Spettrofotometria e analisi di amminoacidi

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1 Spettrofotometria e analisi di amminoacidi Quantizzazione di proteine e di miscele di amminoacidi Antimo Di Maro Anno Accademico

2 Assorbimento della luce ONDE ELETTROMAGNETICHE La radiazione elettromagnetica è, dal punto di vista dell'elettromagnetismo classico, un fenomeno ondulatorio dovuto alla contemporanea propagazione di perturbazioni periodiche di un campo elettrico e di un campo magnetico, oscillanti in piani tra di loro ortogonali. E = h = h c/ λ h= costante di Plank E= Energia = Frequenza = numero di onde che passano in punto per unità di tempo λ= Lunghezza d onda (A = Angstrom = m = 0,1 nm; nm = 10-9 m; μm = 10-6 m) 1/λ= λ -1 = Numero d onda c = velocità di propagazione (3 x cm /sec 2 )

3 SPETTRO ELETTROMAGNETICO 700 nm 340 nm Bassa energia (.calore) Alta energia (danneggiano le macromolecole

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5 FOTOMETRIA L. incidente L. trasmessa Tra 0 e 100% Da 0 ad infinito

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10 La proprietà di assorbimento della luce UV da parte di Triptofano, Tirosina e Fenilalanina è particolarmente utile per il riconoscimento e la determinazione quantitativa delle proteine mediante l utilizzo dello SPETTROFOTOMETRO

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13 Il massimo dell assorbimento dipende dai gruppi funzionali presenti nelle molecole e da lo SPETTRO DI ASSORBIMENTO

14 ASSORBIMENTO DELLA LUCE ULTRAVIOLETTA DA PARTE DEGLI Aa AROMATICI Il triptofano e la tirosina Assorbono la luce ultravioletta, ciò spiega perché la maggior parte delle proteine hanno un caratteristico assorbimento della luce ad una lunghezza d onda di 280 nm

15 Assorbimento di una proteina Assorbimento di un acido nucleico

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17 Emoglobina

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19 L assorbimento di luce ad una qualunque lunghezza d onda può essere messo in relazione con la concentrazione della sostanza assorbente mediante la RELAZIONE DI LAMBERT E BEER A = ε c l A = assorbimento ad una determinata lunghezza d onda; c = concentrazione della sostanza espressa in moli per litro di soluzione; l = lunghezza del cammino ottico espressa in cm; ε = coefficiente di estinzione molare (assorbimento di una soluzione 1M del composto in esame, quando questa è attraversata per 1 cm dalla luce incidente). (dipende da ) Da 0 ad infinito

20 Devo sapere epsilon, che è caratteristica per ogni (macro)molecola Se non conosco epson, posso usare per determinare la concentrazione di una proteina la spettrofotometria ma con una proteina di riferimento a quantità nota, da usare come standard

21 Metodo colorimetrico Coloranti che interagiscono con le proteine e danno una risposta immediata

22 Metodo del biureto. Il metodo del biureto si basa sulla capacità degli ioni Cu +2 di interagire con le proteine e formare dei complessi con l azoto del legame peptidico. Tali complessi producono un colore blu che può essere misurato a 550 nm. Il reattivo del biureto consiste di una soluzione alcalina di solfato di rame (CuSO 4 ). La reazione del biureto è data da tutti i composti che contengono almeno due gruppi peptidici (-CO-NH-) legati fra loro o direttamente, o per mezzo di un atomo di carbonio (peptidi, proteine) o per mezzo di un atomo di azoto, come nel caso del biureto (H 2 N-CO-NH-CO-NH 2 ).

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24 Con tale metodo gli ione Rame in ambiente basico che interagiscono con i gruppi NH dei legami peptidici che vengono successivamente chelanti dal reattivo

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29 Come si determina la quantità di una proteina? Se la proteina è pura: 1- Metodo diretto Legge di Lambert e Beer Dalla relazione: A= xlxc si ricava: c=a/( xl) Essendo l noto (dimensioni della cella) si deve disporre del valore di ε relativo alla sostanza in esame, ad una certa lunghezza d onda (280 nm). Quindi, se è noto (da precedenti esperienze o perché tabulato in letteratura) è agevole ottrenere la quantità di una proteina. 2- Se non si conosce oppure siamo in presenza di una miscela di proteine, si può a) far riferimento al dato che 1mg/mL di proteine presentano un assorbanza media di 1 a 280 nm. Se quindi si legge l assorbanza della miscela di proteine, si può avere una dato approssimativo della concentrazione.

