Analisi di modelli primari e secondari nella Microbiologia Predittiva: approccio a Reti Neurali

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1 Analisi di modelli primari e secondari nella Microbiologia Predittiva: approccio a Reti Neurali Prof. Crescenzio Gallo, Ing. Michelangelo De Bonis [c.gallo, Laboratorio per l'analisi Quantitativa dei Dati Dipartimento di Scienze Economiche, Matematiche e Statistiche Dipartimento di Scienze Biomediche Università di Foggia, Italy

2 2 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb Abstract La microbiologia predittiva (PFM Predictive Food Microbiology) è un'area multidisciplinare di ricerca della microbiologia alimentare. Essa implementa elementi fondamentali di matematica, microbiologia, ingegneria e di chimica per sviluppare ed applicare modelli formali e predire la risposta della crescita di microorganismi in determinate condizioni ambientali. Questo lavoro ha un duplice scopo: analizzare le tecniche di modellizzazione già esistenti e affermate nel settore, e quindi proporre un modello matematico alternativo basato sulle Reti Neurali Artificiali, descrivendone i risultati.

3 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 3 Introduzione La microbiologia predittiva nasce dal desiderio di racchiudere il comportamento dei microorganismi in modelli matematici, al fine di rendere più semplici le procedure per la determinazione del rischio alimentare. La si può definire come una disciplina che ha l obiettivo di sviluppare modelli matematici accurati e nello stesso tempo versatili, in grado di descrivere l evoluzione microbica in prodotti alimentari, come funzione delle condizioni ambientali, che sono assunte conosciute e misurabili (Impe JV et al., 2005). I modelli matematici impiegati nella microbiologia predittiva possono essere classificati in tre tipi (Whiting R et al., 1993): primari; secondari; terziari. I modelli primari fanno riferimento a espressioni matematiche che descrivono l inattivazione, la sopravvivenza o la crescita batterica in termini di popolazione cellulare o di densità nel tempo, in determinate condizioni colturali e ambientali. L obiettivo è testare l abilità di un modello nel descrivere le curve microbiche di crescita e nell individuarne i parametri. I modelli secondari descrivono come variano i parametri stimati dall applicazione dei modelli primari, in funzione di una o più condizioni ambientali. Infine i modelli terziari combinano uno o più modelli primari e secondari, per generare un sistema in grado di predire il comportamento di specifici microorganismi, quando sottoposti a differenti condizioni ambientali. I dati e le curve di crescita con cui si sono svolte le indagini statistiche sono stati prelevati dal repository mondiale Combase. Il database contiene curve di crescita microbiche (Baranyi J et al., 2004). Dal seguente database sono state selezionate 80 curve di crescita di Shigella flexeneri, ottenute in terreno di coltura BHIB in anaerobiosi (i dati originari sono disponibili all'indirizzo La scelta è stata effettuata considerando quattro parametri di crescita: 1) temperatura, compresa nel range gradi Celsius 2) ph compreso tra ) concentrazione di NaCl compresa nel range 0.5% - 4 % 4) concentrazione di KNO 2 ê NaNO 2 compresa nel range ppm Per l'analisi e l'implementazione dei modelli è stato utilizzato il software Mathematica nella versione 8.0 disponibile nel Laboratorio per l'analisi Quantitativa dei Dati dell' Università degli Studi di Foggia. In particolare, Mathematica è stato impiegato per la normalizzazione di dati sperimentali e la realizzazione di reti neurali artificiali utilizzate per la previsione della crescita batterica, e per la produzione dei relativi grafici a corredo dell'indagine scientifica effettuata.

