento.

I pannelli (o gallerie) vengono organizzati a seconda dei gruppi batterici o lieviti da

19 Frequenza dei patogeni urinari i Escherichia coli 75% Gram Proteus 10% Gram Klebsiella Gram 90% Enterobacter 5% Gram Serratia Gram Staphylococcus 5% Gram + Streptococcus 3% Gram + Pseudomonas 2% Gram

Enterobacter 5% Gram Serratia Gram Staphylococcus

20 Un pannello di identificazione per batteri urinari conterrà le prove biochimiche adatte a discriminare le specie elencate nella tabella precedente.

21 Questa procedura richiede, però, un pannello per ogni tipologia di campione per la probabilità diversa della presenza di una determinata specie. L orientamento attuale è di disporre di soli due pannelli con un numero più significativo di prove biochimiche (e non solo), uno per Grame uno per i Gram+. Un terzo pannello da dedicare esclusivamente ai lieviti ed ai funghi.

22 Prove preliminari di orientamento 1. Colorazione di Gram Discrimina i batteri in Gram+ e Gram- 2. Test KOH E alternativa alla colorazione di Gram. I lipidi presenti nella parete dei Gram- vengono disciolti dal KOH dando luogo ad una sostanza mucosa filante all ansa. I Gram+ non mostrano alcun cambiamento. 3. Catalasi La catalasi è un enzima capace di scindere l acqua ossigenata in acqua ed ossigeno. Per distinguere Staphylococcus (+) da Streptococcus (-) 4. Ossidasi La ricerca dell enzima citocromo-ossidasi si esegue aggiungendo una goccia di tetrametil-p-fenilendiammina sulla colonia o su una colonia trasferita su una striscia di carta. Si sviluppa un colore rosa>viola Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas Serve a discriminare gli enterobatteri dagli Pseudomonas 5. Emolisi Per distinguere gli alfa dai beta-emolitici

23 L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE

24 L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE

25 L evoluzione dei sistemi ENTEROTUBE

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