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31 b) si può usare un metodo molto preciso che consiste nell idrolizzare con acidi una porzione di campione e quindi effettuare l analisi amminoacidica sull idrolizzato. Questa è una procedura molto lenta. Non essendo, solitamente, necessaria una precisione così elevata, si utilizzano metodi più rapidi, la maggior parte dei quali sfrutta la colorimetria.

32 METODI COLORIMETRICI PER LA QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE IL PRINCIPIO: Le proteine presenti nella soluzione reagiscono con un reagente dando luogo ad un prodotto colorato. L intensità del colore sviluppato è correlato con la quantità di proteina. Si fa reagire quantità NOTE di una proteina (es. Albumina da siero bovina- BSA) con il colorante e si ottiene una retta di calibrazione. Poi si fa reagire con lo stesso colorante un volume noto di miscela di proteine e si relazione l assorbanza con la quantità sulla retta di calibrazione. C 1 C 2 Cx C 3 C4 Retta di calibrazione

33 Analisi di amminoacidi Composizione in amminoacidi di proteine e/o alimenti

34 Determinazione della composizione amminoacidica -Sistemi con derivatizzazione post-colonna Cromatografia a scambio ionico e colorazione con ninidrina -Sistemi con derivatizzazione pre-colonna Cromatografia a fase inversa ad alta pressione (RP-HPLC) - 1 fluoro-2,4 dinitrobenzene - dansil cloruro - Isotiocianato - ortoftalaldeide

35 Struttura e ph

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37 punto isoelettrico, pi ph al quale gli aa presentano carica netta uguale a zero dipende per ogni amminoacido dalla catena laterale per gli aa acidi tale valore è ~ 3 per gli amminoacidi basici ~9. per gli aa neutri varia tra ~ 5 e ~ 6.

38 Determinazione della composizione amminoacidica - Sistemi con derivatizzazione post-colonna Cromatografia a scambio ionico e colorazione con ninidrina - Sistemi con derivatizzazione pre-colonna Cromatografia a fase inversa ad alta pressione (RP- HPLC) - 1 fluoro-2,4 dinitrobenzene - dansil cloruro - Isotiocianato - ortoftalaldeide

39 Cromatografia a scambio ionico in generale Sfrutta la forza d attrazione tra molecole di carica opposta. Le colonne sono impaccate con una matrice su cui si blocca una fase stazionaria carica ( o +). Variando il ph dell eluente o la forza ionica si altera l equilibrio ottenuto e si può provocare il distacco degli analiti. In questa tecnica sono importanti quindi il ph, la forza ionica e la carica del campione. Le migliori separazioni si ottengono con eluizioni a gradiente si forza ionica o con step di ph.

40 Il principio della cromatografia a scambio ionico degli amminoacidi -Resina: Polistirene/divinil benzene - Gruppo carico presente sulla resina: gruppo solfonico: -SO 3 -

41 Il principio della cromatografia a scambio ionico L aggiunta si fa a ph acido, 2,2. TUTTI gli amminoacidi hanno carica positiva e si legano. -Aumento di forza ionica; -Aumento di ph; -Aumento di temperatura. Gli amminoacidi vengono eluiti; Colorati con ninidrina; -Lettura dell assorbimento a 570/420 nm; Integrazione dei picchi; Registrazione; Cromatogramma.

42 La resina + In H 2 SO 4

43 Analizzatore di amminoacidi Separa gli amminoacidi in base alla carica (scambio cationico) e presenta in successione rivelazione post colonna con ninidrina nello spettro del visibile

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45 Analizzatore di amminoacidi Schema a blocchi Sistema tamponi Ninidrina Colonna a scambio ionico Reattore (a 100/130 C) Registratore Sistema di integrazione Fotometro

46 Ninidrina Gli amminoacidi si colorano in violetto (570 nm); Gli imminoacidi si colorano in giallo (440 nm) Composto di Reuman

47 Determinazione della composizione di aa Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia a scambio cationico su resina di polivinilbenzene solfonato Rivelazione post colonna con ninidrina [colore violetto a 570 nm, colore giallo a 440 nm per gli imminoacidi (es. prolina)] La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimento Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard Si rivelano microgrammi di amminoacidi

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49 -Variazione di forza ionica - Variazione di ph - Variazione di temperatura

50 Dansil cloruro 2,4-dinitro-fluorobenzene (reagente di Sanger) Reagenti per il gruppo N-terminale Fenilisotiocianato ortoftalaldeide

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52 Fenilisotiocianato

53 Determinazione della composizione di aa proteici Estrazione da matrice delle proteine Idrolisi acida in 6M HCl a 110 C per 24 o per 72 ore (idrolisi del legame peptidico) Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia Rivelazione post colonna con ninidrina Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimento

