Crescita microbica e metodi di determinazione del numero di cellule

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1 Crescita microbica e metodi di determinazione del numero di cellule

2 2 Riproduzione per scissione binaria Fig. 6.1

3 3 La crescita microbica

4 4 Le proteine Fts e il piano di divisione Fts (proteine filamentose sensibili alla temperatura) Le proteine Fts sono state ritrovate in tutti i procarioti e Archaea; proteine simili sono presenti nei mitocondri e cloroplasti FtsZ presenta analogie strutturali con la tubulina L interazione delle proteine Fts porta alla formazione del DIVISOMA

5 5 Anello FtsZ e divisione cellulare. La localizzazione delle proteine FtsZ potrebbe essere mediata dalla proteina MinE la quale interagisce con i nucleoidi duplicati. Colorazione del nucleoide Colorazione FtsZ Somma delle due colorazioni Fig. 6.2

6 6 La forma cellulare e l actina nei procarioti La proteina fondamentale nel determinare la forma dei procarioti è MreB MreB forma un citoscheletro actino-simile I cocchi sembrano privi della proteina MreB, quindi la sua mancanza conferisce una forma sferica. MreB actina FtsZ tubulina

7 7 La sintesi del peptidoglicano e la divisione cellulare Le autolisine sono presenti nel divisoma, provocano piccole fessure nella struttura macromolecolare della parete a partire dall anello formato da FtsZ. Sulla superficie dei Gram+ la giunzione tra il peptidoglicano preesistente e quello di nuova sintesi forma un rilievo simile ad una cicatrice

8 8 Fig. 6.3

9 Bactoprenolo (undecaprenolfosfato): lipide coinvolto nel trasporto degli elementi peptidoglicanici della parete cellulare 9 Alcol a 55 atomi di carbonio Figura 6.4

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12 12 Batteri che mancano di parete cellulare Micoplasmi: Patogeni intracellulari obbligati. Sono pleomorfi (non hanno una forma definita) Forme L Sono cellule prive di parete, che può mancare in maniera parziale o totale (Streptobacillus monoliformis). Possono derivare da mutazioni spontanee o da particolari trattamenti (crescita in terreni osmoticamente tamponati contenenti penicillina). Come i micoplasmi, sono pleomorfi. La scomparsa di peptidoglicano fa si che i batteri non siano più in grado di sintetizzarlo. In questi caso rimangono in maniera stabile in questa forma. Altre forme L invece possono risintetizzare la parete, ritornando così a cellula normale. Si possono ottenere forme L sia da batteri Gram+ che da batteri Gram-.

13 13 La crescita microbica n Progressione geometrica in base 2

14 14 La crescita microbica Tempo di duplicazione = 30 min Crescita esponenziale

15 15 La crescita microbica NUMERO DI GENERAZIONI N 0 : n di batteri inoculati nel terreno nell istante iniziale N: n di batteri al termine di un dato intervallo di tempo t n: n di generazioni N = N 0. 2 n logn = logn 0 + nlog2 n = log N - logn 0 log2 n = 3.3(log N - logn 0 ) log2=0.301 n = 3.3 log N N 0

16 16 La crescita microbica TEMPO DI GENERAZIONE Corrisponde al tempo necessario per la duplicazione cellulare Si può calcolare dividendo il tempo per passare da N 0 a N per il n di generazioni t gen = t/n = t/3.3log(n/n 0 )

17 17 Curva di crescita Figura 6.8

18 18 Fase di latenza o fase lag Curva di crescita La durata di questo periodo è molto variabile e dipende da molti fattori quali 1) la composizione del terreno colturale di partenza e quella del terreno in cui vengono seminate. Infatti se cambia la fonte di carbonio la cellula dovrà sintetizzare gli enzimi necessari per metabolizzare i nuovi composti. 2) Temperatura. 3) Età della coltura seminata. 4) Numero delle cellule seminate Fase logaritmica o esponenziale In questa fase tutte le cellule si riproducono con un tempo di generazione costante determinato sia dalle caratteristiche genetiche del microrganismo sia da fattori ambientali Fase stazionaria Le cellule non sono più in grado di riprodursi. Ciò può essere dovuto a 1) esaurimento di uno dei componenti del terreno (fattore limitante), 2) accumulo di prodotti del metabolismo tossici, 3) raggiungimento del numero di cellule massimo Fase di mortalità Il numero delle cellule vitali diminuisce geometricamente in un processo inverso alla crescita.