4 4 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb Fase 1: Analisi dei dati mediante modelli primari Le curve di crescita microbiche, quando rappresentate dal logaritmo della concentrazione microbica nel tempo, mostrano un andamento tipicamente sigmoidale, nel quale possono essere individuate tre principali fasi di crescita: 1. una fase iniziale, detta fase lag, in cui la velocità specifica di crescita passa da un valore pari a zero al valore di massima velocità di crescita; 2. una fase esponenziale, in cui la velocità specifica di crescita resta costante; 3. una fase stazionaria, in cui la velocità di crescita diminuisce fino a raggiungere il valore zero. Per descrivere tali curve e ridurre i dati misurati ad un numero limitato di parametri, sono stati sviluppati diversi modelli, sia di tipo empirico che di tipo meccanicistico. I modelli più impiegati sono fondamentalmente tre: il modello di Gompertz, il modello di Baranyi-Roberts ed il modello di Buchanan. ü Modello di Gompertz Il modello di Gompertz, è un modello empirico (Zwietering M. et al., 1990) che è stato modificato per dare un significato biologico ai parametri che lo descrivono. Il modello è descritto dalla seguente equazione: log N = A g + D e -BHt-ML dove: - N indica la concentrazione dei microorganismi al tempo t [CFU/mL]; - D è la differenza tra il valore dell asintoto inferiore e dell asintoto superiore [1/CFU]; - B rappresenta la massima velocità di crescita al tempo M [1/s]; - M tempo in cui viene raggiunta la massima velocità di crescita [s]; - A g valore dell asintoto superiore [1/CFU]. ü Modello di Baranyi-Roberts Il modello proposto Baranyi e Roberts (Baranyi J. et al., 1994), a differenza del modello di Gompertz fonda su basi biologiche l interpretazione dei suoi parametri. La crescita della popolazione microbica può essere descritta dalle seguenti equazioni differenziali: N t = m max J QHtL NHtL N J1 - N NHtL 1+QHtL N max con NHt = 0L = N 0 QHtL t = m max QHtL con QHt = 0L = Q 0 La prima equazione differenziale descrive l evoluzione della crescita microbica NHtL con N 0 valore iniziale ed N max valore massimo di crescita [CFU/mL]. Il primo fattore induce la fase di crescita esponenziale, con un tasso massimo identificato da m max [1/h]. Il secondo fattore è la componente introdotta dalla fase lag, chiamato stato fisiologico delle cellule nel tempo QHtL [ ], che dipende dallo stato fisiologico iniziale Q 0. Questo stato è proporzionale alla concentrazione di una una ipotetica sostanza critica che simuli un collo di bottiglia nel processo di crescita. Il terzo fattore è la funzione di inibizione logistica, che nella fase stazionaria assume il ruolo di massimo nella crescita microbica. La seconda equazione differenziale descrive l evoluzione esponenziale del termine QHtL, con Q 0 [ ] il valore iniziale dello stato fisiologico.

5 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 5 La prima equazione differenziale descrive l evoluzione della crescita microbica NHtL con N 0 valore iniziale ed N max valore massimo di crescita [CFU/mL]. Il primo fattore induce la fase di crescita esponenziale, con un tasso massimo identificato da m max [1/h]. Il secondo fattore è la componente introdotta dalla fase lag, chiamato stato fisiologico delle cellule nel tempo QHtL [ ], che dipende dallo stato fisiologico iniziale Q 0. Questo stato è proporzionale alla concentrazione di una una ipotetica sostanza critica che simuli un collo di bottiglia nel processo di crescita. Il terzo fattore è la funzione di inibizione logistica, che nella fase stazionaria assume il ruolo di massimo nella crescita microbica. La seconda equazione differenziale descrive l evoluzione esponenziale del termine QHtL, con Q 0 [ ] il valore iniziale dello stato fisiologico. ü Modello di Buchanan o Modello Lineare a Tre Fasi Sebbene il modello di Baranyi produca un buon fit, l elevato numero di parametri da stimare e la sua sensibilità al numero di dati e alla loro distribuzione, lo rendono particolarmente complesso. Per questo motivo Buchanan (Buchanan R et al., 1997) propone il three phase linear model che può essere schematizzato come segue: log N = loghn 0 L log N = loghn 0 L + m max Ht - tl per Ht tl per Ht < t < t m L log N = loghn max L dove m max = loghn max L - logn 0 Ht m -tl Praticamente il modello è sviluppato sulle seguenti assunzioni (Li H et al., 2007): - durante la fase lag la velocità specifica di crescita è zero; - durante la fase esponenziale, il logaritmo della popolazione microbica aumenta linearmente con il tempo; - durante la fase stazionaria la velocità specifica di crescita torna ad essere zero.

