Qual è la natura del gene? Il gene controlla uno o più caratteri (fenotipo) - Qual è la struttura del gene? Il gene e fatto di DNA - Cosa produce un
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- Eleonora Di Stefano
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1 La funzione del DNA
2 Qual è la natura del gene? Il gene controlla uno o più caratteri (fenotipo) - Qual è la struttura del gene? Il gene e fatto di DNA - Cosa produce un gene?
3 I geni specificano la struttura delle proteine -Il fenotipo di una cellula e determinato dalla natura chimica cellulare, controllata da proteine ed enzimi -La funzione di un enzima e determinata dalla sua sequenza aminoacidica - Gli enzimi di una cellula sono determinati dal genotipo cellulare - I geni specificano la sequenza lineare degli aminoacidi
4 Garrod aveva gia osservato che alcuni difetti metabolici che influiscono sulle reazioni chimiche fondamentali hanno natura ereditaria e recessiva Alcaptonuria Blocco nella via metabolica dell acido omogentisico Ereditato come carattere recessivo
5 Correlazione tra gene e disfunzione metabolica Gene mutante->blocco metabolico
6 Gli esperimenti di Beadle & Tatum chiarirono la funzione del gene
7 Le vie di biosintesi A B C D Materiale di partenza Intermedi di reazione Prodotto finale A B Interruzione della via metabolica -Se somministro il composto 2 non avro il prodotto 5 -Se somministro il composto 3 avro il prodotto 5 C D
8 G E D C B A Composto testato mutante In quale ordine intervengono i composti A-E lungo la via metabolica? E->A->C->B->D->G
9 Beadle & Tatum: un gene un enzima Mutanti di Neurospora Crassa: genoma aploide
10 Isolamento di mutanti auxotrofi incapaci di crescere su terreno minimo, a meno che non vengano aggiunti al mezzo di coltura uno o piu nutrienti specifici
11 Mutanti auxotrofi per l arginina Via biosintetica dell arginina I 3 mutanti selezionati avevano mutazioni mappate su cromosomi diversi arg-1, arg-2, arg-3 mutante Ornitina Citrullina Arginina arg arg arg
12 Modello biochimico -I geni controllano le reazioni biochimiche producendo enzimi -Ogni gene controlla uno specifico enzima
13 Beadle & Tatum Un gene un enzima
14 Relazione gene-proteina Geni-> acido desossiribonucleico Enzimi-> proteine
15 Proteine -> macromolecole composte di aminoacidi disposti in modo lineare Gruppo aminico Gruppo carbossilico
16 Aminoacidi
17 Le strutture delle proteine Primaria sequenza lineare Secondaria determinata da interazioni tra aminoacidi vicini Terziaria determinata da interazioni 3D tra gruppi R Quaternaria determinata dall interazione di piu catene polipeptidiche dette monomeri
18 Ogni proteina possiede una precisa sequenza aminoacidica che ne conferisce la funzione (Sanger) Enzimi proteolitici
19 Cromatografia bidimensionale (Sanger) Ogni macchia contiene piccoli polipeptidi separati nel fingerprint proteico
20 Il cambiamento di un solo aminoacido e sufficiente per alterare la funzione di una proteina Ingram (1957), studiando l emoglobina umana trovo che il fingerprint della HbS era differente da quello della HbA sana
21 Aminoacido diverso in posizione 6 nella HbS Emoglobina Normale HbA Emoglobina S HbS ha una valina in posizione 6 al posto dell acido glutamico L alterazione di una aminoacido nella proteina può alterare la funzione della proteina stessa
22 La funzione dell Emoglobina
23 Una mutazione nel gene si riflette in una mutazione nella proteina
24 Che relazione c è fra geni alterati e proteine alterate? Yanofsky sistema modello E.Coli
25 Yanofsky indago la relazione tra geni alterati e proteine alterate Studiando la triptofano sintetasi di E.Coli, analizzo le mutazioni nel gene TrpA che portavano all alterazione della subunita A, ottenendo una dettagliata mappa dei siti mutanti
26 Colinearita fra gene e proteina Come notato gia da Ingram, Yanofsky, sequenziando le proteine mutanti della subunita A, trovo un esatta corrispondenza tra i siti mutazionali sulla mappa genica di TrpA e la posizione degli aminoacidi alterati nella catena del polipeptide A
27 La funzione degli enzimi Un aminoacido mutato puo interferire con la normale architettura dell enzima determinando una proteina non funzionale
28 Proteine mutanti condizionali Gli alleli mutanti temperatura sensibili producono proteine mutate che sono funzionali alle temperature PERMISSIVE, ma non funzionali alle temperature piu alte o piu basse dette RESTRITTIVE