19 19 Metodi di determinazione del numero di cellule METODI INDIRETTI Misura della quantità di azoto proteico: i batteri contengono circa il 14%di azoto in peso secco. Per utilizzare questa tecnica si devono raccogliere le cellule, liberarle dal terreno di coltura ed eseguire un analisi chimica Centrifugazione e valutazione del volume Determinazione del peso secco Determinazione di un metabolita (es. acido lattico per i lattobacilli) Torbidità della coltura: diffusione della luce dovuta all alto indice di rifrazione dei batteri

20 20 Metodi di determinazione del numero di cellule L assorbanza (A) è definita come il logaritmo del rapporto tra l intensità che colpisce la sospensione (I0) e quella trasmessa attraverso la sospensione A=log I0/I Figura 6.12

21 21 Figura 6.12

22 Metodi di determinazione del numero di Petroff-Hausser cellule 22 METODI DIRETTI Figura 6.9 Camere di conta: vetrini da microscopio recanti una quadrettatura e costruiti in modo che sia noto lo spessore di liquido che viene introdotto tra il vetrino ed il suo coprioggetto (camera di Thoma, camera di Petroff-Hausser). I limiti di questa tecnica sono: 1) incapacità di distinguere le cellule vive dalle cellule morte 2) concentrazione cellulare di almeno 10 6 cellule/ml

23 23 Metodi di determinazione del numero di cellule METODI DIRETTI : Coulter counter: la sospensione microbica viene forzata attraverso un piccolo foro (circa 30 micrometri). Un flusso di corrente elettrica viene fatta passare attraverso il foro, mentre gli elettrodi posti ai lati dell orifizio misurano la resistenza elettrica. Ogni volta che un microrganismo transita nell orifizio, si registra un aumento della resistenza elettrica (caduta di conducibilità) e viene contata. Si può quindi registrare sia il numero dei componenti di una popolazione microbica che la distribuzione delle dimensioni cellulari. Viene utilizzato soprattutto per la conta di cellule piuttosto grosse ed è molto sensibile alla presenza di particelle inerti (polvere). Anche in questo caso non si possono distinguere le cellule vive dalle cellule morte.

24 Metodi di determinazione del numero di cellule 24 Figura 6.10 METODI DIRETTI : Tecnica di conteggio su piastra: i risultati ottenuti con questa tecnica vengono espressi in termini di unità formanti colonia (CFU)

25 Metodi di determinazione del numero di cellule: IMP. DILUIZIONI SERIALI 25 Figura 6.11

26 26 METODI DIRETTI : Conta di colonie su membrane filtranti: questo metodo si utilizza quando si devono saggiare grandi volumi con una carica microbica bassa.

27 27 Metodi di determinazione del numero di cellule METODI DIRETTI : Time lapse: Cellule di una sospensione diluita, sono state depositate su un sottile strato di terreno YPD colato su un vetrino e ne è stata seguita la crescita al microscopio per 24 ore.

28 28 Quale terreno usare?

29 29 Effetto della concentrazione di nutrienti sulla velocità di crescita

30 30 Accrescimento sincrono Durante la fase di crescita le cellule non sono tutte uniformi, ne come dimensioni, ne come momento del loro metabolismo. Per studiare l accrescimento si dovrebbe seguire il destino di una singola cellula. Ciò non è possibile, ma è invece possibile sincronizzare una coltura. Esistono molti modi di sincronizzare una coltura; in ogni caso la sincronia dura solo per qualche generazione. Es Taglia cellulare (elutriatore o filtrazione) uso di mutanti di ciclo cellulare termosensibili uso di temperature subottimali uso di composti che inibiscono la progressione del ciclo cellulare (es.: nocodazolo, α- factor)

31 Crescita sincrona delle cellule in 31 coltura Coltura sincrona: coltura in cui ciascuna cellula è nelle stesso grado di divisione.

