Medium Inoculazione Coltura pura : Colonie: Clone

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Federica Boni
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1 Nutrizione Medium: soluzione di nutrienti che permettono la crescita dei batteri. Inoculazione : l introduzione di cellule vive in un terreno liquido sterile o sulla superficie dei terreni solidi. Coltura pura : una popolazione di cellule geneticamente omogenea. Colonie: Crescita di cellule individuali depositate sulla superficie dei terreni solidi che porta ad una visibile massa batterica. Clone: le cellule di una colonia che discendono da una singola cellula originale.

4 Nutrizione Il processo che permette al batterio di ricavare dall ambiente le molecole (preformate) a lui necessarie, mentre le altre li ricava per sintesi di piccole molecole a partire da sostanze presenti nell ambiente. L acqua rappresenta il 90% del peso di una cellula batterica. Macronutrienti:C,H,O,N,P,S,K,Mg,Na,Fe. Micronutrienti :Co, Zn,Mo, Cu, Mn, Ni.

7 Medium o terreno di coltura per i batteri: Sono substrati inerti dove sono contemplate tutte le necessità metaboliche di cui ha bisogno il microrganismo che si vuole isolare. Importanti per la cura, diagnosi e profilassi di una malattia infettiva.

8 Elementi essenziali di un terreno di coltura sono: a) Presenza di sostanze nutritive. b) Giusta concentrazione di sali minerali. c) Giusta concentrazione di ioni H+. d) Giusta T d incubazione. e) Giusta tensione parziale di ossigeno e di anidride carbonica. f) Aggiunta di fattori di crescita.

9 Classificazione dei terreni di coltura per i batteri: Stato fisico: Liquidi e Solidi. Stato chimico: Minimi, Semplici, Complessi. Funzione biologica: Arricchimento, Selettivi, Differenziali. Nutrizione

10 Terreni liquidi: Brodo di carne Acqua peptonata Bile Siero di latte Brodo + siero di sangue Brodo + liquido ascitico. Terreni solidi: Agar nutriente (1,5%) Gelatina Patata. Nutrizione

11 CRESCITA IN SUBSTRATI LIQUIDI Se il terreno è liquido la crescita può dar luogo a: 1) Intorbidamento 2) Formazione di una pellicola 3) Sedimento (lievito) 4) Mucosità

12 Terreni minimi: sono costituiti da soli composti inorganici e consentono lo sviluppo dei soli germi litotrofi. Terreni semplici: Si conosce l esatta proporzione dei singoli costituenti. Terreni complessi: Sono terreni dei quali l esatta composizione non si conosce.

13 Terreni d arricchimento : Sono terreni preparati aggiungendo al Nutrient agar altri nutrienti biologici complessi (TSB,TSA). Nutrizione

14 Terreni selettivi: Sono terreni che permettono l accrescimento preferenziale di certe specie patogene attraverso l azione d inibitori capaci di ritardare ed impedire la moltiplicazione di specie batteriche contaminanti (Lowenstein Jensen, Streptosel broth, Chapman Stone, Sabouraud). Nutrizione

15 Terreni differenziali : Terreni che presentano oltre ai fattori inibenti, indicatori che ci consentono d individuare in maniera orientativa i batteri capaci di moltiplicarsi in base all aspetto delle colonie (Brilliant Green, Salmonelle Shigelle, Mac Conkey, Hoektoen).

16 Le tecniche d isolamento dei batteri sono importanti per : l isolamento l identificazione la diagnosi la profilassi e la determinazione della carica microbica.

17 Strumenti per l isolamento microbico: Ansa Ago Becco Bunsen Spatola Pipette graduate Pipette Pasteur Pinzette Nutrizione

18 Isolamento su piastra: Semina in superficie. Semina per infissione. Semina per inclusione. Semina su becco di clarino. Semina su piastra petri. Semina in glicerolo. Liofilizzazione. Nutrizione

19 Crescita su terreno solido. Nutrizione Patina Colonia (aspetto, forma, profilo, sezione trasversale). Isolamento di colonie singole. Conservazione dei ceppi (becco di clarino). Conteggio di una sospensione cellulare.

20 A) Misura della massa cellulare: a1) misura del peso secco. a2) misura del volume della massa cellulare. a3) determinazione dell azoto totale. a4) misura dell attività metaboliche. a5) colorimetria (spettrofotometri).