6 6 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb Fase 2: Analisi dei modelli secondari con Neural Networks L'analisi effettuata con i tre modelli primari ha dato, per ogni curva presa in analisi, come risultato il tempo di permanenza nella fase iniziale e la velocità nella fase di crescita. Come modello secondario, cioè la possibilità attraverso un modello matematico di poter predire una situazione al tempo Ht + il, sono state utilizzate delle reti neurali artificiali. Quando i dati di input provengono da una funzione con valori reali di output in un intervallo continuo, una rete neurale può eseguire un'approssimazione tradizionale della funzione in oggetto. Un esempio di un problema di approssimazione potrebbe essere quello in cui la temperatura di un oggetto è determinata da misure secondarie, come ad esempio emissione di radiazioni. Un altro esempio più banale potrebbe essere quello di valutare la misura delle scarpe sulla base dell'altezza di una persona. Questi due esempi, ovviamente, riguardano dei modelli molto semplici e semplicistici con un solo ingresso e una sola uscita. Un modello più avanzato potrebbe essere quello di usare un ulteriore elemento come dato di ingresso, il genere sessuale, come un secondo indicatore per ricavare una stima più accurata della misura delle scarpe. Le funzioni possono comunque essere approssimate con i seguenti due tipi di rete neurale: FeedForward e Radial Basis Function (Sjoberg J., 2005). E' compito del ricercatore cogliere le sottili differenze di implementazioni tra i due tipololgie di rete e saperle applicare nel contesto migliore. In questo lavoro la struttura principale utilizzata è stata quella FeedForward; le relative reti neurali sono state costruite ponendo in ingresso i valori di "uscita" del modello primario (il valore del tempo di permananenza nella fase lag e il valore di velocità della crescita batterica) e studiando la migliore configurazione di rete che approssimi i dati reali. ü Neural Network per il modello di Gompertz Per i dati ottenuti dal modello primario di Gompertz la migliore configurazione di rete neurale presenta le seguenti caratteristische: struttura di tipo FeedForward con due strati nascosti e 3 neuroni per ciascuno strato, valore di learning rate di 0.06 e valore del momentum coefficient di 0.6. L errore in termini di RMSE è Il seguente è lo schema della rete neurale implementata. ü Neural Network per il modello di Baranyi-Roberts

7 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 7 Neural Network per il modello di Baranyi-Roberts Per i dati ottenuti dal modello primario di Baranyi-Roberts la migliore configurazione di rete neurale presenta le seguenti caratteristische: struttura di tipo FeedForward con due strati nascosti, 5 neuroni per il primo strato nascosto e 9 per il secondo, valore di learning rate di 0.05 e valore del momentum coefficient di 0.6. L errore in termini di RMSE è Il seguente è lo schema della rete neurale implementata. ü Neural Network per il modello di Buchanan Per i dati ottenuti dal modello primario di Buchanan la migliore configurazione di rete neurale presenta le seguenti caratteristische: struttura di tipo FeedForward con due strati nascosti, 12 neuroni per il primo strato nascosto e 2 per il secondo, valore di learning rate di 0.01 e valore del momentum coefficient di 0.5. L errore in termini di RMSE è Il seguente è lo schema della rete neurale implementata. ü