32 32 Crescita bilanciata e crescita sbilanciata La crescita esponenziale è un tipo di crescita bilanciata in quanto tutti i costituenti cellulari vengono prodotti a velocità costante. La crescita sbilanciata si ha invece quando la sintesi dei vari costituenti cellulari avviene a velocità diversa. Es. shift up una coltura batterica viene trasferita da un terreno povero di nutrienti ad un terreno più ricco. In questo caso le cellule producono più ribosomi per incrementare la sintesi proteica quindi si ha un aumento della sintesi di proteine e del DNA. Es. shift down una popolazione batterica viene trasferita da un terreno ricco ad un terreno povero di nutrienti. A questo punto è necessaria l attivazione delle vie biosintetiche

33 Efficienza della crescita: rese di crescita 33 Efficienza della crescita: efficienza di un microrganismo nel convertire un substrato in massa cellulare Resa di crescita: rappresenta l indice dell efficienza della conversione dei nutrienti in materiale cellulare y sub = massa dei microrganismi formati/massa del substrato consumato x max = massa cellulare ottenuta x 0 = peso delle cellule all inoculo y sub = x max - x 0 / moli di substrato utilizzate La resa di crescita viene spesso espressa in termini di grammi di cellule per grammo di substrato oppure grammi di cellule per mole di substrato (crescita molare). In terreni arricchiti i microrganismi usano la fermentazione dei carboidrati solo come fonte di energia, mentre il materiale di base necessario ai processi biosintetici deriva da altre componenti del terreno. L efficienza di utilizzazione di ATP durante la fermentazione è espressa come YATP Y ATP = grammi di cellule formate/numero di moli prodotte Questo valore è abbastanza costante in tutti i microrganismi (circa 10grammi/mole di ATP)

34 Questa costanza non si riscontra in termini di resa in cellule per mole di substrato fermentato in quanto i diversi microrganismi possono fermentare un substrato utilizzando vie metaboliche che differiscono per la resa di ATP 34 Resa di crescita di batteri che utilizzano il glucosio come fonte di energia Saccharomyces cerevisiae Lactobacillus delbrueckii Enterococcus faecalis Zymomonas mobilis METABOLISMO Fermentazione alcolica via Embden-Meyerhof Fermentazione omolattica via Embden-Meyerhof Fermentazione omolattica via Embden-Meyerhof Fermentazione alcolica via Entner-Doudoroff Mole ATP/ Mole glucosio Y max (grammi cellule/mole glucosio Y ATP (grammi cellule/mole ATP , ,

35 35 Colture in batch o continue Colture in batch: beuta Colture continue: chemostato Se il terreno utilizzato possiede un nutriente essenziale in quantità limitante, il tasso di crescita sarà funzione della velocità di flusso del terreno. D = f/v D :Velocità di scambio (velocità di diluizione) f: velocità di flusso del terreno (ml/ora) V:volume del terreno contenuto nel recipiente (ml) Esempio f = 30ml/ora, V = 100ml D = 0.3/ora

36 36 Coltura continua in un chemostato

37 37 Raggiungimento dello stato di equilibrio Nel chemostato la coltura è influenzata dalla concentrazione del substrato. All aumentare della concentrazione del nutriente limitante, e con la velocità di diluizione che rimane costante, anche la concentrazione delle cellule aumenterà, mentre la velocità di crescita rimarrà invariata. Quando la concentrazione complessiva delle cellule e il rifornimento dei nutrienti sono bilanciati ed hanno raggiunto l equilibrio, allora il sistema ha raggiunto lo steady state (stato di equilibrio).

38 Relazione tra la concentrazione del nutriente, la velocità di crescita e la resa di crescita in una coltura batch. Le basse concentrazioni di nutriente influenzano sia la velocità che la densità di popolazione 38 Figura 6.14

39 Relazione nello stato di equilibrio (steady state) fra la concentrazione del substrato e lo sviluppo della massa batterica 39 Fig Con una coltura di 1000 ml ed una velocità di flusso di 500ml/h si ottiene una velocità di diluizione di 0,5/h

40 Relazione nello stato di equilibrio (steady state) fra la concentrazione del substrato e lo sviluppo della massa batterica 40