29 un gene un polipeptide Gene mutato Polipeptide alterato
30 La teoria delle perle Fino agli anni 50 si riteneva che: un cromosoma fosse composto di una sequenza lineare di geni il gene fosse un unità indivisibile da crossing over che invece avviene solo tra geni il gene cambia in toto e non contiene unità più piccole che possono cambiare il gene funziona solo se integro, mentre le sue parti non sono funzionali
31 Gene-> unità indivisibile di struttura e funzione
32 Benzer : la ricombinazione intragenica e la struttura fine del gene Sistema modello: fago T4
33 Componenti del fago T4
34 Ciclo vitale E.Coli del fago T4 Ciclo litico
35 La lisi delle cellule batteriche da parte dei fagi T4 determina la formazione di placche di lisi su soft agar
36 Fagi mutanti rii I mutanti r sono mutanti a lisi rapida Ceppo di E. Coli Ceppo di T4 rii rii+ B placche grandi e tonde piccole irregolari K (λ) assenza di placche piccole irregolari permissivo non permissivo
37 Fagi mutanti rii Isolamento di 8 ceppi mutanti per il locus rii
38 Doppia infezione di cellule E.Coli B con ceppi mutanti: ricombinazione intragenica I ricombinanti andranno a lisare il ceppo K Piastramento della progenie fagica su ceppo K
39
40 La ricombinazione può avvenire anche tra siti all interno del gene stesso. Questi siti furono all epoca chiamati reconi frequenza di ricombinazione tra due alleli = Placche ricombinanti rii + x 2 totale progenie (numero di placche presenti sul ceppo B) Le placche dei ricombinanti rappresentano ½ della frequenza di crossing over intragenica tra 2 alleli mutati rii. I ricombinanti reciproci sono i doppi mutanti che non crescono su E. Coli K
41 Sistema degli incroci di T4 rii di Benzer Sistema potente che permette di determinare la ricombinazione intragenica Poteva determinare un ricombinante ogni 10 9 fagi della progenie, impensabile con sistemi di Drosophila e topo
42 Ricombinazione intragenica: i geni possono essere divisi nella ricombinazione rii1 rii2 wt Anche se il gene rappresenta un unita funzionale, e suddivisibile in una serie lineare di siti che possono mutare e ricombinare. La piu piccola unita di mutazione e ricombinazione e rappresentata dalla singola coppia di nucleotidi
43 Analisi della struttura fine del locus rii di T4 Mutanti per delezione per mappare i siti di mutazione locus rii Mutanti per delezione
44 Mutanti per delezione Non possono ricombinare con mutazioni puntiformi sovrapposte NON si forma il WT
45 Due delezioni NON sovrapposte possono invece ricombinare
46 Le mappe per delezione sono utili per individuare regioni del gene con mutazioni puntiformi x Mutante per delezione D1 Mutanti 1->8 Non si producono rii + x Mutante per delezione D2 Mutanti 5->12 Non si producono rii +
47 Le mappe per delezione sono utili per individuare regioni del gene con mutazioni puntiformi
48 Identificazione di 3 aree del gene rii Mutante D1 x mutante x-> rii+ Mutazione nell area iii Mutante D2 x mutante y-> rii+ Mutazione nell area i
49 Distribuzione delle 1612 mutazioni spontanee nel locus rii. Si osservano dei siti che presentano identiche mutazioni, molto piu numerose di altri e vengono chiamati HOT SPOTS Siti maggiormente mutabili
50 Il gene consiste in una serie lineare di sub-elementi suscettibili di mutazione (coppie di nucleotidi)
51 HOT SPOTS Siti di DNA in cui avvengono lesioni spontanee come deaminazioni di citosina o 5-Metilcitosina
52 TEST DI COMPLEMENTAZIONE Il locus rii e formato da 2 geni adiacenti riia e riib detti CISTRONI Un solo ciclo di infezione Infezione mista di batteri E.ColiK in cui i mutanti rii non possono crescere. Se c e complementazione c e anche lisi batterica I prodotti di riia e riib si associano in trans Diploidia temporanea
53 TEST DI COMPLEMENTAZIONE l locus rii e formato da 2 geni adiacenti riia e riib detti CISTRONI
54 Mappa genica del locus rii Cistrone A Cistrone B Cistrone= la regione genetica all interno della quale non c è complementazione tra mutazioni, unita funzionale definita con il test di complementazione, o anche detto gene
55 Differenze tra ricombinazione e complementazione ricombinazione T4 (1) T4 (2) riia complementazione riib Genotipi nuovi differenti dai parentali T4 (1) T4 (2) riia riib Genotipi identici ai parentali
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