54 Considerazioni Vari protocolli di estrazione Vari procedimenti per preservare amminoacidi che nelle condizioni di idrolisi vanno incontro a degradazione (Ser, Thr, Met ecc) Asparagina e Glutammina si trasformano in ambiente acido negli aa acidi corrispondenti Degradazione del Triptofano

55 Tali analisi possono dare informazioni su: 1. Struttura e caratterizzazione di proteine (composizione in aa); 2. Informazioni sulle caratteristiche di determinati alimenti o tessuti; 3. Qualità proteica per stabilire il valore nutrizionale degli alimenti; 4. Informazioni su cosa succede a prodotti alimentari sottoposti a procedimenti termici (furosina.); 5. ecc

56 Amminoacidi essenziali Treonina (Thr) Lisina (Lys) Valina (Val) Fenilalanina (Phe) Triptofano (Trp) Metionina (Met) Leucina (Leu) Isoleucina (Ile) Istidina * (His)

57 Determinazione della composizione di aa liberi Estrazione dalla matrice degli amminoacidi liberi Separazione dell idrolizzato tramite cromotagrafia Rivelazione post colonna con ninidrina Comparazione dell idrolizzato con una miscela di aa standard La quantità degli amminoacidi è proporzionata all assorbimento

58 Profilo cromatografico di una separazione di aa fisiologici utilizzando Litio Citrato

59 Considerazioni Estrazione Non vi è l idrolisi per liberare gli amminoacidi proteici Asparagina e Glutammina e molti amminoacidi rari o non presenti in proteine sono rilevabili Utilizzo di un analizzatore di amminoacidi per separazione di amminoacidi fisiologici (usa Litio Citrato..)

60 Fenilchetonuria Gli alimenti presentano la maggior parte degli amminoacidi, tra cui è presente la fenilalanina. Tale amminoacido viene in parte utilizzato metabolicamente dopo che l organismo la trasforma in tirosina Nei pazienti con tale patologia non vi è questa via metabolica e si ha accumulo di Phe. Vanno eliminate dalla dieta pietanze ricche in Phe

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62 Tali analisi possono dare informazioni su: 1.Presenza di amminoacidi modificati 2.Problemi di metabolismo alimentare o di vie metaboliche (disfunzioni..) 3.Qualità alimentare 4.Studi di sistematica molecolare 5.ecc

63 Un altro aspetto importante da considerare per la corretta interpretazione delle analisi amminoacidiche è lo standard interno. Standard interno: sostanza (nor-leucina) con caratteristiche chimico-fisiche simili agli analiti (aa) da separare. Viene aggiunto all inizio del processo di estrazione e subisce gli stessi trattamenti degli amminoacidi. Mediante lo Standard interno, in aggiunta alle informazioni qualitative dei campioni si possono fare analisi quantitative corrette, ottenendo informazioni sulla resa del processo di estrazione, idrolisi ecc nor Leucine

64 Valore nutrizionale delle proteine: La qualità proteica Composizione ideale in aa essenziali di una proteina alimenare secondo vari autori (mg/g di proteina) Amminoacido MIT* Millward** FAO/WHO/UNU*** FNB/IOM**** Istidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina cisteina Fenilalanina tirosina Treonina Triptofano Valina * Young e Pellet, 1990 ** Millward et al., 1990 *** FAO/WHO/UNU, 1995 **** Food and Nutrition Board, 2002 Analizzando l amminoacido limitante in riferimento ai valori in Tabella si ritrova il Punteggio chimico, sihacento per una proteina ideale contenente la quantità di aa in Tabella

65 Le proteine del grano hanno una qualità piuttosto bassa, sia come profilo aminoacidico che come assimilazione. Questo perché il profilo amminoacidico delle proteine del grano è abbastanza diverso da quello delle proteine umane, in particolare è carente di lisina, l'amminoacido limitante delle proteine di tutti i cereali, frumento incluso. Questo, si badi bene, non significa che le proteine del grano non vengono assimilate, ma semplicemente che su 100 g di proteine, ne vengono utilizzate a scopo plastico solo una parte (circa la metà). Le proteine dei cereali possono essere complementate con quelle dei legumi, in proporzione 1:1, ottenendo una proteina di qualità comparabile a quella della carne. Infatti l'aminoacido limitante delle proteine dei legumi è la metionina, di cui al contrario i cereali sono ricchi; e viceversa i legumi sono ricchi di lisina, che come abbiamo visto è carente nei cereali. Per ottenere un pasto 100% vegetale ma ricco di proteine di elevata qualità, basta associare una quantità di legumi e prodotti a base di grano tale per cui il contenuto di proteine dell'uno e dell'altro alimento siano equivalenti.