8 8 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb

9 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 9 Fase 3: Analisi dei dati con approccio con Neural Networks In questo approccio di ricerca è stato utilizzato lo strumento delle reti neurali direttamente sui dati raccolti dal database. Si è scelto di rovesciare la filosofia "classica" di approccio al problema, in cui il valore di previsione viene derivato attraverso i due passaggi espressi dalla fase 1 (analisi dei dati con uno dei metodi primari) e dalla fase 2 (analisi dei risultati dei modelli primari e successive indigini di regressione statistica). Il problema è stato ricostruito secondo il seguente obiettivo: è possibile implementare una rete neurale che, conoscendo solamente i dati nel loro stato "grezzo", sia in grado di predire il valore di crescita batterica al tempo Ht + il? Per poter rispondere a questa domanda, il lavoro più importante è stato quello della costruzione del nuovo modello di analisi e della relativa forma dei dati in ingresso. Dopo attente analisi il dato di input (il valore di concentrazione batterica) è stato determinato dai seguenti parametri: dati ambientali, il tempo e il valore di concentrazione iniziale. Si potrebbe esprimere la relazione come segue: log HNL = f HT, ph, NaCl, KNO 2 ênano 2, t, loghn 0 L) dove: - N indica la concentrazione dei microorganismi al tempo t [CFU/mL]; - N 0 è la concentrazione dei microorganismi al tempo 0 [CFU/mL]; - T è la temperatura in gradi Celsius; - ph è il valore dell'indice di acidità della curva; - t è la variabile temporale di crescita; - NaCl rappresenta la percentuale di cloruro di sodio presente; - KNO 2 ênano 2 rappresenta, infine, la concentrazione dei sali espressa in parti per milione [ppm]. La rete neurale ha quindi la seguente struttura: 6 neuroni nello strato di input, relativi a temperatura, ph, percentuale di NaCl, concentrazione di KNO 2 ênano 2, tempo e logaritmo della concentrazione iniziale. Lo strato di uscita è costituito da un solo neurone, il quale individua il logaritmo della concentrazione. Il set di dati contiene 734 elementi in totale. Questi sono stati suddivisi come segue: 500 punti per il training test, 106 per il validation test, 106 nel test set e 22 punti provenienti da 3 curve di crescita diverse utili per la "simulazione" dell'effettiva bontà del nostro modello matematico. Infatti, questi ultimi dati sono stati utilizzati per verificare se il modello è in grado di riprodurre l andamento tipico della curva di crescita e corrispondono alle seguenti curve: - H180A (T = 37 C, ph = 5.05, NaCl = 0.5 %, KNO 2 ênano 2 = 0 ppm) - H270A (T = 19 C, ph = 6.05, NaCl = 0.5 %, KNO 2 ênano 2 = 0 ppm) - H90C (T = 28 C, ph = 5.05, NaCl = 0.5 %, KNO 2 ênano 2 = 0 ppm) La migliore configurazione di rete è stata individuata in due strati nascosti con 5 neuroni per ciascuno strato, valore di learning rate di 0.02, valore di momentum coefficient di 0.9. L RMSE ottenuto è pari a La sua struttura è visualizzata nella figura seguente.