21 B) Determinazione della concentrazione cellulare: b1) Conteggio totale al microscopio (camere contacellule). b2) Conteggio delle unità vitali (Diluizione e piastramento).

22 A) Conteggio totale al microscopio: Osservazione diretta al microscopio del n di cellule presenti in un volume noto. Si usano camere contacellule. Vetrino con reticolo formato da quadranti e rettangoli di area nota. Vetrini coprioggetti creando una intercapedine di spessore noto, in cui s introduce una aliquota della sospensione da contare. Per il conteggio dei batteri si usano camere con spessore di 0.01 mm e per quello dei lieviti di 0.1. Questo metodo è rapido e semplice.

23 Nutrizione B) Conteggio delle unità vitali - Diluizione e piastramento.

25 La curva di crescita dei batteri I batteri, se le condizioni sono opportune per lo sviluppo, si riproducono assai velocemente e il loro numero aumenta in breve tempo. Misurando la quantità di batteri presenti nell unità di volume di un terreno liquido a diversi intervalli di tempo, si può costruire un grafico che rispecchia la cinetica del processo replicativo della popolazione batterica della coltura. Il grafico ha un aspetto caratteristico, simile per tutti i batteri e può essere suddiviso in diverse fasi.

26 Curva di crescita dei batteri: Due requisiti: Terreno liquido; Sistema chiuso. Tempo di generazione : il tempo richiesto per la divisione cellulare. Varia con la specie e con le condizioni di crescita. Rappresentazione su scala semilogaritmica.

27 Curva di crescita: fasi Misurando il numero di batteri vivi presenti in una unità di volume a vari intervalli di tempo e riportando i valori in un diagramma ad assi cartesiani nel quale in ascisse si pone il tempo e in ordinate il log del numero dei batteri vivi si ottiene una curva che può essere suddivisa in 6fasi.

28 Curva di crescita di una coltura batterica: Sono 6 le fasi della curva di crescita: a) Fase di latenza b) Fase di accelerazione positiva c) Fase di crescita esponenziale (trofofase). d) Fase di accelerazione negativa e) Fase stazionaria (idiofase) f) Fase di declino.

30 a) Fase di latenza : detta anche di ringiovanimento o fase di adattamento metabolico. Non si hanno atti moltiplicativi. La durata della fase di latenza dipende dall età dell inoculo, dallo stato fisiologico delle cellule e dal terreno di coltura. b) Fase di accelerazione positiva : fase in cui i batteri iniziano a dividersi, ma solo il 20% si divide con un tempo di generazione più lungo rispetto al suo standard.

31 c) Fase esponenziale: o trofofase o fase logaritmica: fase in cui il 100% dei batteri si divide, in maniera asincrona. Crescita continua dei batteri in tutti gli stadi di divisione.il batterio in questa fase produce metaboliti primari. d) Fase di accelerazione negativa: Aumentano i cataboliti tossici e le sostanze nutritive si riducono. In questa fase si dividono l 80% dei batteri, mentre il 20% inizia a morire.

32 e) Fase stazionaria o idiofase: Questa è una fase dove il 50% si divide mentre il resto muore. In questa fase i batteri producono i metaboliti secondari (antibiotici, tossine, pigmenti, batteriocine). I batteri sporigeni durante la fase stazionaria danno origine alle spore, per cui il titolo vitale può restare costante o diminuire di poco.

33 f) Fase di declino: La condizione stazionaria è seguita dalla fase di morte. Questa si deve alla forte riduzione di sostanze nutritive ed all aumento di sostanze tossiche. I batteri sporigeni non raggiungono il declino.

34 La coltura continua Normalmente si dice che una coltura è giovane, quando è in fase logaritmica di sviluppo e vecchia quando si trova in fase stazionaria. La distinzione tra giovane e vecchia non riguarda la cellula batterica ma è dovuta alle condizioni del mezzo di coltura e alla disponibilità di nutrienti. E possibile mantenere una coltura batterica giovane per il tempo che si desidera utilizzando particolari sistemi di coltura (chemostati) in cui da una parte si ha continua sottrazione di terreno invecchiato e dall altra si ha aggiunta di uguale quantità di terreno fresco. In tal maniera si mantiene indefinitivamente la coltura in condizioni ottimali, per cui si ha la moltiplicazione di tutti i batteri presenti.

35 Chemostato

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