Le proteine III. Corso di Biochimica 1. Prof. Giuseppina Pitari

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1 Le proteine III Corso di Biochimica 1 Prof. Giuseppina Pitari

2 Ossi-mioglobina legame idrogeno lato distale

3 La mioglobina L eme quindi consiste di una struttura organica alla quale è legato un atomo di Ferro nel suo stato ferroso. Gli atomi di azoto che coordinano il ferro ne prevengono l ossidazione a ferro-ferrico: infatti il ferro + lega reversibilmente l ossigeno ma il Ferro +3 no. L eme al di fuori della proteina viene velocemente ossidato a ferro +3 (le due posizioni di coordinazione sono ambedue libere), l inserimento nella tasca della proteina rende le posizioni di coordinazione meno accessibili e ne previene l ossidazione. Infatti uno dei due legami di coordinazione è occupato dall istidina prossimale e l altro sarà occupato dall ossigeno.

4 La mioglobina Quando l ossigeno si lega al Ferro cambiano le le proprietà elettroniche del ferro nell eme che, infatti, assume una colorazione diversa. Questo succede anche nell emoglobina e, infatti, il sangue venoso è più scuro di quello arterioso. Alcune molecole possono legarsi all eme coordinandosi con maggiore affinità dell ossigeno, per esempio il CO. Sequestrando l eme all interno della proteina l affinità del CO viene diminuita. (vedere dopo)

5 La mioglobina Il legame tra ossigeno e mioglobina può essere studiato quantitativamente così come qualsiasi interazione proteina ligando. Da notare che la funzione della mioglobina non è solo quella di legare l ossigeno, ma anche di cederlo quando necessario.

6 La funzione di saturazione Y Y O p po + po 50

7 In generale possiamo descrivere una equazione se pensiamo ad una qualsiasi proteina P che si leghi al suo ligando L. P + L PL Ka [PL]/ [P] [L] Dove Ka è la costante di associazione. Se riarrangiamo l equazione:

8 Ka[L] [PL]/[P] possiamo dire che il rapporto tra la forma legata e libera della proteina è direttamente proporzionale alla concentrazione di ligando,quindi nel caso della mioglobina alla concentrazione di Ossigeno. Quando la concentrazione del ligando è molto più grande della concentrazione dei siti di legame, il legame del ligando a siti di legame della proteina non cambia apprezzabilmente la concentrazione del ligando libero che, quindi, rimane costante. Possiamo ora scrivere il rapporto tra i siti di legame per il ligando sulla proteina occupati e quelli totali e lo indichiamo con θ θ [PL]/[P] +[PL] Sostituendo [PL] con Ka. [L]. [P] otteniamo

9 θ θ Ka [L] [P] Ka [L] [P] + [P] Ka [L] + 1 θ [L] / [L] + 1/ka Ka [L] Il termine Ka può essere determinato da un grafico di θ vs la concentrazione di L. L equazione descrive un iperbole: x y /(y+z)

10 Quando x0,5 z ossia 1/ka, cioè k d y

11 La funzione di saturazione Y Y O p po + po 50

12 La funzione di saturazione Y: rapporto fra la concentrazione dei siti occupati dal legante e la concentrazione dei siti totali (occupati + liberi). Varia fra 0 ed 1. k ON Mb + O MbO k OFF K D k k OFF ON [siti occupati] [siti occupati] [MbO] Y O [siti totali] [siti occupati] + [siti liberi] [MbO ] + [Mb] K D [Mb] [O [ MbO ] ] K [ Mb] D [MbO] [O ] [MbO] 1 [O] YO K D K D [MbO ] [MbO ] 1 K D [O [O ] [O ] ]

13 La funzione di saturazione (in forme) Y O [ O ] [ ] po K + O p + po D 50 (dalla legge di Henry: [O ] k po ) p O Y 0.5 po La p 50 è una misura dell affinità che la Mb ha per l O Il Torr è una unità non-si di misura della pressione, equivalente ad un millimetro di mercurio (mmhg). È p

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15 La funzione di saturazione (in forme) Y O [ O ] [ ] po K + O p + po D 50 (dalla legge di Henry: [O ] k po ) p O Y 0.5 po La p 50 è una misura dell affinità che la Mb ha per l O p

16 Determinazione sperimentale della funzione di saturazione Gli spettri di assorbimento della ossimb e deossimb sono diversi MbO Mb

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18 Trasformazioni della funzione di saturazione (Hill) po po YO O p50 + po p50 + po 1 Y p O O 1 p + p Y O log log O 1 Y O ( p ) log( p ) 50 Y p O 50 O p equazione di Hill 50 p 50 log(p 50 )