10 10 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb

11 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 11 Implementazione in Mathematica della Fase 3: Analisi dei dati con Neural Network Inizializzazione ü Packages e funzioni << NeuralNetworks`; << pointcurves_minusthree.txt; minmax_d := i, j<, = 1, j <= j++, = 8i, = minmaxinpd minmaxoutd minmax_, inpresc_, xmin_, xmax_d := i, j<, = 1, j <= j++, = 8i, 8xmin, xmax<dd; inpresc = 8i, 8j, minmaxinp, inputresc, 0.1, 0.9D; minmaxout, outputresc, 0.1, 0.9D; outtrain, inpvalid, outvalid, inptest, outtestd output_, inptrain_, outtrain_, ntrain_, inpvalid_, outvalid_, nvalid_, inptest_, outtest_d := 8i, j, x, y, rand, inptr = 8<, outtr = 8<, inpv = 8<, outv = 8<, inp = input, out = output<, = 1, i ntrain, i++, rand = 81, x = inptr = xd; y = outtr = yd; inp = 8rand<D; out = 8rand<DD; = 1, j nvalid, j++, rand = 81, x = inpv = xd; y = outv = yd; inp = 8rand<D; out = 8rand<DD; inptest = inp; outtest = out; inptrain = inptr; outtrain = outtr; inpvalid = inpv; outvalid = outvd; outputresc, inptrain, outtrain, 500, inpvalid, outvalid, 106, inptest, outtestd; inptrain >>> pointcurves_scaled.txt outtrain >>> pointcurves_scaled.txt inpvalid >>> pointcurves_scaled.txt outvalid >>> pointcurves_scaled.txt inptest >>> pointcurves_scaled.txt outtest >>> pointcurves_scaled.txt << pointcurves_scaled.txt; Rete Neurale ü Inizializzazione e fitting netfdwrd2, fitreportd;

12 12 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb netfdwrd = outtrain, 85, 7<, BiasParameters Ø True, RandomInitialization Ø True, OutputNonlinearity Ø SigmoidD w2, w3<<, 8Neuron Ø Sigmoid, FixedParameters Ø None, AccumulatedIterations Ø 0, CreationDate Ø 82011, 8, 31, 18, 1, <, OutputNonlinearity Ø Sigmoid, NumberOfInputs Ø 6<D 8netfdwrd2, fitreport< = inptrain, outtrain, inpvalid, outvalid, , Method Ø BackPropagation, StepLength Ø 0.02, Momentum Ø 0.9, CriterionPlot Ø TrueD; RMSE Iterations ü Inizializzazioni indici di controllo y_d := ModuleB8i, j, n = m = tot, parz1<, tot = n m i=1 j= n ; ForBj = 1, j <= j++, = n i= n ; for attribute ", j, " is: ", RMSE is: ", totd;f outpred = outtest; outtestd RMSE for attribute 1 is: Total RMSE is:

13 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 13 xmin_, xmax_, inpresc_, minmax_d := i, j<, = 1, j <= j++, = 8i, 8xmin, xmax<, inpresc = 8i, 8j, 0.1, 0.9, outpredreal, minmaxoutd; 0.1, 0.9, outtestreal, minmaxoutd; 0.1, 0.9, inptestreal, minmaxinpd; ü Set di generalizzazione dei dati << threecurves.txt = 1, i <= i++, minmaxinp, 0.1, 0.9D;D curvesrescaled = 8i, = 1, i <= i++, minmaxout, 0.1, 0.9D;D logrescaled = 8i, logpred = 8i, 8j, = 1, i i++, <, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<< <, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<< RMSE for attribute 1 is: Total RMSE is: Null RMSE for attribute 1 is: Total RMSE is: Null RMSE for attribute 1 is: Total RMSE is: Null

14 14 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb logpredictedreald; = 1, i i++, 0.1, 0.9, minmaxoutdd logpredictedreal = 8i, curvetimelogreal = 8i, 8j, curvetimelogreal curvelogtimepred = 8i, 8j, <, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<, <, <, <, <, <, <, <<< 8880., 3.06<, 82., 2.95<, 84., 3.93<, 87., 4.98<, 819., 7.78<, 822., 8.2<, 825., 7.72<, 828., 7.8<<, 880., 2.77<, 818., 4.68<, 824., 4.76<, 896., 8.72<, 899., 8.79<, 8114., 8.79<, , 9.02<<, 880., 3.09<, 84., 3.29<, 819.5, 7.25<, 823., 7.98<, 827., 8.52<, 847., 8.57<, 851.5, 8.57<<< 8880., <, 82., <, 84., <, 87., <, 819., <, 822., <, 825., <, 828., <<, 880., <, 818., <, 824., <, 896., <, 899., <, 8114., <, , <<, 880., <, 84., <, 819.5, <, 823., <, 827., <, 847., <, 851.5, <<< Risultati ü Confrotto dati Reali - dati previsti dalla Rete Neurale = 1, i i++, conditions: t,ph,nacl,kno2 ", " ", " ", " ", " Predicted ", Filling Ø Axis, Joined Ø TrueD, " Real ", Filling Ø Axis, Joined Ø TrueDDD

15 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 15 Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted Real Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted Real

16 16 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted Real = 1, i i++, conditions: t,ph,nacl,kno2 ", " ", " ", " ", " Predicted ê Real ", Filling Ø Axis, Joined Ø TrueDDD

17 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 17 Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted ê Real Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted ê Real Environmental conditions: t,ph,nacl,kno Predicted ê Real

18 18 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb Considerazioni e Conclusioni L'indagine condotta utilizza una metodica "alternativa" ai canoni della letteratura nel campo della microbiologia predittiva (PFM Predictive Food Microbiology). Infatti, sono stati qui considerati i valori del logaritmo (in base 10) della concentrazione come funzione del tempo, la concentrazione iniziale ed i parametri ambientali. Usando i dati così costituiti si è costruito un modello basato su rete neurale in grado di predire la concentrazione batterica in base al tempo, la concentrazione iniziale ed i parametri ambientali. Come mostrato il modello è in grado di riprodurre molto bene una curva di crescita batterica, sebbene l errore in termini di RMSE sia più alto rispetto agli altri modelli. Ma questo porta il ricercatore a migliorare il modello della Rete Neurale ("tarando" il numero di neuroni e di strati nascosti), magari aggiungendo informazioni iniziali al set di dati, perché la rete neurale intrinsicamente riesce a riconoscere l'andatamento della curva di crescita e a simularne, o a predirne, valori futuri. Questo tipo di indagine, ed i modelli matematici sottostanti, richiede notevoli capacità di calcolo e di modellizzazione simbolica che non sono normalmente disponibili o comunque agevoli da affrontare con un semplice approccio "concettuale". Gli strumenti di modellizzazione e di calcolo (simbolico e numerico) nonché gli strumenti tradizionali di programmazione procedurale offerti dall'ambiente Mathematica hanno consentito la comparazione di diversi approcci di modellizzazione in breve tempo, e riteniamo nell'immediato futuro di poter migliorare sensibilmente l'accuratezza dei risultati di previsione ottenuti mediante rete neurale per mezzo di un "raffinamento" mirato nella strutturazione delle stesse, sia in termini di numero di neuroni che di strati nascosti impiegati.

19 Atti del Mathematica Italia User Group Meeting 2011.nb 19 Riferimenti Bibliografici J. V. Impe, F. Poschet, A. Geeraerd, and K. Vereecken, Towards a novel class of predictive microbial growth models, International Journal of Food Microbiology, vol. 100, pp , R. Whiting and R. Buchanan, A classification of models for predictive microbiology, Food Microbiology, vol. 10, pp , J. Baranyi and M. Tamplin, Combase: a common database on microbial responses to food environments, Journal of Food Protection, no.67, pp , M. Zwietering, I. Jongenburger, F. Rombouts, and K. van t Riet, Modeling of the bacterial growth curve, Appl. Environ. Microbiol, vol. 56, p. 1975, J. Baranyi and T.Robert, A dynamic approach to predicting bacterial growth in food, International Journal of Food Microbiology, vol.23, pp , R. Buchanan, R.Whiting, and W.Damert, When is simple good enough: a comparison of the gompertz, baranyi, and three-phase linear models for fitting bacterial growth curves, Food Microbiology, vol.14, pp , H. Li, G. Xie, and A. Edmondson, Evolution and limitations of primary mathematical models in predictive microbiology, Br.Food Journal, vol.109, pp , J. Sjoberg, Mathematica - Neural Network: Train and analyze Neural Networks fit your data, Wolfram Research, 2005.

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