19 Trasformazioni della funzione di saturazione (Hill) Y O log n log O 1 Y O ( p ) log( p ) La pendenza della retta (n) è detta coefficiente di Hill ed è unitaria nel caso della Mb e > 1 per la Hb (.8) 50 log(p 50 )

20 Al diminuire della affinità per il legante la curva di binding si sposta verso destra (maggiore p 50 ). grafico lineare grafico semilogaritmico Y minore affinità Y minore affinità po (torr) po (torr)

21 Esercizi 1) Calcolate il grado di saturazione della mioglobina con O se la pressione parziale dell ossigeno molecolare (po ) è di 1,.8 o 10 torr (p 50.8 torr) Y O p + 50 po po per po per po per po 1 torr 1 YO torr.8 YO torr 10 YO

22 ) Quanto O è ceduto dalla mioglobina se la po è diminuita da 100 a 5 torr (p 50.8 torr)? Quando la po 100 torr la Mb è satura di ossigeno per il 97.3 % Quando invece la po è abbassata a 5 torr essa è saturata per il 68.7% Y O Y O Ne segue che quando la po è abbassata da 100 a 5 torr la Mb cede il 8.6 % dell ossigeno ossigeno ceduto Y 0.6 Y po (torr) po (torr)

23 3) Calcolate la p 50 ed il coefficiente di Hill della mioglobina mutante His-E7-Gly di capodoglio dai seguenti dati sperimentali: po Y log po log(y/(1-y)) YO p 50 po + po Y log 1 Y log po log p 50

24 YO p 50 Y log 1 Y po + po log po log p 50 po Y log po log(y/(1-y)) p 50 p torr n 1 log p 50

25 Quale ruolo gioca l istidina distale E7? legame idrogeno Strategia: mutare l His E7 con altri amminoacidi

26 A k B Reazione del 1 ordine (monomolecolare) d[a] dt d[a] [A] k[a] ln[a] k t + Q [A] ln [A ] 0 d[b] dt d[a] k dt k dt [A] k t L equazione della velocità L equazione tempo integrata per t 0, A A 0 e Q ln[a 0 ] [A] [A 0 ]e k t Il decorso temporale è esponenziale [A ] 1 se [A] t 0 ln k Il tempo di dimezzamento

27 Il ferro ferroso nella mioglobina (emoglobina) tende ad ossidarsi a ferro ferrico spontaneamente Fe + k OSSIDAZION E Fe L autossidazione del ferro ferroso segue un andamento temporale esponenziale. ( + ) ( + Fe Fe ) 3+ 1 k OSSIDAZION E t t Il ruolo giocato dalla parte globinica della Mb (Hb) è quello di ritardare l ossidazione inevitabile del ferro. L His E7 è coinvolta in questo processo 0 e L ossidazione delle eme isolato è molto rapida k ln OSSIDAZIONE

28 k ON Mb + L MbL k OFF Fe k OSSIDAZIONE Fe + 3+ ( + ) ( + Fe Fe ) t 1 k ln 0 e OSSIDAZIONE k OSSIDAZIONE t

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30 1 t k ln OSSIDAZIONE Balena His E7: k OSSIDAZIONE h -1 1/ ln t 1.6 ore Balena mutante His-E7-Gly: k OSSIDAZIONE 44 s -1 1/ ln t ore 57 secondi 44

31 La struttura della proteina influisce sul legame dei ligandi La specificità con la quale l eme lega i ligandi è alterata quando l eme si trova nella proteina: il monossido di carbonio si lega all eme circa 0000 volte meglio di quanto fa l ossigeno (la K d o P 50 per il CO è 0000 volte più piccola di quella dell ossigeno). Questa differenza è solo parzialmente spiegabile tramite l ingombro sterico. Quando l ossigeno si lega all eme, l asse della molecola di ossigeno si trova a un angolo del legame Fe--O

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33 Quando l ossido di carbonio si lega all eme libero il Ferro, il Carbonio e l ossigeno si trovano su una linea retta

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35 Nella mioglobina l istidina E7 (64) è troppo lontana dall eme per coordinarsi nella sesta posizione di coordinazione ma può interagire con il ligando che si lega all eme. Questo residuo di istidina distale non influisce sul legame dell ossigeno con l eme ma preclude il legame lineare con l ossido di carbonio. Questo effetto è fisiologicamente molto importante.

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37 Il legame dell ossigeno all emoglobina dipende anche dai movimenti molecolari della struttura della proteina. Infatti l eme si trova sepolto nella struttura della proteina con nessun contatto diretto con l esterno e, quindi, con l ossigeno. Se la proteina fosse rigida non ci sarebbe modo per l ossigeno di raggiungere l eme. Tuttavia piccoli movimenti rapidi delle catene laterali degli amonocidi producono delle cavità transienti nella struttura della proteina che possono far entrare l ossigeno.